La preparación de antibióticos fluorescentes permite evaluar la localización de estos reactivos terapéuticos dentro de las bacterias a través de técnicas analíticas convenientes como la espectrofotometría y la microscopía. La principal ventaja de esta técnica es la facilidad con la que se puede determinar la localización de antibióticos. Esta localización es relevante para una serie de fenómenos, incluyendo el eflujo.
Para realizar el procedimiento de reacción de clic A, coloque el antibiótico azida de interés en un matraz de fondo redondo y agregue 25 mililitros de tert-butanol y 25 mililitros de agua por mililitro de azida al matraz. Añadir el fluoróforo alquino preparado a la solución y calentar la reacción a 50 grados Celsius. A continuación, añada 0,6 equivalentes de sulfato de cobre y 2,4 equivalentes de ácido ascórbico al matraz.
Revuelva la reacción durante una hora o hasta que el análisis de LCMS indique la finalización de la reacción. A continuación, enfríe y purifique la reacción según corresponda para el andamio antibiótico. Aquí, se muestra la reacción química de clic clave clave para la preparación de antibióticos fluorescentes con ejemplos de la estructura sintetizada a partir de los antibióticos correspondientes a través de un intermedio de azaide basado en ciprofloxacino, linezolid y trimetoprim.
En estos rastros de espectrometría de masas de cromatografía líquida a partir de un ciprofloxacino azida y una reacción de clic de alquina NBD, el azide se eluted a 3,2 minutos y el producto se eluía a 3,8 minutos. El progreso de la reacción de clic puede ir seguido de la desaparición del pico azide. En estos espectros, el impacto de la purificación se puede visualizar con picos erróneos que desaparecen.
Para evaluar la actividad antimicrobiana del antibiótico sintetizado, las reservas de glicerol rayado de cepas bacterianas apropiadas para el andamio antibiótico en las placas de agar LB y crecen los cultivos durante la noche a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, elegir una sola colonia de cada plato y cultivar las colonias durante la noche en cinco mililitros de CAMHB por cultivo a 37 grados centígrados. Al día siguiente, diluir los cultivos aproximadamente 40 veces en CAMHB fresco y hacer crecer las bacterias a la fase de registro medio con una densidad óptica a 600 nanómetros entre 0,4 y 0,8.
A continuación, preparar las soluciones de stock de cada antibiótico fluorescente a 1,28 miligramos por mililitro en 20%dimetil sulfóxido en agua estéril y añadir 10 microlitros de antibiótico a cada pozo de la primera columna de una placa de 96 pozos. Añadir 90 microlitros de CAMHB a cada pozo de la primera columna y 50 microlitros a todos los otros pozos. A continuación, realice una dilución en serie dos veces a través de la placa.
Después de mezclar a fondo, diluir los cultivos de fase de registro medio a aproximadamente una vez 10 a la sexta colonia formando unidades por mililitro y añadir 50 microlitros de cada cultivo a los pozos de dilución para obtener una concentración final de aproximadamente cinco veces 10 a la quinta colonia formando unidades por mililitro. Cuando todas las bacterias hayan sido chapadas, coloque las tapas en las placas e incubar los cultivos durante 18 a 24 horas a 37 grados centígrados sin temblar. Al día siguiente, inspeccione visualmente las placas.
La concentración mínima de inhibición será la concentración más baja sin crecimiento visible. Para el análisis de acumulación de sonda, las existencias de glicerol rayado de las cepas bacterianas en las placas de agar LB para una incubación durante la noche a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, elija una sola colonia del plato para el cultivo nocturno en caldo de lysogeny a 37 grados centígrados.
A la mañana siguiente, diluir el cultivo nocturno aproximadamente 50 veces en medio fresco. Cuando el cultivo alcanza la fase media del tronco, peleciar las bacterias por centrifugación y decantar el medio. Resuspend las bacterias en un mililitro de PBS y centrifugar las bacterias de nuevo.
Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet lavado en PBS a una densidad óptica a 600 nanómetros de dos. Añadir 10,1 microlitros de 10 PCCC mililolares en PBS a un mililitro de bacterias e incubar las bacterias a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Al final de la incubación, recoger las bacterias por centrifugación y resuspend el pellet en un mililitro de 10 a 100 solución antibiótica fluorescente micromolar en PBS.
Después de una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius, lave las células por centrifugación cuatro veces en un mililitro de PBS frío por lavado. Después del lavado, ane la bacteria con 180 microlitros de tampón de lelisis y 70 microlitros de la lesoz. Después de 30 minutos a 37 grados celsius, congelar-descongelar las bacterias tres veces a menos 78 grados Celsius durante cinco minutos y 34 grados Celsius durante 15 minutos respectivamente.
Después de la última ronda de congelación-descongelación, sonicar la muestra durante 20 minutos seguido de una incubación de 30 minutos a 65 grados Centígrados. Al final de la incubación, recoger la muestra de lesed por centrifugación y colar el contenido del tubo a través de una membrana de filtro de 10 kilodalton. Lave el filtro cuatro veces con 100 microlitros de agua por lavado y aliquot cada uno se lave en pozos individuales de un plato de fondo plano negro de 96 pozos.
A continuación, mida la intensidad de la fluorescencia en un lector de placas con longitudes de onda de excitación y emisión adecuadas al fluoróforo. Estos resultados típicos de la evaluación de la acumulación intracelular por espectroscopia de fluorescencia en presencia y ausencia de eflujo muestran que la fluorescencia intracelular de las bacterias es significativamente mayor después del pretratamiento con PCC que indica que el eflujo reduce la acumulación dentro de las bacterias. En estas imágenes representativas de microscopía confocal de bacterias Gram positivas y Gram negativas, la localización del antibiótico dentro de las bacterias se puede visualizar después del tratamiento con PCCC.
Este fenómeno no se observa cuando no se agrega ningún CCCP. Cuando utilice antibióticos fluorescentes, tenga en cuenta qué información está apuntando a recopilar y asegúrese de considerar qué protocolo será más útil al obtener estos datos. Después de su síntesis, los antibióticos fluorescentes se pueden utilizar para estudiar una serie de procesos bacterianos, incluyendo interacciones de objetivos de fármacos y modificaciones de resistencia.
