يسمح هذا البروتوكول اشتقاق الخلايا العصبية المتعاطفة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. هذه الخلايا سوف تمكن عالما لدراسة الاضطرابات البشرية التي تؤثر على الجهاز العصبي المتعاطف. هذه التقنية تسمح اشتقاق الخلايا العصبية المتعاطفة في ظروف الاجتماع الخالية من التغذية المقسمة في كفاءة عالية قابلة للتطوير.
أنه يؤدي في الخلايا العصبية النشطة كهربائيا في 20 يوما. ويمكن تطبيق هذه التقنية على الأمراض الناجمة عن خلل الجهاز العصبي متعاطفة، كما يمكن أن تستخدم النمذجة المرض، الطب التجديدي، وفحص المخدرات. يمكن استخدام هذه الخلايا في المختبر لابتكار أي أنسجة داخل نظام ثقافة مشترك ، على سبيل المثال ، لدراسة تنظيم أنسجة القلب.
عندما تصل ثقافة الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات إلى 80 إلى 90٪ من الالتقاء ، ينبغي ملاحظة المستعمرات الكبيرة ذات الحواف الساطعة الناعمة. لتقسيم، وغسل الثقافة مع برنامج تلفزيوني قبل معالجة الخلايا مع أربعة ملليلتر من 0.25 EDTA الضرس في 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون 5٪. بعد دقيقتين، قم بمسح اللوحة بـ 10 ملليلترات من E8 المتوسطة ونقل تعليق الخلية المنفصل إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
ثم نقل 500 ميكرولترات من الخلايا إلى 9.5 ملليلتر aliquot من E8 المتوسطة الطازجة. وطبق الخلايا الجذعية على vitronectin جديدة المغلفة 100 ملليمتر أطباق. قبل يوم واحد من التمايز التعريفي، معطف العدد المناسب من ستة لوحات جيدا مع ملليلتر اثنين من مصفوفة غشاء الطابق السفلي في بئر.
وخزن اللوحات عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، تدفئة لوحات إلى درجة حرارة الغرفة وغسل جاهزة لتقسيم الإنسان متعددة القدرات ثقافة الخلايا الجذعية مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل. بعد الغسيل الثاني، تعامل مع الخلايا مع سبعة ملليلتر من 0.5 ملليمولار EDTA لمدة 15 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية قبل الطامح الخلايا الجذعية البشرية العائمة متعددة القدرات ونقل الخلايا المحصودة إلى أنبوب 50 ملليلتر.
إضافة حجم مساو من برنامج تلفزيوني إلى أنبوب لتخفيف EDTA وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من يوم 01 تمايز المتوسطة قبل إضافة حجم مناسب من المتوسطة للمحاسبة. تمييع الخلايا إلى 1.25 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز سنتيمتر مربع في ملليلتر من التمايز المتوسطة في البئر.
استلهم كل من مصفوفة غشاء الطابق السفلي حل من كل بئر من أعدت سابقا إلى ستة لوحة جيدا. ثم بذور مليلترين من الخلايا في كل بئر ووضع لوحة في الحاضنة ثقافة الخلية. في صباح اليوم التالي، تغذية الخلايا مع ثلاثة ملليلتر من اليوم 01 تمايز المتوسطة في بئر.
في اليوم الثاني من التمايز ، وإطعام الخلايا بثلاثة ملليلترات من اليوم الثاني إلى 10 تمايز متوسطة في البئر ، ثم تغذية الخلايا كل يوم حتى اليوم 10. لتجميع خلايا القمة العصبية في الخلايا الرّئية، في اليوم العاشر، اغسل الخلايا بـ PBS. وإضافة مليلترين من الانفصام المتوسط لكل بئر.
بعد 20 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية ، قم بنقل الخلايا العائمة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وإحضار حجم التعليق في الأنبوب إلى 50 ملليلتر مع PBS جديدة. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. و resuspend بيليه في حجم كاف من اليوم 10 إلى 14 وسيلة 14 spheroid للعد.
بعد العد، تمييع الخلايا إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز ميكرولترس 500 باستخدام اليوم 10 إلى 14 spheroid المتوسطة. ولوحة 500 ميكروليتر من الخلايا في كل بئر من مرفق منخفضة جدا 24-جيدا لوحة. ثم قم بإرجاع الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية.
للحث على ثقافة أدنى spheroid ، في اليوم 11 من الثقافة ، وإطعام الذرة العصبية مع 500 ميكرولترات إضافية من اليوم 10 إلى 14 spheroid المتوسطة في البئر. في اليوم 12، إمالة لوحة لتتراكم الزفيرويدات على جانب واحد من لوحة. واتّهم بعناية قدر الإمكان من المتوسط من كل بئر دون أن تُشعّب ِ بُرَوّة.
ثم تغذية spheroids مع ملليلتر واحد من اليوم 10 إلى 14 spheroid المتوسطة في بئر. للحث على ثقافة واسعة من الزفيرويد، في اليوم 15، تغذية spheroids مع 1.5 ملليلتر من اليوم 10 إلى 14 spheroid المتوسطة تكملها 0.5 حمض الريتينويك ميكرومولر في بئر. ثم قم بإرجاع spheroids إلى حاضنة ثقافة الخلية.
للتمايز العصبية المتعاطفة، في اليوم 14 أو 28، إمالة لوحة لتراكم spheroids على جانب واحد من لوحة وpirate بعناية متوسطة قدر الإمكان. تغذية الخلايا مع ملليلتر واحد من وسط الخلايا العصبية المتعاطفة. لتفريق المجاميع spheroid كبيرة في spheroids أصغر ، إضافة ما لا يزيد عن ملليلتر واحد من المتوسطة في البئر والميصة spheroids خمس إلى 10 مرات قبل تقسيم.
وإزالة الليفي اللامينيين الزائدة من لوحات 24-جيدا أعدت سابقا. تقسيم لوحة ملليلتر واحد من spheroids من كل بئر على لوحة ثقافة spheroid 24-آبار بين أربعة آبار منفصلة من لوحة جديدة المغلفة 24 جيدا. إضافة 250 ميكرولترات من الخلايا العصبية متعاطفة جديدة المتوسطة لكل بئر.
ووضع لوحة في الحاضنة ثقافة الخلية. في صباح اليوم التالي، استبدال المتوسطة في كل بئر مع ملليلتر واحد من وسط الخلايا العصبية المتعاطفة تكمل مع 0.125 حمض الريتينويك ميكرومولار والعودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية. بعد يوم 35، تغذية الخلايا العصبية عن طريق استبدال بعناية فقط نصف الوسط الموجود في كل بئر مع المتوسطة الطازجة.
قبل التمايز، ينبغي أن تكون مستعمرات الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات مستديرة بحافات لامعة وسلسة والقليل أو لا تمايز. الخلايا تعبر عن علامة القمة العصبية Sox10 من الأيام الأربعة إلى 10. تظهر خلايا القمة العصبية في التلال الكثيفة الداكنة التي تكون مرئية من اليوم السادس.
هذه التلال أيضا تعبر عن Sox10. في مرحلة الخلايا العصبية، يرتبط Sox10 مع علامة سطح الخلية CD49D، والتي يمكن استخدامها لفرز الخلايا القمة العصبية. أنتجت مجموعات سكانية إيجابية مفروزة وغير متنوعة ذرّة عصبية بطريقة مماثلة.
في حين أن الخلايا المفكوزة السلبية لا تجمع بشكل صحيح ، لا تنتج دائرية ، ناعمة صحية تبحث spheroids ويموت في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام. وعلاوة على ذلك، عندما تتم مقارنة الذرى العصبية spheroids في اليوم 14، وcredase عكس الكمية PCR لذرة العصبية و العلامات السلف العصبي متعاطفة، لا يمكن الكشف عن اختلافات كبيرة بين الخلايا فرزها وغير فرزها. في اليوم 20 أو 35 ، والبروتوكولات الحد الأدنى أو الموسعة ، يمكن ملاحظة الأعصاب تنمو في نمط شعاعي من الزنجيات المرفقة.
يتم التعبير عن علامات تتعلق تخليق نافرينفيرين والنقل في هذه المرحلة, وكذلك Hox6 من خلال تسعة الجينات الجذع العصبية قمة. كما يكشف التسجيل الكهربائي النشاط العصبي من اليوم 20. يمكن تعزيز مثل هذا النشاط أو قمعه من قبل الأدوية التي تستهدف التقبلات الذاتية للخلايا العصبية المتعاطفة تعديل وظيفة الخلايا العصبية المتمايزة.
يجب أن يكون المؤيد البشري نفسه بصحة جيدة بدءًا من اليوم الصفري للتمايز ، وإلا ، من المرجح أن تفشل التجربة. يمكن إضافة مثبطات دوائية أو منشطات إلى الخلايا العصبية لفهم سلوكهم الطبيعي أو المرضي. هذه الطريقة تفتح طريقا جديدا لدراسة البيولوجيا متعاطفة وعلم الأمراض منذ أنه من الممكن الآن الحصول على خزعات من الخلايا العصبية المتعاطفة من البشر بسهولة.
