Bu araştırma NCI İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Usta Hisse 1. Hazırlanması <ol><li> DMSO içinde test edilecek olan bileşiklerin ana stokları olun. 20 mM&#39;lik bir konsantrasyonda standart stokları hazırlayın. Not: 10 mM üzerinde herhangi bir konsantrasyonu kullanılabilir. Bu analizi doğrulamak için pozitif kontrol olarak kullanılabilir bileşikler RAL, EVG ve DTG içerir. </li><li> Emin bileşikler 15 saniye için çözümler birden çok kez vorteks ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilerek DMSO içinde çözündürülür. Kullanılana kadar -20 ° C&#39;de karanlıkta, 20 mM stok çözelti saklayın. </li></ol> Bileşik elemesi için 96 oyuklu plakalar, 2. Hazırlanması <ol><li> Test edilecek olan hücre hattı (örneğin, HOS veya TZM-bl) seçin ve (ortam içinde (4000 hücre / göz) 4 x 10 4 hücre / ml bir yoğunlukta bu hücrelerin 100 ul tohum örneğin Dulbecco tadil edilmiş Eagle ya da DMEM ortamı % 5 (v / v) fetal sığır serumu,% 5 yeni doğmuş buzağı serumu ve penisilin (50 birim / ml) ile takviye edilmiş artı streptomycin). </li></ol> Virüs Hisse 3. Nesil 32-34 (Şekil 1, aşama 1 &#39;de gösterildiği gibi), 293 hücrelerinin transfekte edilmesiyle VSV-g-psödotipli HIV üretir. <ol><li> , Transfeksiyondan önce günde, 1.5 x 10 6 hücre yoğunluğunda olacak şekilde 100 mm&#39;lik çapı olan kaplara 293 hücreleri üzerinde plaka. </li><li> , Kalsiyum fosfat yöntemi kullanılarak 35 ve 4 VSV (pHCMV-g) ug - transfeksiyon gününde, 16 vahşi tipli ya da mutant HIV (ΔLUC pNLNgoMIVR) içinde 293 ug hücreleri transfekte. </li><li> Kalsiyum fosfat çökelti, yaklaşık 6 saat sonra, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez yıkama ve 293 hücreleri 48 saat süreyle taze ortam ile inkübe ilave edilir. [DMEM% 5 (v / v) fetal bovin serumu,% 5 yeni doğmuş buzağı serumu ve penisilin (50 birim / ml) artı streptomisin (50 ug / ml) ile takviye edilmiş]. </li><li> 100 mm çapında olan ortam kaldırarak supernatantları içeren virüs hasatyemekler, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Turbo DNase ile süpernatantlar tedavi, bir 45 mikron gözenek boyutunda bir şırınga filtreden geçirilerek filtre üst fazlar, 10 dakika için 3000 rpm&#39;de düşük hızlı santrifüjleme ile süpernatantlar açıklık ve enfeksiyon deneylerinde hazırlanması için ortam içinde süpernatantlar seyreltik . -80 ° C&#39;de, alikolar içinde dondurulmuş viral süpernatantlar saklayın Not: süpernatan içinde p24 miktarı, bir HIV-1 p24 enzim-bağlı immünsorbent deney paketi kullanarak belirlenir. P24 konsantrasyonu numunedeki virüs miktarını kontrol etmek için kullanılır. Virüs yaklaşık 500 ng enfeksiyon öncesi günde 1.5 x 10 5 hücre / tabak yoğunluğunda 60 mm&#39;lik çapı olan kaplara üzerine kaplanmıştır HOS hücrelere ilave edilir. Inkübasyon 48 saat sonra, hücreler hasat edilir santrifüj ile toplandı, yıkandı ve 100 ul PBS içerisinde yeniden süspanse edildi. Lüminesans raportör gen deneyi reajanı eşit miktarda ekleyin ve bölümler 5.4.1 &#39;de tarif edildiği gibi lusiferaz etkinliğini ölçmek ve5.4.2. Adım 4.6 &#39;da ele alındığı gibi, bu kaynaktan, virüsün uygun bir seyreltme yapılabilir. </li></ol> 4.. 96 oyuklu plakalar içerisinde bileşik Tarama , Üç kopya halinde her bir bileşik taraması ve sonuçları ortalama. Not: viral replikasyonu üzerindeki her bir bileşiğin etkisi, herhangi bir bileşik olmadan elde edilen replikasyon düzeyine normalize tarafından düzeltilir. <ol><li> Taranması için deneysel konsantrasyon aralığını belirler. Not: Genellikle, 11 seri seyreltme ile ekranlar kolon ve bunu 7 seri seyreltme ile ekranlar ile plaka kolona bileşiğin eklenmesi ile yapılır satıra göre olan bileşiğin eklenmesi suretiyle yapılır. Kuyuların set biri üçlü bileşik yok kontrolü için ayrılmış olmalıdır. Buna ek olarak, tek bir sütun ya da bir satır negatif / arka plan kontrolü olarak hareket için boş olması gerekir. Virüs ilave edilmiş ise Son olarak, bu hücresel sitotoksisite tahlili ya da enfekte olup olmadığını belirleyecektir. </li><li> Hazırlamak20 mM stok çözeltisinden seri seyreltileri. (Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi) konsantrasyonları, test edilecek konsantrasyonları ampirik bir biçimde tespit aralığına bağlı olarak seçilir. Nihai konsantrasyon 100 uM olacak, yani eğer, bir 1 mM çalışma stok yapmak, 10x istenen nihai konsantrasyon ortam içinde seyreltim dizileri hazırla. Not: 50 s 5-10 mm yukarıda IC ile bileşikleri ilaç geliştirilmesi için genellikle iyi bir aday değildir. İlk deneylerde sadece WT vektör karşı bileşikleri test edin. Etkin bir şekilde inhibe eden vektör WT gelecek vaat eden bileşikler, daha sonra, ilaç dirençli mutantların bir paneline karşı test edilir. </li><li> (Şekil 1, aşama 2&#39;de gösterildiği gibi) inkübatör 96 oyuklu plakalar çıkarın ve üç kopya halinde oyuklara test edilecek bileşiklerin seri dilüsyonları ekleyin. Not: oyuğuna ilave hacmi nihai konsantrasyonu 1/10 hacim olmalıdır. Sonuç olarak, 22 ul / oyuk (nihai hacim s eklemekost virüs enfekte ek tahliller için 220 ul) &#39;dir. Sitotoksisite analizi için, 11 ul / oyuk (son hacim 110 ul / oyuk olan) ekleyin. </li><li> Inkübatör 96 oyuklu plakalar döndürür. Hücresel sitotoksisite ekran için, 37 ° C&#39;de 96 oyuklu plakalar, 48 saat inkübe edilir ve başka bir manipülasyon Protokolü 4 ihtiyaç vardır: Protokol 5&#39;e geçin enfekte tahlilleri için, Protokol 4 talimatları takip etmektedir.. </li><li> Enfekte edebilirlik analizleri, sadece. Analiz edilecek bileşikler ile 37 ° C &#39;de 3 saat inkübasyondan sonra, en az bir inkübatör plakaları çıkarın. Not: Bu bileşik, HIV vektör ile enfeksiyon öncesinde hücreler tarafından alınmasını sağlar. </li><li> Virüsün 33 &#39;lik bir stok seyreltme hazırlayın, 34 (genellikle yaklaşık 01:03) muamele edilmemiş hücrelerdeki 0,2-1,5 olan nisbi lusiferaz birimlerine (RLU) arasında bir lusiferaz sinyal üretecek. Bütün bir plaka Dilu yaklaşık 10 ml alacakted virüs. 8 ya da 12 kanallı pipet kullanarak, kuyu her virüsün 100 ul ekleyin. Negatif / arka plan kontrol kuyuları için virüs katmayın. 48 saat boyunca 37 ° C inkübatör plakaları dönün. Not: Virüsün stok 1:03 seyreltme viral üstte yüzen madde içindeki konsantrasyonu, yaklaşık 500 ml 1.0 ng olduğunu gösteren bir p24 deneyinde göre 0.2 -1.5 arasında, bir lusiferaz RLU sinyal üretecek tipik bir dilüsyonudur. </li></ol> 5. Hazırlanması ve 96 kuyucuklu plaklar içinde NE sitotoksisi ve enfektivitesini Ölçümü <ol><li> Kuyulardan medya aspire (medyada fenol kırmızı lusiferaz sinyali etkileyebilir). Ucuna bağlanmış bir 200 ul pipet ucu ile bir cam pipet kullanın. Medyanın üstünde başlamak ve yavaş yavaş kuyunun alt köşesinde aşağı doğru çalışır. Kuyunun alt kısmında çok fazla zaman harcamak etme, ya da hücreler de kaldırılabilir. </li><li> PBS içinde 100 ul ekle 0,5 m ile desteklenmişHer bir oyuğa M MgCI2. Bu hücreler, kurumaz, böylece ortam çıkarılır hemen sonra yapılması gerekmektedir. </li><li> Sadece sitotoksisite deneyleri için, liyofilize edilmiş bir reaktif temin her şişeye Luminescence ATP algılama tahlilinden alt-tabaka tampon maddesi 5 ml ekleyin. Bir şişe, 96 oyuklu bir plaka için yeterlidir. <ol><li> Her bir oyuğa Luminescence ATP tarama deneyinde hücre liziz tamponu 50 ul ekle. Kompakt bir termomikser ile 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 700 rpm&#39;de 96 oyuklu plaka çalkalayın. </li><li> Negatif kontrol / arka plan gözü hariç bütün oyuklara yeniden Luminescence ATP tespitinde maddesi 50 ul ekle. Kompakt bir termomikser ile 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 700 rpm&#39;de çalkalanır. Sinyal gelişimi için zaman tanımak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Mikro luminometre kullanılarak 96 oyuklu plaka okuyun. Not: SoftMaxPro mikrolevha Lüminometre programını açın. Emin Lüminometre lumi ölçmek için ayarlanmış olduğundan emin olun5 okuma / iyi bir duyarlılıkta lüminesans. </li></ol></li><li> Sadece enfekte deneyleri için, liyofilize edilmiş bir reaktif temin her şişeye Luminescence raportör gen tahlili ikinci alt-tabaka tampon maddesi 10 ml ekleyin. Bir şişe her bir 96-çukurlu plaka için yeterlidir. <ol><li> Her bir oyuğa yeniden Luminescence raportör gen tahlili tepkin maddesi 100 ul ekle. Sinyal gelişimi için zaman tanımak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Bölüm 5.3.3 &#39;de yapıldığı gibi, bir mikro-luminometre kullanılarak 96 oyuklu plaka okuyun. </li></ol></li></ol> Bileşikler CC 50 ve IC 50 Değerleri 6.. Belirlenmesi <ol><li> Bir excel elektronik tabloya mikrolevha lüminometre gelen lusiferaz veri aktarımı. <ol><li> Ortalama hem de üç kopya ve arka plan / kontrol sinyal verileri lusiferaz verileri. Tüm konsantrasyon aralığı için ortalama üç nüsha sinyalden ortalama arka zemin / kontrol sinyali çıkarın. </li> &lt;li&gt; arka bu inhibisyon yüzdesi belirlemek için herhangi bir bileşik yokluğunda, sitotoksisite veya enfekte olup olmadığını, aktivitesine karşı konsantrasyon aralıkları için ortalama sinyali düzeltilmiş Normale. Not: yüzde önleme 100 ile çarpılarak ilacın yokluğunda lusiferaz aktivitesi ile bölünen ilaç varlığında, lusiferaz aktivite olarak tanımlanır. </li></ol></li><li> CC 50 ve IC 50 değerlerini elde etmek Kaleidagraph yazılım programını kullanın <ol><li> Ampirik bir biçimde tespit konsantrasyon aralığını ve KaleidaGraph içine lusiferaz aktivitesinin inhibisyon yüzdesi her iki aktarın. </li><li> X ekseni üzerinde konsantrasyon aralığı ve Y ekseni üzerinde lusiferaz aktivitesinin inhibisyon yüzdesi ile veri çizilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA.">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li><li>Hammer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controlled+trial+of+two+nucleoside+analogues+plus+indinavir+in+persons+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+CD4+cell+counts+of+200+per+cubic+millimeter+or+less+AIDS+Clinical+Trials+Group+320+Study+Team.">A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team.</a> New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).</li><li>Hogg, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+among+HIV-infected+patients+after+initiation+of+triple-drug+antiretroviral+regimens.">Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens.</a> Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).</li><li>Egger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+new+antiretroviral+combination+therapies+in+HIV+infected+patients+in+Switzerland:+prospective+multicentre+study.+Swiss+HIV+Cohort+Study.">Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study.</a> BMJ. 315, 1194-1199 (1997).</li><li>Gulick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+indinavir,+zidovudine,+and+lamivudine+in+adults+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+prior+antiretroviral+therapy.">Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.</a> New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).</li><li>Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+dynamics+in+vivo:+virion+clearance+rate,+infected+cell+life-span,+and+viral+generation+time.">HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.</a> Science. 271, 1582-1586 (1996).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+promoting+adherence+to+antiretroviral+therapy:+a+review+of+the+literature.">Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+adherence+interventions:+translating+research+findings+to+the+real+world+clinic.">Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).</li><li>Volberding, P. A., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+therapy+and+management+of+HIV+infection.">Antiretroviral therapy and management of HIV infection.</a> Lancet. 376, 49-62 (2010).</li><li>Acosta, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+assess+antiretroviral+target+trough+concentrations+using+in+vitro+susceptibility+data.">Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data.</a> Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).</li><li>Rockstroh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+treatment+with+raltegravir+or+efavirenz+combined+with+tenofovir/emtricitabine+for+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus-1-infected+patients:+156-week+results+from+STARTMRK.">Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK.</a> Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).</li><li>Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug-related+toxicities+-+clinical+spectrum,+prevention,+and+management.">Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management.</a> Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).</li><li>Lunzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+daily+dolutegravir+(S/GSK1349572)+in+combination+therapy+in+antiretroviral-naive+adults+with+HIV:+planned+interim+48+week+results+from+SPRING-1,+a+dose-ranging,+randomised,+phase+2b+trial.">Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial.</a> Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-formulated+elvitegravir,+cobicistat,+emtricitabine,+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz,+emtricitabine,+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection:+a+randomised,+double-blind,+phase+3+trial,+analysis+of+results+after+48+weeks.">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abacavir/lamivudine+versus+tenofovir+DF/emtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV:+final+results.">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li><li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+virus+assay:+a+rapid,+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates.">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).</li><li>Hertogs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+simultaneous+detection+of+phenotypic+resistance+to+inhibitors+of+protease+and+reverse+transcriptase+in+recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+from+patients+treated+with+antiretroviral+drugs.">A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs.</a> Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).</li><li>Petropoulos, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+phenotypic+drug+susceptibility+assay+for+human+immunodeficiency+virus+type+1.">A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1.</a> Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).</li><li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+DNA+integration:+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer.">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67, 1211-1221 (1991).</li><li>Hazuda, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells.">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li><li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir:+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium.">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).</li><li>Wills, T., Vega, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elvitegravir:+a+once-daily+inhibitor+of+HIV-1+integrase.">Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase.</a> Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).</li><li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+antiretroviral+properties+of+S/GSK1349572,+a+next-generation+HIV+integrase+inhibitor.">In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor.</a> Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).</li><li>Cooper, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgroup+and+resistance+analyses+of+raltegravir+for+resistant+HIV-1+infection.+Eng.">Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng.</a> J. Med. 359, 355-365 (2008).</li><li>Briz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir+and+etravirine+are+active+against+HIV+type+1+group+O.">Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O.</a> AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).</li><li>Fransen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+raltegravir+susceptibility+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+is+conferred+via+multiple+nonoverlapping+genetic+pathways.">Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways.</a> J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mutations+selected+in+vitro+with+raltegravir+confer+large+fold+changes+in+susceptibility+to+first-generation+integrase+inhibitors,+but+minor+fold+changes+to+inhibitors+with+second-generation+resistance+profiles.">Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles.</a> Virology. 402, 338-346 (2010).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+selected+with+elvitegravir+confer+reduced+susceptibility+to+a+wide+range+of+integrase+inhibitors.">Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors.</a> J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).</li><li>Canducci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+gene+evolution+in+patients+failing+raltegravir-based+salvage+therapies.">Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies.</a> AIDS. 23, 455-460 (2009).</li><li>Ceccherini-Silberstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+analysis+of+HIV-1+integrase+conservation.">Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation.</a> AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).</li><li>Charpentier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+profiles+for+the+HIV+integrase+gene+in+patients+failing+raltegravir+salvage+therapy.">Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy.</a> HIV Med. 9, 765-770 (2008).</li><li>Julias, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz, sitotoksisite ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 hem de replikasyonunu inhibe etme kabiliyetleri açısından bileşikleri taramak için kullanılabilecek bir hızlı, etkili ve yeniden üretilebilir bir deneyi tarif eder. Hızla bileşikleri belirlemek ve etkinliğini ve sitotoksisite test etmek için yeteneği, HIV-1&#39;e karşı, yeni ve geliştirilmiş ilaçların geliştirilmesinde önemlidir. Kurşun bileşikleri belirlendikten sonra, kurşun bileşiği analogları üretilen ve aynı deneyi kullanılarak test edilebilir. Tahlil oldukça basittir. Kullanıcının en sık karşılaşılan sorunlar (zehirli bileşikler, vektör stoku ile ilgili sorunlar) teşhis etmek için izin hem pozitif ve negatif kontroller vardır. Ilavesiz bileşiği ile kuyu, üçlü bir dizi kullanım, virüs tarafından enfeksiyon meydana geldiğini göstermektedir. Sitotoksisite bağımsız deneyde ölçülür olması viral replikasyonu üzerindeki özel bir etkisi olarak sitotoksisiteye neden lusiferaz bir azalma yanlış yorumlanması önler. Kritik adımlarHücrelerin eşit olarak kuyu her virüsün aynı miktarda eklenmesi, ve lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi, oyuklar test edilecek bileşiklerin uygun konsantrasyonları sahip olduğu, kuyularda, dağıtılır ve böylece protokolde plakaları hazırlanıyor CC 50 ve IC 50 değerleri belirlemek. Tahlil, kasa sayısal ve tekrarlanabilir. Vektör, replikasyon kusurlu olduğu için deney güvenlidir. Doğru ve uygun denenebilir lüsiferoz ifade eden bir tek yuvarlak vektör, dayalı olduğu için tahlil nicel ve tekrarlanabilir. Bir çok yuvarlak virüs çoğaltma tahlilinde, ölçülen IC50 viral yaşam döngüsü sayısına bağlıdır; deneyler WT ve önemli ölçüde farklı çoğaltma kapasitelerine sahip olabilir, ilaç dirençli iki virüs içeren bu bir sorundur. Birkaç enzimatik deneyler bu olabilir orada önceden bildirilmiştirIN inhibitörlerinin taranması için kullanılabilir. Entegre DNA ölçmek için gerçek zamanlı PCR teknolojisi içeren deneyler daha emek yoğun ve 36, 37 her ikisi de pahalıdır, saflaştırılmış rekombinant protein (ler) gerektirir, ve genel olarak, bulunmaktadır. Bu, diğer viral enzimler (RT ve proteaz) üzerinde bileşiklerin etkisini ölçmek için enzimatik testleri kullanmak mümkün olsa da, her bir enzim, kendi deney sistemi gerektirir. Bir yuvarlak deney vektörü tarif edildiği gibi, RT inhibitörlerinin taranması için, değişiklik olmadan, kullanılabilir. Benzer bir deney, proteaz inhibitörlerinin taranması için kullanılabilir; Bununla birlikte, bir proteaz inhibitörü deneyde, bileşikler vektörlerini üretmek için kullanılan hücrelere ilave edilmelidir. İlgili bir deney, çeşitli hücreler ve vektörler kullanılarak, aynı zamanda zarf (env) ve HIV giriş füzyon inhibitörlerinin taranması için kullanılabilir. Son olarak, deney otomatik robot dağıtım aracı ile birlikte, daha büyük bir ölçekte, kullanılabilir. Bu nedenle, tahlil, WT ve m karşı bileşiklerin büyük kütüphaneleri taramak için kullanılabilirutant HIV. Ancak, gerçek deney verileri yorumlamakta bir sınırlama viral yaşam döngüsü noktaları farklı aşamalarında hareket HIV replikasyon inhibitörü algılayabilir. Kendi başına deney, yaşam döngüsünde adım bir bileşik ile bloke edildiği tanımlamaz. Bu soru doğarsa, bu ilave tahliller 38 saati kullanılarak çözüldü ve saflaştırılmış rekombinant viral proteinlere karşı bileşiği test tarafından yapılabilir. Ne yazık ki, anti-HIV ilaç başarıya rağmen, direnç ve toksisite hem de sorunlar hala var. Etkili bir anti-HIV aşı yokluğunda, mevcut ilaç dirençli mutantların karşı etkili olacak, ancak aynı zamanda virüsün yayılmasını azaltmak önleyici ilaçlar geliştirmek için yeni bir tedavi edici ilaçlar geliştirmek için sadece bir ihtiyaç vardır. Anti-HIV ilaçlarının profilaktik kullanımı bulaşmamış insanların tedavi incudes ise, bu yaklaşım l var olan ilaçların geliştirilmesi üzerinde özel bir yük getireceğiittle veya uzun süreli toksisite.

HIV-1 viral yaşam döngüsündeki çeşitli temel adımları hedefleyen ilaçların durumuna çok HIV-1 enfeksiyonlarının tedavisi ve uzun vadeli hayatta kalma geliştirdi kombine ilaç tedavisi (yüksek oranda aktif bir anti retroviral terapi olarak adlandırılan veya HAART) yol açmıştır Hastaların. Tipik olarak iki, nükleosid ters transkriptaz (RT) inhibitörü ve bir proteaz inhibitörü ya da bir nükleosid olmayan bir RT inhibitörü kombinasyonlarını kullanan HAART, şimdi bir yaşam boyu durum 1-5 içine ölümcül bir hastalık dönüştürülmüş bulunmaktadır. Ancak, viral replikasyonunun zaman içinde tutulan bastırılmasına içinde HAART çok başarılara rağmen, bu sınırlamaları vardır. HAART&#39;a HIV ortadan kaldırmak değildir, bu nedenle hastalar tedavi edilmez ve tedavi hayat uzun. Ilaç toksisitesi ve ilaca dirençli suşların ortaya çıkması ile sorunlar vardır. Direnç HIV integrazın (IN) hedef yeni onaylanan ilaçlar dahil onaylı anti HIV ilaçları, tüm ortaya çıkabilir. İlaç direnci muhtemelen beca doğarViral replikasyon (3 x 10 -5 mutasyonlar / baz / çoğaltma döngüsü hata oranı) sırasında meydana gelen spontan mutasyon kullanım 6. Mutasyonlar anti-retroviral ilaç hedefleri kodlayan genlerde ortaya çıkar, bu mutasyonların küçük alt ilaçlara viral suşun duyarlılığında bir azalmaya yol açacaktır. Ilaç direncinin geliştirilmesini önlemek için, bir ilaç konsantrasyonu tam olarak HIV çoğalmasını önlemek seviyede muhafaza edilmelidir. Tedavi rejimine kötü bağlılık sorunu şiddetlendirir, ve direnç 7-9 hızlı gelişimine yol açabilir. İlaç konsantrasyonları farklı emilim, metabolizma, dağıtım, ve boşaltım seviyelere hastalarda değişebilir olmasına rağmen, yüksek ilaç konsantrasyonları toksisite 10 yol açabilir. Tedavi hastanın yaşam boyunca devam yana, anti-retroviraller uzun süreli toksisite konusunda ciddi güvenlik endişeleri vardır. HAART yaygın kullanılan anti-retroviraller olumsuz etkilere sahip olabilir and yan etkileri yaşamı tehdit 11-15 oylandı olaylar olmuştur. Hastalar direnci ve toksisite gelişimi ile karşılaşma sorunları etkili bir şekilde çok az veya hiç toksisite ile uzun süreli virüsün ortak ilaca dirençli türlerinin çoğalmasını bloke yeni ilaçlar geliştirmek için ihtiyaç altında yer alır. Bu nedenle, hızlı bir şekilde, viral yaşam çevriminde temel adımları bloke bileşiklerin taranması için bir analiz için bir ihtiyaç vardır. Burada bir bileşikler ve hızlı ve verimli bir şekilde WT ve ilaca dirençli HIV türlerinin her ikisinin replikasyonunu bloke etme kabiliyetleri sitotoksisitesini değerlendirmek için kullanılabilecek etkili bir tahlili tarif eder. Kullandığımız deney hasta 16-18 izole virüs ilaç direnci taranması için geliştirilmiş bir deneyde benzer. Deney HIV ters transkripsiyon engelleyebilir bileşikler için ekrana değişiklik olmadan da kullanılabilir olsa da, descri doyurmayaibe inhibitörleri IN değerlendirmek için tahlil kullanılarak. IN hücresel genom içine 19 ekler viral DNA, bir viral temel bir enzimdir. Inhibitörleri umut verici bir dizi geliştirilmektedir da, bazıları halen, sadece Isentress 20, 21 (aynı zamanda Raltegravir veya RAL olarak da bilinir), klinik denemeler sürmektedir ve son zamanlarda, Elvitegravir (EVG) 22 ve Dolutegravir (DTG) 23 olmuştur FDA tarafından onaylanmıştır. Bu bileşikler, HIV Yatak ve hücre kültüründe non-B alt tipleri hem karşı ve hastaların 24, 25 aktiftirler. Bununla birlikte, RAL ile tedavi Y143R, N155H ve G140S/Q148H 24, 26-31 de dahil olmak üzere mutantlan, IN ilaca dirençli HIV-1 için seçer. N155H ve G140S/Q148H ayrıca bu direnç mutasyonlarına karşı etkili olan iplikçik transfer inhibitörleri (INSTIs) IN ikinci nesil tasarım ve geliştirilmesi gereğini vurguluyor EVG etkinliğini azaltmak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

Anti-HIV ilaçlarının bir dizi kabul edilmiş olmasına rağmen, toksisite ve ilaç direnci ile ilgili sorunlar hala mevcuttur. Bu, en az toksisite ile ortak bir ilaç dirençli HIV-1 suşları ile enfeksiyonu önleyebilen yeni bileşiklerin belirlenmesi için bir ihtiyaç gösterir. Burada, hızlı hücre sitotoksisitesinin ve WT ve mutant virüs suşlarına karşı bir bileşiğin etkinliğinin belirlenmesi için kullanılabilecek etkili bir deneyi tarif eder. Arzu edilen hedef hücre hattı, 96 oyuklu bir plaka içerisinde tohumlanmıştır ve 24 saatlik bir inkübasyondan sonra, test edilecek bileşiklerin seri seyreltileri ilave edilir. Daha başka manipülasyonlar hücresel sitotoksisite deneyleri için gerekli olan; anti HIV lusiferaz hücrelere ilave edilir eksprese eden bir WT veya ilaç dirençli HIV-1 vektörü ya da bir önceden belirlenmiş miktarda deneyleri. Sitotoksisite, bir ATP bağımlı parlaklık deneyi ve enfeksiyon üzerinde bileşiklerin etkisini kullanarak ölçülür lucife miktarının belirlenmesi ile ölçülürvarlığında ya da varsayılan inhibitör yokluğunda rase. Bu tarama deneyinde tamamlamak için 4 gün sürer ve çok sayıda bileşiğin paralel olarak taranabilir. Bileşikler üç kez taranır ve veri hedef bileşiklerin yokluğunda enfekte / ATP seviyeleri normalleştirilir. Bu teknik potansiyel anti HIV bileşiklerin etkinliği ve toksisite hızlı ve doğru ölçüm sağlar.

Tahlil (Şekil 1, adım 1 ve 2) başarılı bir şekilde gerçekleştirildi, daha sonra lusiferaz değerleri Tablo 2&#39;de sunulan veriler benzemelidir konsantrasyon aralığında tarama.; Potansiyel olarak kuvvetli bir bileşik, soldan sağa lusiferaz aktivitesinin arttırılması ortaya çıkaracaktır, ve kontrol, yüksek lusiferaz aktivitesi olmalıdır. Lusiferaz aktivitesi konsantrasyon aralığında 0,1 Bağıl Lusiferaz birimlerine (RLU) geçmez, bu genellikle bileşiğin hücreleri öldürdüğünü gösterir. Lusiferaz veriler, daha fazla ya da tüm seri seyreltileri karşısında 2.0 RLU eşit ise, bileşikler, test edilen konsantrasyonlarda HIV-1 enfeksiyonlarının inhibe etmek mümkün değildi. Kaleidagraph (Tablo 3, bölüm A) içinde lusiferaz aktivitesinin inhibisyon yüzdesi karşı bileşiklerin konsantrasyonunu çizimi, lineer regresyon analizi ile, t benzer sonuçlar üretecek<html> Tablo 3, Kısım B&#39;de gösterilen hortum <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> HIV-1 viral stoklar ve hücresel toksisite ve tek yönlü bir bulaşıcılığı Tahliller Kur Şekil 1.. Hazırlanması. Adım 1 &#39;de, 293T hücreleri pNL4.3ΔEnv.LUC ve VSV-G ile transfekte edilir ve 34 virüs üretmek için 48 saat boyunca kuluçkaya yatırılmıştır . Bu enfekte deneylerinde kullanılıncaya kadar virüsü (alikotları -80 ° C&#39;de donduruldu) toplanır ve depolanır. Adım 2 için, HOS hücreler, 96 oyuklu plaka içerisine tohumlanır ve 24 saat için kuluçkalanmıştır. Hücreler daha sonra 3 saat boyunca, test edilecek bileşiklerin seri seyreltileri ile önceden yatırıldı ve daha sonra virüs (WT ya da ilaç dirençli iki) ile enfekte edilir. 48 saatlik bir inkübasyondan sonra, lusiferaz hareketliliği ölçülür. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tablo 1. Seri Seyreltme Prototip tarama Drug. Bir daha sıkı bir tarama tipik olarak 10 uM başlar ve 0.0005 uM &#39;da sona 11 seri dilüsyonları içerir. Seri seyreltmeler 10x hazırlanır; 100 ul hücre ve de her virüsün 100 ul) vardır. Bu hacim ve bu hesaplamalar neticesinde de, seri seyreltiler, bütün bir 96-yuvalı plakanın 3 satır için yeterli olacaktır. Sitotoksisite deneyleri, aynı şekilde hazırlanır; Bununla birlikte 11 seri seyreltme 250 uM başlar ve 0.05 uM &#39;da sona. Seyreltileri sadece 11 ul hücre 100 ul içeren plaka içindeki oyuklara ilave edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">bu şekilde daha büyük bir sürüm görüntülemek için tıklayın.</a> <img alt="Tablo 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tablo 2. Lusiferaz Sinyal veri okuma ve lusiferaz aktivitesi, bir yüzde Önlenmesinin Belirlenmesi. Verileri tablosu bir başarılı bir bileşik için lusiferaz verileri tipik bir dizi gösterir. Tabloda ayrıca lusiferazm yüzde önlenmesini ve CC 50 ve IC 50 değerlerini belirlemek için gerekli ek hesaplamaları gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tablo 3. Doğrusal Regresyon Analizi Veri Tablosu. Kısım A. KaleidaGraph lusiferaz aktivitesinin inhibisyon yüzdesi karşı kullanılan konsantrasyon aralığını Grafik uygun inhibisyon eğrileri üretecektir. Kısım B, inhibisyon eğrileri, 3 parametrik tanımlanırSigmoidal fonksiyonu ve lineer regresyon ile verilere uygun 18 analizleri. Bu veriler tablo, daha sonra% 50, örneğin, IC 50 ve CC 50 ile virüs entegrasyon ve hücresel sitotoksisite engellemek için gerekli ilaç konsantrasyonlarını hesaplamak için Microsoft Excel ile birlikte kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Burada tarif ve hücresel sitotoksisitesi bileşiklerin hızlı ve doğru tarama için izin tek tur enfekte edebilirlik analizleri, kendi hücresel sitotoksisiteye (CC 50) tespit etmek ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 karşı IC50 değerleri.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Görüntüleme.  National Cancer Institute.  Burada tarif ve hücresel sitotoksisitesi bileşiklerin hızlı ve doğru tarama için izin tek tur enfekte edebilirlik analizleri, kendi hücresel sitotoksisiteye (CC 50) tespit etmek ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 karşı IC50 değerleri. 

Video: Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Bulaşıcı Mürin Norovirüs Ters Genetik Aracılı Kurtarma

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapsid Tavlama Dolayımlı Elektroforez (ADI) Testi HIV-1 Nükieokapsit inhibitörlerinin Hızlı tanımlanması sağlar

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

Gıda kaynaklı patojen tarama kullanarak Manyeto-floresan Nanosensor: E. Coli O157: H7 hızlı tespiti

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Algılama ve kaldırma nükleaz kirlenme rekombinant prototip köpüklü virüs Integrase saflaştırılması sırasında

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...