Bu protokol insan pluripotent kök hücrelerden sempatik nöronların türemiş sağlar. Bu hücreler sempatik sinir sistemini etkileyen insan bozuklukları çalışma bir bilim adamı sağlayacaktır. Bu teknik, yüksek ölçeklenebilir verimlilikte bölünmüş besleyicisiz toplantı koşullarında sempatik nöronların türemesine olanak sağlar.
20 gün içinde elektriksel olarak aktif nöronlarla sonuçlanır. Bu teknik, disfonksiyonel sempatik sinir sisteminin neden olduğu hastalıklara uygulanabilir, aynı zamanda hastalık modelleme, rejeneratif tıp ve ilaç taraması için de kullanılabilir. Bu hücreler, örneğin kardiyak doku regülasyonu nun incelenmesinde, bir ortak kültür sistemi içindeki herhangi bir dokuyu yenilik yapmak için in vitro olarak kullanılabilir.
İnsan pluripotent kök hücre kültürü %80-90 biraraya geldiğinde, pürüzsüz parlak kenarlı büyük kolonilere dikkat edilmelidir. Bölme için, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 0,25 molar EDTA dört mililitre ile hücreleri tedavi etmeden önce PBS ile kültür yıkayın. İki dakika sonra, plakayı 10 mililitre E8 orta sıyla yıkayın ve müstakil hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Daha sonra 500 mikrolitre hücreyi 9,5 mililitrelik taze E8 ortamına aktarın. Ve kök hücreleri yeni vitronektin kaplamalı 100 milimetrelik tabaklara yerleştirin. Diferansiyasyon indüksiyonundan bir gün önce, her kuyuda iki mililitre lik iki mililitre lik altı kuyu plakası içeren uygun sayıda kaplama.
Ve tabakları bir gecede 4 derece saklayın. Ertesi sabah, oda sıcaklığına plakaları ısıtın ve yıkama başına taze PBS ile iki kez insan pluripotent kök hücre kültürünü bölmek için hazır yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, yüzen insan pluripotent kök hücreleri spirating ve 50 mililitrelik tüp içine hasat hücreleri transfer önce hücre kültürü kuluçka 15 dakika boyunca 0.5 milimolar EDTA yedi mililitre ile hücreleri tedavi.
EDTA seyreltmek ve santrifüj ile hücreleri toplamak için tüpe PBS eşit hacimli ekleyin. Muhasebe için uygun bir ortam hacmi eklemeden önce 01 farklılaştırma aracının bir mililitresinde peleti yeniden askıya alın. Hücreleri 1,25 çarpı 10 ile santimetre kare konsantrasyonbaşına beşinci hücrelere seyrelterek her kuyu başına mililitre farklılaşma ortamına dönüştürün.
Daha önce altı iyi plaka için hazırlanan her kuyudan tüm bodrum membran matris çözeltisi aspire. Sonra her kuyuya iki mililitre hücre tohumu ve hücre kültürü kuluçka içine plaka yerleştirin. Ertesi sabah, günlük 3 mililitre ile hücreleri beslemek 01 farklılaşma orta iyi başına.
Farklılaşmanın ikinci gününde, hücreleri her gün 2 ila 10 farklılaştırma ortamıyla üç mililitre ile besleyin, sonra 10. Nöral krest hücrelerini küresel lere toplamak için, 10. Ve her kuyuya iki mililitre ayrışma ortamı ekleyin.
Hücre kültürü kuluçka 20 dakika sonra, 50 mililitrekonik tüp içine yüzen hücreleri aktarın ve taze PBS ile 50 mililitre tüp süspansiyon hacmi getirmek. Santrifüj ile hücreleri toplayın. Ve gün 10 ila 14 küresel orta yeterli hacimde sayım için pelet resuspend.
Saydıktan sonra, gün 10 ila 14 küresel orta kullanarak 500 mikrolitre konsantrasyonu başına beş kez 10 beşinci hücrelere hücreleri seyreltin. Ve 500 mikrolitre hücreyi her bir kuyuya, ultra düşük eki 24-iyi bir plakanın içine yerleştirin. Sonra hücreleri hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün.
Minimal küresel kültür neden olmak için, kültür gün 11, iyi başına gün 10 ila 14 küresel orta ek 500 mikrolitre ile nöral ibik sferoidler beslemek. 12. günde, plakanın bir tarafında ki küreselleri birikmesi için plakayı yatırın. Ve spheroidleri aspire etmeden her kuyudan mümkün olduğunca orta derecede aspire edin.
Sonra iyi başına gün 10 ila 14 küresel orta bir mililitre ile küresel beslemek. Genişletilmiş bir küresel kültür ikna etmek için, gün 1.5 mililitre ile küresel beslemek 10 için 14 küresel orta iyi başına 0.5 mikromolar retinoik asit ile takviye. Sonra küresel leri hücre kültürü kuluçka makinesine geri ver.
Sempatik nöron farklılaşması için, 14 veya 28. Sempatik nöron orta bir mililitre ile hücreleri beslemek. Büyük küresel agregaları daha küçük küresel lere ayırmak için, kuyu başına en fazla bir mililitre orta ekleyin ve parçalanmadan önce sferoidleri 5-10 kez pipetler.
Ve daha önce hazırlanmış 24-iyi plakalar fazla laminin fibronectin kaldırın. 24 kuyulu küresel kültür plakası üzerindeki her kuyudan bir mililitre küresel spheroid plakayı, yeni kaplamalı 24 kuyunun dört ayrı kuyusu arasında bölün. Her kuyuya 250 mikrolitre taze sempatik nöron ortamı ekleyin.
Ve plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Ertesi sabah, sempatik nöron orta 0.125 mikromolar retinoik asit ile takviye sempatik nöron orta her kuyuda orta değiştirin ve hücre kültürü kuluçka için plaka dönmek. Gün sonra 35, dikkatle taze orta ile her kuyuda mevcut ortamın sadece yarısını değiştirerek nöronlar beslemek.
Farklılaşmadan önce, insan pluripotent kök hücre kolonileri parlak, pürüzsüz kenarları ve hiçbir farklılaşma için çok az yuvarlak olmalıdır. Hücreler nöral krest belirteci Sox10'u 4 günden 10 güne kadar ifade eder. Nöral krest hücreleri altıncı günden itibaren görülebilen yoğun karanlık sırtlarda ortaya çıkar.
Bu sırtlar da Sox10 ifade. Nöral krest hücreleri aşamasında, Sox10 hücre yüzey marker CD49D ile ilişkilidir, hangi nöral krest hücreleri sıralamak için kullanılabilir. Pozitif sıralanmış ve sıralanmamış popülasyonlar benzer bir şekilde nöral krest spheroidler üretti.
Negatif sıralanmış hücreler düzgün bir araya gelmezken, yuvarlak, pürüzsüz sağlıklı görünümlü spheroidler üretmez ve üç ila dört gün içinde ölür. Ayrıca, nöral krest spheroidler 14. Gün 20 veya 35, ilgili minimal veya genişletilmiş protokoller, nöroidler bağlı küresel bir radyal desen büyüyen görülebilir.
Norepinefrin sentezi ve taşınması ile ilgili belirteçler bu aşamada ifade edilir, yanı sıra Hox6 ile dokuz gövde nöral krest genleri. Elektrofizyolojik kayıt da 20. Bu tür aktivite gelişmiş veya farklılaştırılmış nöronların işlevselliğini ayarlayan sempatik nöronların otoreseptörleri hedef ilaçlar tarafından bastırılmış olabilir.
İnsan taraftarları kendilerini farklılaşma gün sıfır dan başlayarak sağlıklı olmalıdır, aksi takdirde, deney büyük olasılıkla başarısız olacaktır. Farmakolojik inhibitörleri veya aktivatörler normal veya patolojik davranışlarını anlamak için nöronlar eklenebilir. Bu yöntem sempatik biyoloji ve patoloji yi incelemek için yeni bir yol açılmaktadır, çünkü artık insanlardan sempatik nöronların biyopsilerini kolayca elde etmek mümkündür.
