A metilação de DNA é uma das assinaturas epigenéticas mais estudadas. Muitos cânceres são caracterizados por mudanças nos níveis de metilação do DNA, que estão associados à expressão genética aberrante e outras anormalidades genômicas. Longos elementos nucleares intercalados são sequências genômicas transpossíveis repetitivas que normalmente têm altos níveis de metilação.
No entanto, muitas vezes eles se tornam hipermetilados no câncer, o que resulta em sua ativação e leva à instabilidade cromossômica. Neste estudo, tratamos células-tronco mesenquimais com vesículas extracelulares derivadas de osteossarcoma para ver se os EVs de câncer podem afetar a metilação LINE-1 em MECs. O soro bovino fetal, que é um componente integral da mídia de cultura celular de mamíferos, contém um grande número de EVs derivados de bovinos.
Estes Evs interferirão na análise de Evs a partir de células de nosso interesse, portanto, quando as células de crescimento para o isolamento de EV, é importante usar FBS esgotados pelo EV. Pegue FBS em tubos ultracentrífugas e coloque-os em baldes ultracentrífugas. Equilibre os baldes para dentro de 10 miligramas um do outro antes de carregá-los em um rotor balançando.
Coloque o rotor no ultracentrifuuge e corra a 100.000 G durante 19 horas a quatro graus Celsius. Após a corrida, colete cuidadosamente a camada superior de cor clara do supernasal e transfira-a para um tubo de 50 mililitros. Não perturbe ou encoresta a pelota marrom escura, pois contém EVs da FBS.
Passe o supernante através de um filtro de 0,22 míclica em um novo tubo de 50 mililitros. Este FBS esterilizado por filtro, esgotado por EV, agora pode ser adicionado aos meios de cultura celular ao cultivar células para o isolamento de EV. Coletar mídia condicionada de células osteossarcoma cultivadas em mídia esgotada pelo EV.
Para remover células e detritos celulares, centrifugar a mídia condicionada a 2500 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernatante para tubos ultracentrífugas e equilibre-os como anteriormente. Centrifugar os tubos a 100.000 G por duas horas a quatro graus Celsius.
Descarte cuidadosamente o supernatante deixando em torno de um mililitro na parte inferior. Adicione cerca de 20 mililitros de PBS ao tubo e cano suavemente, a fim de lavar e suspender a pelota EV. Equilibre os tubos e realize outra rodada de ultracentrifugação com as mesmas configurações.
Remova cuidadosamente o supernascer e suspenda a pelota EV em 200 microliters de PBS por tubulação suave. Armazene os EVs em tubos de baixa ligação. Os EVs purificados são caracterizados por manchas ocidentais, análise de rastreamento de nanopartículas e microscopia eletrônica de transmissão.
Placa 15.000 MSCs por poço em uma placa de 24 poços. Após 24 horas, remova a mídia antiga, lave as células com PBS e mude para mídia esgotada pelo EV. Trate as células com OS-EVs nos pontos de hora programados.
Depois de parar o tratamento de EV, extraia DNA das células usando um método apropriado. Para análise de metilação, utilizamos um método de amplificação de sonda específico para metilação feito sob medida. Projete as sondas LINE-1 personalizadas, como feito anteriormente, pela Pavicic e outras.
Para sondas de metilação, selecione três sequências contendo o local de restrição hhaI dentro da região do promotor. Para testes de controle, selecione sete sequências sem o local de restrição HhaI do resto da sequência LINE-1. Diluir 70 nanogramas de amostra de DNA no buffer te para cinco microliters.
Aqueça as amostras por 10 minutos a 98 graus Celsius e esfrie até 25 graus Celsius. Adicione três microliters de mistura de hibridização da sonda a cada amostra e execute o termociclador para permitir que as sondas hibridizem ao DNA. À temperatura ambiente, adicione 30 microliters de mistura pós-hibridização a cada amostra.
Transfira 10 microliters para um segundo tubo. Coloque ambos os conjuntos de tubos no termociclador e incubar a 48 graus Celsius por pelo menos um minuto. Enquanto as amostras estão a 48 graus Celsius, adicione 10 microliters de mistura de ligadura ao primeiro conjunto de tubos e 10 microliters de mistura de ligadura-digestão ao segundo conjunto de tubos.
Execute o próximo programa termociclcer. Em seguida, gire os tubos e, simultaneamente, coloque o termociclador a 72 graus Celsius. Adicione cinco microliters de mistura de polimerase a cada tubo e coloque os tubos no termociclador.
Execute o programa PCR. Enquanto o programa PCR estiver em execução, prepare uma solução de uma formamida mililitro contendo 2,5 microliters de tamanho padrão. Pipet 10 microliters desta solução para cada linha de uma placa óptica de 96 poços.
Após pcr, diluir as amostras não digeridas e digeridas para um a cento e um a duzentos, respectivamente em água ultra pura. Adicione dois microliters de produto PCR diluído à placa de 96 poços. Centrifugar a placa a 200 G por 15 a 20 segundos para remover bolhas de ar.
Realizar a análise de fragmentos de amostras por eletroforese capilar. Abrir a eletroforese capilar resulta em um software de análise de eletroferógrama. Selecione uma amostra e defina o painel para MLPA no menu.
Clique no painel e pressione o controle D para aplicar esta configuração em todas as amostras. Da mesma forma, defina o método de análise como padrão de microsatélite para todas as amostras. Selecione todas as amostras e clique no botão de reprodução verde para executar a análise e selecione todas as amostras e clique no botão gráfico para visualizar os picos da sonda.
Aproxime-se da região de pico para uma maior resolução dos picos individuais. Certifique-se de que todos os 10 picos correspondentes aos testes da mistura de sonda LINE-1 estejam rotulados. Na guia genótipos, exporte os resultados no formato CSV.
Abra o arquivo CSV em um software de análise de dados e classifique os dados em colunas. Rotule os três picos do local de metilação com base em seus tamanhos. Os sete picos restantes correspondem às sondas de controle.
Aqui estamos usando os picos da sonda LINE-1 2M que têm um tamanho de aproximadamente 117 pares de base. Para cada amostra, calcule a área de pico de soma de todos os sete picos de controle. Divida a área de pico de cada sonda LINE-1 por esta soma.
Para cada amostra, divida o valor da amostra digerida pela amostra não digerida para obter a razão de dosagem de metilação. A análise de manchas ocidentais confirmou a presença de OS-EVs com sinais observados para TSG101, HSP70 e CD63. A ausência de sinal de calnexin indicou que a amostra de EV era pura.
Foi observada indicação adicional de pureza com TEM com vesículas intactas de vários tamanhos presentes na amostra os-EV. A concentração de partículas e distribuição de tamanho do OS-EV foi medida pela NTA. 80% dos EVs estavam na faixa de tamanho de 50 a 200 nanômetros.
Aqui podemos ver as razões de dosagem de metilação de LINE-1 de MSCs em diferentes pontos de tempo do tratamento EV. A linha cinza representa o nível de metilação da linha de base a partir do ponto zero do tempo. No ponto três, há uma diminuição na relação média de dosagem de metilação após a administração de EVs, indicando assim hipermetilação.
Este efeito de hipermetilação dos EVs é menos pronunciado no ponto sete do tempo. Aqui mostramos uma técnica simples, altamente sensível e robusta para análise de metilação. Requer uma baixa quantidade de DNA sem conversão de bisullfita envolvida e também é adequado para DNA isolado de amostras incorporadas à parafina.
Todo o método, com as partes experimentais e analíticas, leva cerca de dois dias. Devido a um alto número de cópias de LINE-1 no genoma, a metilação de linha de base de LINE-1 é alta em amostras normais. Portanto, as diferenças nos níveis de metilação das amostras, como observado com este método, podem ser sutis.
