Protokolümüz metastatik kolonizasyon ve büyüme de herhangi bir aday genin rolünü hızlı ve kolay bir şekilde test etmek için kullanılabilir. Protokol aynı zamanda metastaz, oluşum ve büyümenin gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve aynı hayvanlarda metastaz sayısı nın ve büyüklüğünün rezeksiyon veya histolojik boyamaya gerek kalmadan ölçülmesine olanak sağlar. Plaka dört T1 hücreleri 150, 000 hücreleri iyi başına 12-iyi plaka tam büyüme ortamı.
Bir gecede 37 santigrat derecede %5 karbondioksit le kuluçkaya yat. Ertesi gün, hücrelerden büyüme ortamı aspire. Aynı anda hem luciferase ve floresan protein viral supernatants ile hücreleri enfekte etmek için luciferase viral supernatant ve floresan protein viral supernatant 500 mikrolitre ekleyin.
Daha sonra, mililitre hekaksimethrine bromür başına sekiz miligram bir mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 24 ila 48 saat için kuluçka. Dört T1 hücresini 500 mikrolitre tripsin ile deneyin. İki ila beş dakika sonra, seçim medya dört mililitre içinde altı santimetre lik bir çanak için tüm hücreleri aktarın, bu nedenle trippsin söndürme.
Seçim tamamlandıktan sonra, enfekte dört T1 hücreleri 50 ila 100 kez büyütme bir ters floresan mikroskop kullanarak ZsGreen floresan protein ifade olduğunu onaylayın. Ayrıca enfekte dört T1 hücreleri bir ticari luciferase aktivite kiti kullanarak luciferase ifade olduğunu onaylayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi in vivo deneysel tasarımın optimizasyonunu gerçekleştirmeye devam edin.
Ortamı aspire edin ve hücre plakalarını 1X PBS ile durula. Hücreleri 15 santimetre lik plaka başına beş mililitre tripsin ile 2-5 dakika boyunca deneyin ve tüm hücreleri konik bir tüpe aktarın. Tripsini söndürmek için yeterli tam büyüme ortamı ile doku kültürü çanak kalan hücreleri yıkayın.
Yıkamayı aynı konik tüpe ekleyin. Toplam hücre sayısını belirlemek için otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri say. Daha sonra hücreleri 122 kez G'de üç dakika santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.
İstenilen konsantrasyonda 1X PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. Burada, her fareye 25.000 hücre ve 100 mikrolitre PBS enjekte ediliyor. Yani yeniden askıya alınan hücreler mililitrebaşına 250.000 hücrede.
İğne yenene kadar hücre süspansiyonlarını buzda tutun. Hayvan tesisinde bir başlık içinde çalışan, yavaşça ama iyice tüp ters veya tek bir mililitre şırınga kullanarak eşit olarak yeniden askıya olduğundan emin olmak için hücreleri karıştırın. Şimdi, hücre süspansiyonu ile bir mililitre Luer Lock şırınga yükleyin ve aşırı hava kabarcıkları sınırdışı.
Yarım inç 30 gauge iğne yiyiş yukarı ve hava kabarcıkları dışarı ile şırınga yerleştirin. Fareyi nazikçe bir kemirgen dizginleyiciye yerleştirin. Lateral kuyruk damarı görünür ve genişlemiş olmalıdır.
Değilse, yavaşça kuyruk tabanı çimdik ve damarları dilate için sıcak musluk suyuna kuyruk daldırma. Kuyruk temizlemek için bir alkol silme kullanın, sonra kuyruk damar içine iğne eklemek, yukarı eğimli tarafı, ve hücre süspansiyon 100 mikrolitre enjekte. İğne damara düzgün bir şekilde yerleştirilirse, kolayca ileri ve geri kaydırmalı ve piston itildiğinde direnç olmamalıdır.
Başarılı enjeksiyonlar da hangi ven mavi renk enjeksiyondan sonra birkaç saniye için beyaz döner bir floş neden olmalıdır. Yavaş yavaş iğne kaldırmak ve steril bir gazlı bez kullanarak, herhangi bir kanamayı durdurmak için enjeksiyon bölgesine basınç uygulayın. Tam iyileşmesağlamak için fareyi kafesine ve monitöre 15 dakika döndürün.
In vivo canlı hayvan görüntüleme cihazını açın, görüntü yazılımını açın ve oturum açın. Başlatma düğmesini tıklatın ve makinenin başlatılmasını bekleyin. Görünüm alanını D.İlk kez kullanım için değiştirin, düzenleme, tercihler, edinim ve otomatik pozlama'yı tıklatarak pozlama ayarlarını düzenlemeyi tıklatın.
Varsayılan 60 saniyeden 300 saniyeye maksimum pozlama süresini değiştirin ve tamam'ı tıklatın. D-luciferin ile bir mililitreşşü yükle, sonra şırınga için yarım inç 30 gauge iğne ekleyin ve hava kabarcıkları kovmak. Anestezili farenin kütlesini ölçün ve kaydedin.
Başparmak ve işaretçi parmaklarını kullanarak boynun ensesini çimdikleyerek ve serçe parmağın ve elin tabanı arasındaki kuyruğu kavrayarak fareyi dizginle. Fareyi 45 derecelik bir açıyla ters çevirin ve başı aşağıya doğru işaret edin. İğneyi, eğimli tarafı yukarı, farenin sol tarafındaki IP boşluğuna yerleştirin.
Küçük bir hacim çizerek IP alanına girişi onaylayın. IP alanında geri çekerken iğnenin tabanında renk olmamalıdır. Kilogram başına 150 miligram doz için Uygun D-luciferin hacmini enjekte edin.
D-luciferin yönetiminden hemen sonra, bir zamanlayıcı başlatın. Fareyi burun konisinde burnu olan görüntüleme cihazında sırtüstü yerleştirin ve yüzde bir buçuk isofluran uygulandığından emin olun. Parlak ve fotoğraf kutuları tıklatın.
Pozlama süresini otomatik olarak değiştirin ve ardından edinme denetim panelinde edinme'yi tıklatın. Görüntülemeden sonra, tam iyileşmesağlamak için fareyi kafesine ve monitöre 15 dakika döndürün. Ötenaziden sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi, fazla kanı çıkarmak için her fareden akciğerleri izole edin ve 1X PBS ile durulayın.
Bir GFP geniş bant filtresi ile floresan stereoskop kullanarak Brightfield ve floresan 10X de loblarda ZsGreen metastaz görüntüleri edinin. Görüntülerdeki metastazların boyutunu ve sayısını ölçmek için görüntü analizi yazılımını kullanın. In vivo live animal imaging cihazı ile elde edilen görüntülerden elde edilen verileri işlemek ve analiz etmek için, görüntü yazılımındaki her fare için tüm görüntü dosyalarını açın.
Ünitelerin, görüntü penceresinin sol üst kısmındaki oku tıklatArak ve uygun birime değiştirerek, floresan veriler için biyolüminesans veri ve verimlilik açısından parlaklıkta olduğundan emin olun. Araç paleti penceresindeki Yatırım Getirisi araçlarını ilk tıklatarak ilgi çekici bir bölge veya YG oluşturmak için son zaman noktasındaki görüntüyü kullanın. Ardından, oku tıklatıp bir tane sini seçerek bir yg' ekleyin.
YG'nin kenarlığı'nı tıklatın ve farenin göğsüne taşıyın. Farenin göğsünü kaplayabilmesi ve sinyali dışlamaması için YG'nin boyutunu ayarlayın. Ardından, ROI'ları ölçün ve ham sayıyı bir Excel sayfasına kopyalayın veya yazın.
Metin protokolünde açıklandığı gibi verileri çizin ve analiz edin. YG'yi kopyalamak için resim dosyasına sağ tıklayın, ardından diğer zaman noktalarından resim dosyalarına yapıştırın ve ÖLÇÜM ROI'larını tıklatın. Hem YAP hem de TAZ'ı hedefleyen miR-30 tabanlı shRNA'ları ifade eden retroviral vektör, dört T1 hücrede YAP ve vergi protein ekspresyonu ve transkripsiyonel aktiviteyi azaltır.
Dört T1 luciferase hücresi, bu tandem YAP/TAZ shRNA vektörünün veya kontrollü miR-30 tabanlı shRNA'nın ZsGreen ekspresversiyonu ile birlikte transe geçirildi. Biyolüminesans görüntüler, kontrol hücreleri enjekte edilen farelerde yap/TAZ nakavt hücrelerine enjekte edilen farelere kıyasla metastatik yükün artma hızının önemli ölçüde daha hızlı olduğunu göstermektedir. Deney boyunca her fare için ölçülen log10 dönüştürülmüş luciferase sinyalinin bir çizimi, KONTROL hücreleri ile enjekte edilen farelerde YAP/TAZ nakavt hücrelerine enjekte edilen farelere kıyasla oranın daha hızlı olduğunu da göstermektedir.
YAP/TAZ nakavt hücrelerine enjekte edilen farelerde elle sayıldığında kontrol hücreleri olan farelere göre önemli ölçüde daha az metastaz oluşmuştur. Aynı eğilim görüntü analizi yazılımı kullanırken gözlendi. Sadece kontrol farelerde çok daha fazla metastaz formu yaptı, ama genellikle daha büyüktü.
Sürekli olarak, akciğerlerdeki metastatik yük de YAP/TAZ'ın yıkılması ile büyük ölçüde azaltıldı. Yüksek kaliteli veri sağlamak için her fareye eşit sayıda sağlıklı hücrenin başarılı bir şekilde enjekte edilmesini sağlamak çok önemlidir. Özellikle virüsler insan bulaşıcıise, bulaşıcı retrovirüsler ve lentivirüslerle çalışırken dikkatli olmayı ve güvenlik yönergelerine uymayı unutmayın.
Bu teknik bize aday genler ve metastatik kolonizasyon ve büyüme rollerini göstermek için izin verdi, tanımlamak ve metastatik hastalığın tedavisi için yeni terapötik hedefleri test etmek için bir yol sağlayan. Bu prosedürü takiben, akciğerleri içeren metastazlar, değiştirilmiş genin metastazları nasıl etkilediğini araştırmak ve dahil olabilecek diğer proteinleri belirlemek için immünfloresans veya histolojik boyama ile daha fazla analiz edilebilir.
