DNA metilasyon en çok çalışılan epigenetik imzalardan biridir. Birçok kanser DNA metilasyon düzeylerinde değişiklikler ile karakterizedir, hangi anormal gen ekspresyonu ve diğer genomik anormallikler ile ilişkilidir. Uzun serpiştirilmiş nükleer elementler, normalde yüksek metilasyon seviyelerine sahip tekrarlayan transpoze genomik dizilerdir.
Ancak, genellikle kanserde hipermethylated olur, onların aktivasyonu neden ve kromozomal istikrarsızlık yol açar. Bu çalışmada, kanser EVs MECs LINE-1 metilasyon etkileyebilir olup olmadığını görmek için osteosarkom türetilmiş ekstrasellüler ile mezenkimal kök hücreleri tedavi. Memeli hücre kültürü ortamının ayrılmaz bir bileşeni olan fetal büyükbaş serum, çok sayıda büyükbaş kaynaklı EV içerir.
Bu Evs bizim ilgi hücrelerinden Evs analizi ile müdahale edecek, bu nedenle, EV izolasyon için büyüyen hücreler, EV tükenmiş FBS kullanmak önemlidir. Ultracentrifuge tüpler fbs alın ve ultracentrifuge kova yerleştirin. Kovaları sallanan bir rotora yüklemeden önce birbirinin 10 miligramı kadar dengeleyin.
Rotoru ultracentrifuge'a yerleştirin ve 100,000 G'de 19 saat boyunca dört santigrat derecede çalıştırın. Çalışmadan sonra, dikkatle supernatant açık renkli üst tabakası toplamak ve 50 mililitrelik bir tüp aktarın. FBS'den evs içerdiğinden koyu kahverengi peleti rahatsız etmeyin veya boruyla titretmeyin.
Supernatant'ı 0,22 mikron filtreden yeni bir 50 mililitrelik tüpe geçirin. Bu filtre sterilize, EV-tükenmiş FBS şimdi EV izolasyon u için hücreleri büyürken hücre kültürü ortama eklenebilir. EV-tükenmiş ortamda yetiştirilen osteosarkom hücrelerinden koşullandırılmış ortam toplamak.
Hücreleri ve hücre enkazını temizlemek için, şartlandırılmış ortamı 2500 G'de 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüj edin. Supernatant'ı ultracentrifuge tüplere aktarın ve daha önce olduğu gibi dengeleyin. Tüpleri 100, 000 G'de iki saat boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin.
Dikkatle alt kısmında bir mililitre etrafında bırakarak supernatant atın. EV peletini yıkamak ve yeniden askıya almak için boruya yaklaşık 20 mililitre PBS ekleyin ve hafifçe pipet. Tüpleri dengeleyin ve aynı ayarlarla başka bir ultracentrifugation turu gerçekleştirin.
Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve 200 mikrolitre PBS'de NAZIK pipetleme ile EV peletini yeniden askıya alın. EVs'leri düşük bağlayıcı tüplerde saklayın. Saflaştırılmış EVs batı lekeleme, nanopartikül izleme analizi ve iletim elektron mikroskopisi ile karakterizedir.
Plaka 15, 000 MSCs iyi bir 24 kuyu plaka başına. 24 saat sonra, eski ortamları çıkarın, hücreleri PBS ile yıkayın ve EV'in tüketen ortamına değiştirin. Hücreleri planlanan saat noktalarında OS-EV'lerle tedavi edin.
EV tedavisini durdurduktan sonra, uygun bir yöntem kullanarak hücrelerden DNA ayıklayın. Metilasyon analizi için, özel yapım metilasyona özgü prob amplifikasyon yöntemi kullandık. Pavicic ve diğerleri tarafından daha önce yapıldığı gibi özelleştirilmiş LINE-1 problarını tasarla.
Metilasyon probları için, organizatör bölgesi içindeki HhaI kısıtlama bölgesini içeren üç dizi seçin. Kontrol sondaları için LINE-1 dizisinin geri kalanından HhaI kısıtlama alanı olmayan yedi dizi seçin. TE tamponundaki 70 nanogram DNA örneğini beş mikrolitreye seyreltin.
Örnekleri 98 derecede 10 dakika ısıtın ve ardından 25 santigrat dereceye kadar soğutun. Her numuneye üç mikrolitre prob hibridizasyon karışımı ekleyin ve probların DNA ile melezlemesi için termocycler çalıştırın. Oda sıcaklığında, her numuneye 30 mikrolitre hibritleştirme sonrası karışımı ekleyin.
İkinci bir tüpe 10 mikrolitre aktarın. Her iki tüp setini de termocycler'a yerleştirin ve en az bir dakika boyunca 48 derecede kuluçkaya yatırın. Numuneler 48 santigrat derecede yken, ilk tüp setine 10 mikrolitre ligasyon karışımı ve ikinci tüp setine 10 mikrolitre ligasyon-sindirim karışımı ekleyin.
Bir sonraki termocylcer programını çalıştırın. Daha sonra tüpleri aşağı doğru çevirin ve termocycler'ı aynı anda 72 santigrat dereceye ayarlayın. Her tüpe beş mikrolitre polimeraz karışımı ekleyin ve tüpleri termocycler'a yerleştirin.
PCR programını çalıştırın. PCR programı çalışırken, 2,5 mikrolitre boyut standardı içeren bir mililitre formamid çözeltisi hazırlayın. Bir optik 96 kuyu plaka her satır için bu çözeltinin Pipet 10 mikrolitre.
PCR'den sonra, sindirilmemiş ve sindirilmiş numuneleri ultra saf suda sırasıyla 1'den 1'e 200'e seyreltin. 96 kuyu plakasına iki mikrolitre seyreltilmiş PCR ürün ekleyin. Hava kabarcıklarını temizlemek için plakayı 200 G'de 15 ila 20 saniye santrifüj edin.
Kapiller elektroforez ile numunelerin parça analizini yapın. Bir elektroferogram analiz yazılımı ile kapiller elektroforez sonuçlarını açın. Bir örnek seçin ve menüden paneli MLPA olarak ayarlayın.
Bu ayarı tüm örneklere uygulamak için panele tıklayın ve D denetimine basın. Benzer şekilde, analiz yöntemini tüm numuneler için mikrouydu varsayılanı olarak ayarlayın. Tüm örnekleri seçin ve analizi çalıştırmak için yeşil play düğmesine tıklayın, sonra tüm örnekleri seçin ve sonda zirveleri görselleştirmek için grafik düğmesine tıklayın.
Tek tek zirvelerin daha yüksek çözünürlüğü için en yüksek bölgeyi yakınlaştırın. LINE-1 prob karışımındaki problara karşılık gelen 10 tepenin tamamının etiketlenmiş olduğundan emin olun. Genotipler sekmesinde, sonuçları CSV biçiminde dışa aktarın.
CSV dosyasını bir veri analizi yazılımında açın ve verileri sütunlara sıralayın. Üç metilasyon alanı tepenoktalarını boyutlarına göre etiketle. Geri kalan yedi tepe kontrol sondalarına karşılık gelir.
Burada yaklaşık 117 baz çifti boyutuna sahip LINE-1 2M prob zirveleri kullanıyoruz. Her örnek için, yedi denetim tepe noktasının toplam tepe alanını hesaplayın. Her LINE-1 sondasının en yüksek alanını bu toplama bölün.
Her örnek için, metilasyon dozaj oranını elde etmek için sindirilmemiş numunenin değeri ne kadar sindirilmiş numuneye bölün. Batı lekeleme analizi, TSG101, HSP70 ve CD63 için gözlenen sinyallerile OS-EVs varlığını doğruladı. Kalneksin sinyalinin yokluğu EV örneğinin saf olduğunu gösterdi.
OS-EV örneğinde bulunan çeşitli boyutlarda bozulmamış veziküller ile TEM ile ek saflık göstergesi gözlenmiştir. OS-EV parçacık konsantrasyonu ve boyut dağılımı NTA ile ölçüldü. EV'lerin %80'i 50 ila 200 nanometre arasındaydı.
Burada EV tedavisinin farklı zaman noktalarında MSCs LINE-1 metilasyon doz oranları görebilirsiniz. Gri çizgi, sıfır noktasından temel metilasyon düzeyini temsil eder. Üçüncü noktada, EVs'nin uygulanmasından sonra ortalama metilasyon dozaj oranında bir azalma vardır ve bu da hipermetilasyon gösterir.
EVs bu hipermetilasyon etkisi zaman yedi noktada daha az belirgindir. Burada metilasyon analizi için basit, son derece hassas ve sağlam bir teknik gösterdik. Bisülfit dönüşümü olmayan düşük miktarda DNA gerektirir ve parafinle gömülü örneklerden izole edilmiş DNA için de uygundur.
Tüm yöntem, deneysel ve analitik parçalar ile, yaklaşık iki gün sürer. Genomdaki LINE-1 kopya sayısının yüksek olması nedeniyle, LINE-1'in temel metilasyonları normal numunelerde yüksektir. Bu nedenle, bu yöntemde gözlendiği gibi, numunelerin metilasyon düzeylerindeki farklılıklar ince olabilir.
