Shigella araştırma alanı şu anda iyi bağışıklık veya enfeksiyon tarafından üretilen antikorların fonksiyonel rolünü incelemek için tanımlanmış tahliller yoksun. Bu analiz, bu bağışıklık yanıtlarını nitelemek ve Shigella spesifik antikorların bakterisidal aktivitesini ölçmek için iyi tanımlanmış bir yöntemi temsil eder. Bu tahlilin en büyük avantajı, birden çok numunenin yüksek iş analizine olanak sağlamasıdır.
Bu protokolde kullanılan teknikler, antikorların ve serum örneklerinin doğrudan bakteriyel olarak öldürülmesini ölçmek için uygulamalı zamanı ve genel tahkikat süresini büyük ölçüde azaltır. Başlamak için, ısı ve test örnekleri etkinleştirmek için 30 dakika boyunca 56 santigrat derece sıcak su banyosunda örnekleri kuluçka. Bir test plakası ve 20 mikrolitre deneme arabelleği elde edin ve 1'den 12 satıra kadar A satırına G.Ekle 20 mikrolitre lik deneme arabelleği sütunlarına bir ve iki sıra H.Load 30 mikrolitre her test numunesinin h.load ve yinelenen H satırına kopyalayın.
Test numunelerinin üç kat seri seyreltmelerini gerçekleştirmeye başlamak için, 3H'den 12H'ye kadar kuyulardan 10 mikrolitreyi çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Numuneyi iyi karıştırmak için numuneleri G ve pipet teki ilgili kuyulara 8-10 kez yukarı ve aşağı aktarın. Daha sonra, bu kuyulardan 10 mikrolitre çıkarın.
F ve pipet satırLarında ilgili kuyulara 8-10 kez yukarı ve aşağı karıştırmak için aktarın. A satırındaki kuyuları karıştırdıktan sonra bu seri seyreltme işlemine devam edin, 3A'dan 12A'ya kadar 10 mikrolitreyi çıkarın ve atın, böylece tüm kuyularda son hacmi 20 mikrolitredir. Dondurulmuş hedef bakteri stok bir şişe almak ve oda sıcaklığında eritin.
Sonra, 20 mililitre lik bir arabellekte bakterileri seyreltin. önceden belirlenmiş optimal seyreltme faktörüne göre. Çok kanallı pipet kullanarak, her bir asay plakasının her kuyuya seyreltilmiş bakterilerin 10 mikrolitre ekleyin.
Dondurulmuş Bebek Tavşan Iltifat bir şişe ve dondurulmuş ısı bir şişe BRC aktive alın. Oda sıcaklığına şişeleri eritmek için soğuk akan su kullanın. Daha sonra, 100 mikrolitre ısı yıkarıştırın BRC ile 400 mikrolitre istiyatrit tampon.
Sütun bir deki tüm kuyulara bu yüzde 20 ısı aktif BRC çözeltisinin 50 mikrolitresini ekleyin. Bir mililitre yerli BRC'yi dört mililitre lik bir arabellekle karıştırın. 2 ile 12 arasındaki sütunlarda bulunan tüm kuyulara bu yüzde 20 karışımın 50 mikrolitresini ekleyin.
Plakayı 10 ila 15 saniye boyunca bir tabak çalkalayıcıya yerleştirin ve istinat plakasını hafifçe karıştırın. Bir mikrobiyolojik kuluçka makinesinde iki saat boyunca bir bakteri plakası kuluçka. Bu arada, iki LB Agar plakaları kapakları çıkarın ve kuruması için 40 ila 60 dakika boyunca bir biyolojik güvenlik kabini yüz plakaları yüz yerleştirin.
Kuluçka tamamlandığında, reaksiyonu durdurmak için istinat plakasını ıslak buza aktarın ve 10 ila 20 dakika kuluçkaya yatırın. On iki kanallı pipet kullanarak, h ve spot plaka 10 mikrolitre reaksiyon karışımındaki kuyuları lba plakasının altına karıştırın. Hemen plakayı yatırın ve lekelerin yaklaşık 1,5 ila 2 santimetre çalışmasına izin verin.
G, F ve E satırları için bu yordamı yineleyin ve bunları önceki satırın üzerinde tespit edin. Çözelti LBA plakaları içine emilir kadar oda sıcaklığında LBA plakaları kuluçka. Daha sonra, plakaların kapaklarını koyun ve bir gecede kuluçkaya yatırmak için baş aşağı mikrobiyolojik bir kuvöze aktarın.
Ertesi gün, mililitre TTC başına 100 mikrogram ve her LBA plakasına yüzde 0,1 sodyum azit içeren 55 santigrat derecede 25 mililitre kaplama Agar ekleyin. Hayatta kalan bakterilerin kırmızı renk geliştirmesine izin vermek için iki saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Ardından, plakaları fotoğraflamak için dijital kamera kullanın.
Görüntüleri bir bilgisayara aktarın ve metin protokolünde belirtildiği gibi görüntüleri analiz etmek için NIST'nin Entegre Koloni Kodlama yazılımını kullanın. Temsili LBA plakaları renk gelişiminin bir gecede kuluçka ve bindirme ilavesi sonrasında gerçekleştiğini ve hayatta kalan tüm kolonilerin kırmızı renkte görülebilen olduğunu göstermektedir. Bakteriyel öldürme açıkça ilk üç seyreltme test tüm örnekler için görülür.
Numuneler tabağın daha yukarısında seyreltildikçe ve serum daha az yoğunlaştığı için bakteri cinayetinde azalma görülür. Mikrokoloni sayıları daha sonra NIST yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Her numunenin her seyreltme için ortalama CFU sayısı hesaplanır, yüzde 50 öldürme değeri gibi.
Bu yüzde 50 öldürme değeri daha sonra SBA KI hesaplamak için gerekli değerleri belirlemek için her serum seyreltme için ortalama Cpu uygulanır. Bu protokol LB Auger tutarlı ve düzgün bakteriyel kaplama dayanır. İyi nokta kaplama ve yatırma tekniği ayrık mikrokolonilerin büyümesine ve doğru koloni sayımına olanak sağlayacaktır. Bu teknik canlı öldürücü Shigella kullanır ve bakteri BSL 2 prosedürlerine göre güvenli bir şekilde ele sağlamak için uygun aseptik tekniği ve PPE gerektirir.
