DNA甲基化是研究最多的表观遗传特征之一。许多癌症的特点是DNA甲基化水平的变化，这与异常基因表达和其他基因组异常有关。长穿插核元素是重复的可转置基因组序列，通常具有高水平的甲基化。
然而，它们经常在癌症中变得高甲基化，导致它们的激活，并导致染色体不稳定性。在这项研究中，我们用骨肉瘤衍生的细胞外囊泡治疗间质干细胞，看看癌症 EV 是否会影响 MEC 中的 LINE-1 甲基化。胎儿牛血清是哺乳动物细胞培养基的一个组成部分，含有大量的牛源性电动汽车。
这些 Evs 会干扰我们感兴趣的细胞对 Evs 的分析，因此，当生长用于 EV 隔离的细胞时，使用 EV 耗尽的 FBS 非常重要。将 FBS 放在超离心管中，并将它们放在超离心铲斗中。在将铲斗装入摆动转子之前，将铲斗平衡到 10 毫克内。
将转子放在超中心，在10万G下运行19小时，温度为4摄氏度。运行后，小心地收集上清液的浅色上层，并转移到50毫升管。请勿打扰或移液深棕色颗粒，因为它含有来自 FBS 的 EV。
通过 0.22 微米过滤器将上清液进入新的 50 毫升管中。这种过滤灭菌，EV耗尽的FBS现在可以添加到细胞培养时，生长细胞的EV隔离。从EV耗竭介质中生长的骨肉瘤细胞中收集条件介质。
为了去除细胞和细胞碎片，在摄氏4度时将调节介质在2500 G下离心20分钟。将上流液转移到超离心管中，并像之前一样平衡它们。在摄氏4度下将管子在10万G下离心两小时。
小心丢弃上清液，在底部留下约一毫升。将大约 20 毫升 PBS 加入管子中，轻轻移液，以便清洗和重新悬浮 EV 颗粒。平衡管子，并执行另一轮超离心与相同的设置。
小心地去除上清液，通过温和移液将 EV 颗粒重新悬浮在 200 微升 PBS 中。将 EV 存放在低结合管中。纯化电动汽车的特点是西方印迹、纳米粒子跟踪分析和传输电子显微镜。
24 井板中每井的板 15，000 MSC。24 小时后，取出旧介质，用 PBS 清洗细胞，然后更改为 EV 耗尽介质。在预定的时间点使用 OS-EV 处理细胞。
停止EV治疗后，使用适当的方法从细胞中提取DNA。对于甲基化分析，我们使用了定制的甲基化特异性探针放大方法。设计定制的 LINE-1 探头，如前所述，由帕维契奇和其他人完成。
对于甲基化探针，选择三个序列，其中包含启动子区域内的HhaI限制位点。对于控制探头，从 LINE-1 序列的其余部分中选择七个缺少 HhaI 限制站点的序列。将TE缓冲液中70纳米的DNA样本稀释至5微升。
在 98 摄氏度下加热样品 10 分钟，然后冷却至 25 摄氏度。在每个样品中添加三个探针杂交混合微升，然后运行热循环器，使探头与DNA杂交。在室温下，在每个样品中加入30微升杂交后混合。
将 10 微升转移到第二管。将两组管子放在热循环器中，并在 48 摄氏度下孵育至少一分钟。当样品在48摄氏度时，在第一组管子中加入10微升的结扎混合物，在第二组管子中加入10微升的结扎消化混合物。
运行下一个热电塞程序。然后，向下旋转管，同时将热循环器设置为 72 摄氏度。在每个管中加入五升聚合酶混合物，并将管放在热循环器中。
运行 PCR 程序。在 PCR 程序运行时，准备一毫升甲酰胺溶液，其中含有 2.5 微升尺寸标准。该解决方案的10微升管道，每排一排的光学96井板。
PCR后，将未消化的样品和消化的样品稀释到超纯水中，分别稀释为一到一百和一至两百。在 96 井板中加入两个稀释 PCR 产品的微升。在 200 G 下将板离心 15 至 20 秒，以清除气泡。
通过毛细管电泳对样品进行片段分析。打开毛细管电泳结果电图分析软件。选择一个示例，然后从菜单中将面板设置为 MLPA。
单击面板并按控件 D 将此设置应用于所有样本。以类似的方式，将分析方法设置为所有样本的微卫星默认值。选择所有样本并单击绿色播放按钮以运行分析，然后选择所有样本并单击图形按钮以可视化探头峰值。
放大峰值区域，获得单个峰值的更高分辨率。确保标记 LINE-1 探头组合中与探头对应的所有 10 个峰值。在基因型选项卡中，以 CSV 格式导出结果。
在数据分析软件中打开 CSV 文件，将数据排序为列。根据三个甲基化站点的峰值大小对它们进行标记。其余七个峰值对应于控制探头。
在这里，我们使用 LINE-1 2M 探针峰值，其大小约为 117 个基对。对于每个样本，计算所有七个控制峰值的总和峰值面积。将每个 LINE-1 探头的峰值区域除以此总和。
对于每个样品，将消化样品的值除以未消化样品的值，以获得甲基化剂量比。西方印迹分析证实存在具有 TSG101、HSP70 和 CD63 信号的 OS-EV。缺乏卡内辛信号表明EV样品是纯的。
使用 TEM 观察到额外的纯度指示，OS-EV 样品中存在各种尺寸的完整囊泡。通过NTA测量OS-EV颗粒浓度和大小分布。80% 的 EV 尺寸范围为 50 至 200 纳米。
在这里，我们可以看到从MSC在EV治疗的不同时间点的S线-1的甲基化剂量比。灰线表示时间点零的基线甲基化水平。在时间点三，给药后平均甲基化剂量率下降，从而表示甲基化。
EV 的这种超甲基化效应在时间点 7 时不太明显。在这里，我们展示了一种简单、高度敏感和稳健的甲基化分析技术。它需要少量的DNA，没有涉及双硫酸盐转化，它也适合从石蜡嵌入样品中分离的DNA。
整个方法，与实验和分析部分，需要大约两天。由于基因组中 LINE-1 的拷贝数很高，因此 LINE-1 的基线甲基化在正常样本中很高。因此，与这种方法观察的样品甲基化水平的差异可能是微妙的。
