Floresan antibiyotiklerin hazırlanması spektrofotometri ve mikroskopi gibi uygun analitik teknikler ile bakteriler içinde bu terapötik reaktiflerin lokalizasyonu nun değerlendirilmesine olanak sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı antibiyotik lokalizasyonunun kolaylıkla belirlenebildiğidir. Bu yerelleştirme efflux de dahil olmak üzere olayların bir dizi ilgilidir.
Tıklama bir reaksiyon prosedürü gerçekleştirmek için, yuvarlak bir alt şişe ilgi azide antibiyotik yerleştirin ve şişe azide milimole başına 25 mililitre tert-butanol ve 25 mililitre su ekleyin. Çözeltiye hazırlanan florofor alkyne'yi ekleyin ve reaksiyonu 50 santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra, şişeye 0,6 eşdeğer bakır sülfat ve 2,4 eşdeğeri askorbik asit ekleyin.
Reaksiyonu bir saat veya LCMS tarafından analiz edilene kadar karıştırın reaksiyonun tamamlaşAcağı belirtin. Sonra serin ve antibiyotik iskele için uygun olarak reaksiyon arındırın. Burada, siprofloksasin, linezolid ve trimetoprim bazlı bir azide ara ile ilgili antibiyotiklersentez yapı örnekleri ile floresan antibiyotik hazırlanması için anahtar tıklayın kimya reaksiyonu gösterilmiştir.
Bu sıvı kromatografi kütle spektrometresi bir siprofloksasin azide ve NBD alkine tıklama reaksiyonu izleri, azide 3.2 dakika ve ürün 3.8 dakika eluted edildi. Tıklama reaksiyonunun ilerlemesini azide tepenin kaybolması takip edebilir. Bu spektrumlarda, arınmanın etkisi hatalı zirvelerin kaybolması ile görselleştirilebilir.
Sentezlenen antibiyotik antimikrobiyal aktivitesini değerlendirmek için, LB agar plakaları üzerine antibiyotik iskele için uygun bakteriyel suşların çizgi gliserol stokları ve 37 santigrat derece bir gecede kültürleri büyümek. Ertesi sabah, her tabak ve kültür den tek bir koloni seçin koloniler bir gecede 37 santigrat derece kültür başına CAMHB beş mililitre. Ertesi gün, taze CAMHB kültürleri yaklaşık 40 kat seyreltmek ve 0.4 ve 0.8 arasında 600 nanometre bir optik yoğunluğu ile orta günlük fazbakteri büyümek.
Daha sonra, steril suda%20 dimetil sülfoksit mililitre başına 1,28 miligram her floresan antibiyotik stok çözümleri hazırlamak ve 96-iyi plaka ilk sütunun her kuyusu için antibiyotik 10 mikrolitre ekleyin. İlk sütunun her kuyusu için 90 mikrolitre CAMHB ve diğer tüm kuyulara 50 mikrolitre ekleyin. Sonra plaka üzerinde bir seri iki kat seyreltme gerçekleştirin.
Iyice karıştırdıktan sonra, orta log faz kültürlerini mililitre başına altıncı koloni oluşturan birimlere yaklaşık bir kez 10'a seyreltin ve her kültürün 50 mikrolitresini seyreltme kuyularına ekleyerek mililitrede beşinci koloni oluşturan ünitelere yaklaşık beş kat 10'luk son konsantrasyon elde edin. Tüm bakteriler kaplandığında, tabaklara kapaklar yerleştirin ve 18 ila 24 saat boyunca kültürleri 37 santigrat derecede titremeden kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, plakaları görsel olarak inceleyin.
Minimum inhibisyon konsantrasyonu görünür büyüme ile de en düşük konsantrasyon olacaktır. Sonda birikimi analizi için, 37 santigrat derece bir gecede kuluçka için LB agar plakaları üzerine bakteriyel suşların çizgi gliserol stokları. Ertesi sabah, 37 santigrat derece lysogeny suyu gece kültürü için plaka tek bir koloni seçin.
Ertesi sabah, taze ortamda yaklaşık 50 kat bir gecede kültürü seyreltin. Kültür orta log fazına ulaştığında, santrifüj ile bakteri pelet ve orta decant. PBS bir mililitre bakteri resuspend ve tekrar bakteri santrifüj.
Supernatant decant ve iki 600 nanometre bir optik yoğunluğu pbs yıkanmış pelet resuspend. PBS'de 10,1 mikrolitre 10 milimolar CCCP'yi bir mililitre bakteriye ekleyin ve bakterileri 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, santrifüj ile bakteri toplamak ve PBS 10 ila 100 mikromolar floresan antibiyotik çözeltisi bir mililitre pelet resuspend.
37 santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçkadan sonra, hücreleri yıkama başına bir mililitre soğuk PBS'de dört kez santrifüj le yıkayın. Yıkandıktan sonra bakterileri 180 mikrolitre lysis tamponu ve 70 mikrolitre likitme ile lyse. 37 santigrat derecede 30 dakika sonra, bakterileri sırasıyla 5 dakika ve 34 santigrat derece eksi 78 derecede üç kez dondurun-eritin.
Donma-erime son turdan sonra, 65 santigrat derece 30 dakikalık kuluçka ardından 20 dakika boyunca örnek sonicate. Kuluçka sonunda, santrifüj ile lysed örnek toplamak ve 10 kilodalton filtre membran ıslanması. Filtreyi yıkama başına 100 mikrolitre suyla dört kez yıkayın ve her biri siyah düz alt 96 kuyunun ayrı kuyularına yıkayın.
Daha sonra florofora uygun uyarma ve emisyon dalga boyları ile bir plaka okuyucuüzerinde floresan yoğunluğunu ölçün. Efflux varlığı ve yokluğunda floresan spektroskopi ile hücre içi birikiminin değerlendirilmesinden elde edilen bu tipik sonuçlar, cccp ile yapılan ön tedaviden sonra bakterilerin hücre içi floresansının bakterilerin içindeki birikimi azalttığını gösteren hücre içi floresansının önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermektedir. Gram pozitif ve Gram negatif bakterilerin bu temsili konfokal mikroskopi görüntülerinde, antibiyotiklerin bakteriler içinde lokalizasyonu CCCP tedavisinden sonra görselleştirilebilir.
CCCP eklenmediğinde bu olgu gözlenmez. Floresan antibiyotik kullanırken, hangi bilgileri toplamayı hedeflediğinize dikkat edin ve bu verileri elde ederken hangi protokolün en yararlı olacağını göz önünde bulundurun. Onların sentezini takiben, floresan antibiyotikler ilaç hedef etkileşimleri ve direnç değişiklikleri de dahil olmak üzere bakteriyel süreçlerin bir dizi çalışma için kullanılabilir.
