Этот протокол позволяет вывод симпатических нейронов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Эти клетки позволят ученому изучать нарушения человека, которые влияют на симпатическую нервную систему. Этот метод позволяет вывод симпатических нейронов в разделенных фидер-свободных условий встречи с высокой масштабируемой эффективности.
Это приводит к электрически активных нейронов в 20 дней. Этот метод может быть применен к заболеваниям, вызванным дисфункциональной симпатической нервной системы, он также может быть использован для моделирования заболеваний, регенеративной медицины и скрининга наркотиков. Эти клетки могут быть использованы в пробирке для инноваций любой ткани в рамках системы совместной культуры, например, для изучения регулирования сердечной ткани.
Когда культура плюрипотентных стволовых клеток человека достигает 80-90%, следует наблюдать большие колонии с гладкими яркими краями. Для расщепления, мыть культуру с PBS перед лечением клеток с четырьмя миллилитров 0,25 молярной ЭДТА при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Через две минуты промыть пластину с 10 миллилитров E8 среды и передачи отдельной подвески ячейки на 15 миллилитров конической трубки.
Затем перенесите 500 микролитров клеток в 9,5 миллилитров алицита свежей среды E8. И пластины стволовых клеток на new vitronectin покрытием 100 миллиметров посуды. За день до индукции дифференциации, пальто соответствующее число из шести пластин хорошо с двумя миллилитров мембранной матрицы подвала на колодец.
И хранить тарелки при четырех градусах по Цельсию на ночь. На следующее утро, тепло пластин до комнатной температуры и мыть готовы разделить человека плюрипотентных стволовых клеток культуры два раза со свежим PBS за стирку. После второй стирки, лечить клетки с семью миллилитров 0,5 миллимолярной ЭДТА в течение 15 минут в инкубаторе культуры клеток, прежде чем аспирировать плавающие человеческие плюрипотентные стволовые клетки и передачи собранных клеток в 50 миллилитровую трубку.
Добавьте равный объем PBS в трубку, чтобы разбавить ЭДТА и собрать клетки центрифугации. Повторное добавление гранулы в один миллилитр среды дифференциации дня 01, прежде чем добавить соответствующий объем среды для учета. Разбавить клетки в 1,25 раза от 10 до пятой клетки на квадратный сантиметр концентрации в миллилитров дифференциации среды на колодец.
Аспирировать все мембранные матричные растворы подвала от каждой колодец ранее подготовленной до шести хорошо пластины. Затем семя двух миллилитров клеток в каждый колодец и поместите пластину в инкубатор культуры клеток. На следующее утро, кормить клетки с тремя миллилитров день 01 дифференциации среды на колодец.
На второй день дифференциации, кормить клетки с тремя миллилитров день от двух до 10 дифференциации среды на колодец, а затем кормить клетки через день до 10-го дня. Чтобы агрегировать клетки нервного гребня в сфероиды, на 10-й день промыть клетки с помощью PBS. И добавить два миллилитров диссоциации среды к каждому хорошо.
После 20 минут в инкубаторе культуры клетки, передача плавающих клеток в 50 миллилитров конической трубки и довести объем подвески в трубке до 50 миллилитров со свежим PBS. Соберите клетки путем центрифугации. И повторное приостановление гранулы в достаточном объеме день от 10 до 14 сфероидов среды для подсчета.
После подсчета, разбавить клетки в пять раз от 10 до пятой клетки на 500 микролитров концентрации с помощью день от 10 до 14 сфероидов среды. И пластины 500 микролитров клеток в каждый колодец ультра низкой крепления 24-хорошо пластины. Затем верните клетки в инкубатор клеточной культуры.
Чтобы вызвать минимальную сфероидную культуру, на 11-й день культуры, кормить нейронный гребень сфероидов с дополнительными 500 микролитров день от 10 до 14 сфероидов среды на колодец. На 12-й день наклоните пластину, чтобы накопить сфероиды на одной стороне пластины. И тщательно аспирировать как можно больше среды от каждого хорошо без аспирации сфероидов.
Затем кормить сфероидов с одним миллилитр день от 10 до 14 сфероидов среды на колодец. Чтобы вызвать расширенную сфероидную культуру, на 15-й день кормите сфероиды 1,5 миллилитровами дня от 10 до 14 сфероидов среды, дополненной 0,5 микромолярной ретинойной кислотой на колодец. Затем верните сфероиды в инкубатор клеточной культуры.
Для симпатической дифференциации нейронов, на 14 или 28 день, наклонить пластину, чтобы накопить сфероиды на одной стороне пластины и тщательно аспирировать как можно больше среды, насколько это возможно. Кормите клетки одним миллилитром симпатической нейронной среды. Чтобы разбить большие сфероидные агрегаты на более мелкие сфероиды, добавьте не более одного миллилитра среды на колодец и пипетки сфероидов в пять-десять раз перед расщеплением.
И удалить избыток ламинина фибронектина из ранее подготовленных 24-хорошо пластин. Разделите пластину на один миллилитр сфероидов от каждой скважины на 24-скважинной пластине сфероидной культуры между четырьмя отдельными колодцами новой пластины с покрытием 24 скважин. Добавьте 250 микролитров свежей симпатической нейронной среды к каждой хорошо.
И поместите тарелку в инкубатор клеточной культуры. На следующее утро замените среду в каждом хорошо с одним миллилитром симпатической нейронной среды, дополненной 0,125 микромолярной ретинойной кислотой, и верните пластину в инкубатор клеточной культуры. После 35-го дня кормите нейроны, тщательно заменяя только половину существующей среды в каждом хорошо со свежей средой.
Перед дифференциацией, человеческие плюрипотентные колонии стволовых клеток должны быть круглыми с блестящими, гладкими краями и практически без дифференциации. Клетки выражают маркер нервного гребня Sox10 с 4 по 10 дней. Нейронные клетки гребня появляются в плотных затемненных хребтах, которые видны с шестого дня.
Эти хребты также выражают Sox10. На стадии нейронных клеток гребня Sox10 коррелирует с маркером поверхности клетки CD49D, который может быть использован для сортировки нервных клеток гребня. Положительные отсортированные и несортированные популяции производили сфероиды нервного гребня аналогичным образом.
В то время как отрицательные отсортированные клетки не агрегируются должным образом, не производят круглые, гладкие здоровые выглядят сфероиды и умирают в течение трех-четырех дней. Кроме того, когда нейронный гребень сфероиды сравниваются в день 14, количественные обратной транскриптазы ПЦР для нервного гребня и симпатической нервных маркеров прародителя, значительные различия между отсортированных и несортированных клеток не могут быть обнаружены. На 20 или 35 день, соответствующие минимальные или расширенные протоколы, невроиды можно наблюдать растет в радиальной модели из прикрепленных сфероидов.
Маркеры, связанные с синтезом норадреналина и транспортировки выражаются на данном этапе, а также Hox6 через девять генов ствола нервного гребня. Электрофизиологическая запись также обнаруживает нейронную активность с 20-го дня. Такая активность может быть усилена или подавлена препаратами, которые нацелены на ауторецепторы симпатических нейронов, корректирующие функциональность дифференцированных нейронов.
Человек сторонник сами должны быть здоровыми, начиная с нулевого дня дифференциации, в противном случае, эксперимент, скорее всего, не удастся. Фармакологические ингибиторы или активаторы могут быть добавлены в нейроны, чтобы понять их нормальное или патологическое поведение. Этот метод открывает новые возможности для изучения симпатической биологии и патологии, так как теперь можно легко получить биопсию симпатических нейронов от человека.
