La metilazione del DNA è una delle firme epigenetiche più studiate. Molti tumori sono caratterizzati da cambiamenti nei livelli di metilazione del DNA, che sono associati all'espressione genica aberrante e ad altre anomalie genomiche. Lunghi elementi nucleari intervallati sono sequenze genomiche trasponibili ripetitive che normalmente hanno alti livelli di metilazione.
Tuttavia, spesso diventano ipermetilati nel cancro, che si traducono nella loro attivazione e portano all'instabilità cromosomica. In questo studio, abbiamo trattato le cellule staminali mesenchimali con vescicole extracellulari derivate dall'osteosarcoma per vedere se i veicoli elettrici contro il cancro possono influenzare la metilazione LINE-1 nei MEC. Il siero bovino fetale, che è parte integrante dei mezzi di coltura cellulare dei mammiferi, contiene un gran numero di veicoli elettrici di origine bovina.
Questi Ev interferiranno con l'analisi degli Ev da cellule di nostro interesse, quindi, quando si coltivano cellule per l'isolamento dell'EV, è importante utilizzare FBS impoverito da veicoli elettrici. Prendi FBS in tubi ultracentrifuge e posizionali in secchi ultracentrifugo. Bilanciare le benne entro 10 milligrammi l'una dall'altra prima di caricarle su un rotore oscillante.
Posizionare il rotore nell'ultracentrifugo e correre a 100.000 G per 19 ore a quattro gradi Celsius. Dopo la corsa, raccogliere attentamente lo strato superiore di colore chiaro del supernatante e trasferirlo in un tubo da 50 millilitri. Non disturbare o pipettare il pellet marrone scuro in quanto contiene veicoli elettrici di FBS.
Passare il supernatante attraverso un filtro da 0,22 micron in un nuovo tubo da 50 millilitri. Questo FBS sterilizzato con filtro e impoverito di veicoli elettrici può ora essere aggiunto ai mezzi di coltura cellulare quando si coltivano cellule per l'isolamento dell'EV. Raccogliere supporti condizionati da cellule osteosarcoma coltivate in mezzi esauriti dall'EV.
Per rimuovere cellule e detriti cellulari, centrifugare il supporto condizionato a 2500 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante in tubi ultracentrifugo e bilanciarli come prima. Centrifuga i tubi a 100.000 G per due ore a quattro gradi Celsius.
Scartare con cura il supernatante lasciando circa un millilitro sul fondo. Aggiungere circa 20 millilitri di PBS al tubo e pipettare delicatamente per lavare e sospendere di nuovo il pellet EV. Bilanciare i tubi ed eseguire un altro giro di ultracentrifugazione con le stesse impostazioni.
Rimuovere con cura il supernatante e sospendere di nuovo il pellet EV in 200 microlitri di PBS mediante pipettazione delicata. Conservare i veicoli elettrici in tubi a bassa legatura. I veicoli elettrici purificati sono caratterizzati da gonfiore occidentale, analisi di tracciamento delle nanoparticelle e microscopia elettronica a trasmissione.
Piastra 15.000 CBC per pozzo in una piastra da 24 pota. Dopo 24 ore, rimuovere i vecchi supporti, lavare le cellule con PBS e passare a supporti esauriti con EV. Trattare le celle con OS-EV nei punti di tempo pianificati.
Dopo aver interrotto il trattamento con EV, estrarre il DNA dalle cellule utilizzando un metodo appropriato. Per l'analisi della metilazione, abbiamo utilizzato un metodo di amplificazione della sonda specifico per la metilazione su misura. Progetta le sonde LINE-1 personalizzate, come fatto in precedenza, da Pavicic e altri.
Per le sonde di metilazione, selezionare tre sequenze contenenti il sito di restrizione HhaI all'interno dell'area promotore. Per le sonde di controllo, selezionare sette sequenze prive del sito di restrizione HhaI dal resto della sequenza LINE-1. Diluire 70 nanogrammi di campione di DNA nel tampone TE a cinque microlitri.
Riscaldare i campioni per 10 minuti a 98 gradi Celsius, quindi raffreddare a 25 gradi Celsius. Aggiungere tre microlitri di miscela di ibridazione della sonda a ciascun campione ed eseguire il termociclo per consentire alle sonde di ibridarsi al DNA. A temperatura ambiente, aggiungere 30 microlitri di mix post-ibridazione a ciascun campione.
Trasferire 10 microlitri in un secondo tubo. Posizionare entrambi i set di tubi nel termociclo e incubare a 48 gradi Celsius per almeno un minuto. Mentre i campioni sono a 48 gradi Celsius, aggiungere 10 microlitri di miscela di legatura al primo set di tubi e 10 microlitri di miscela legatura-digestione al secondo set di tubi.
Esegui il prossimo programma termocilcer. Quindi, spin giù per i tubi e contemporaneamente impostare il termociclometro a 72 gradi Celsius. Aggiungere cinque microlitri di miscela di polimerasi a ciascun tubo e posizionare i tubi nel termociclo.
Eseguire il programma PCR. Mentre il programma PCR è in esecuzione, preparare una soluzione di una formamide millilitro contenente 2,5 microlitri di dimensioni standard. Pipet 10 microlitri di questa soluzione ad ogni fila di una piastra ottica da 96 pozzi.
Dopo la PCR, diluire i campioni non digeriti e digeriti da uno a centonove a duecento, rispettivamente in acqua ultra pura. Aggiungere due microlitri di prodotto PCR diluito alla piastra del pozzo 96. Centrifugare la piastra a 200 G per 15-20 secondi per rimuovere le bolle d'aria.
Effettuare l'analisi dei frammenti di campioni per elettroforesi capillare. L'apertura dell'elettroforesi capillare si traduce in un software di analisi dell'elettroferogramma. Selezionate un campione e impostate il pannello su MLPA dal menu.
Fare clic sul pannello e premere il controllo D per applicare questa impostazione a tutti i campioni. Analogamente, impostare il metodo di analisi su microsatellite default per tutti i campioni. Selezionare tutti i campioni e fare clic sul pulsante di riproduzione verde per eseguire l'analisi, quindi selezionare tutti i campioni e fare clic sul pulsante del grafico per visualizzare i picchi della sonda.
Ingrandire l'area di picco per una risoluzione più elevata dei singoli picchi. Assicurarsi che tutti i 10 picchi corrispondenti alle sonde della miscela di sonde LINE-1 siano etichettati. Nella scheda genotipi esportare i risultati nel formato CSV.
Aprire il file CSV in un software di analisi dei dati e ordinare i dati in colonne. Etichettare i tre picchi del sito di metilazione in base alle loro dimensioni. I restanti sette picchi corrispondono alle sonde di controllo.
Qui stiamo usando i picchi della sonda LINE-1 2M che hanno una dimensione di circa 117 coppie di basi. Per ogni campione, calcolare l'area di picco della somma di tutti e sette i picchi di controllo. Dividere l'area di picco di ogni sonda LINE-1 per questa somma.
Per ciascun campione, dividere il valore del campione digerito per quello del campione non digerito per ottenere il rapporto di dosaggio della metilazione. L'analisi western del gonfiore ha confermato la presenza di OS-EV con segnali osservati per TSG101, HSP70 e CD63. L'assenza di segnale di calnexina indicava che il campione di veicoli elettrici era puro.
Ulteriori indicazioni di purezza sono state osservate con TEM con vescicole intatte di varie dimensioni presenti nel campione OS-EV. La concentrazione di particelle OS-EV e la distribuzione delle dimensioni sono state misurate dall'NTA. L'80% dei veicoli elettrici era di dimensioni da 50 a 200 nanometri.
Qui possiamo vedere i rapporti di dosaggio della metilazione di LINE-1 dai CBC in diversi punti di tempo del trattamento EV. La linea grigia rappresenta il livello di metilazione della linea di base dal punto di tempo zero. Al punto tre del tempo, c'è una diminuzione del rapporto medio di dosaggio della metilazione dopo la somministrazione di veicoli elettrici, indicando così l'ipermetilazione.
Questo effetto ipermetilante dei veicoli elettrici è meno pronunciato al punto di tempo sette. Qui abbiamo mostrato una tecnica semplice, altamente sensibile e robusta per l'analisi della metilazione. Richiede una bassa quantità di DNA senza conversione di bisolfito ed è adatto anche per dna isolato da campioni incorporati nella paraffina.
L'intero metodo, con le parti sperimentali e analitiche, dura circa due giorni. A causa di un elevato numero di copie di LINE-1 nel genoma, la metilazione di base di LINE-1 è alta nei campioni normali. Pertanto, le differenze nei livelli di metilazione dei campioni, osservate con questo metodo, possono essere sottili.
