Sağlık durumunu iyileştirmek için botanik kullanma uygulaması binlerce yıl öncesine dayanıyor. Son zamanlarda, artan talep, sürdürülemez hasat uygulamaları ve iklim değişikliği ile birleştiğinde, tedarik zinciri üzerinde bir stres yerleştirdik. Bu nedenle, botanik zina giderek büyüyen bir endişe haline geliyor, botanik kimlik kalite kontrolünün giderek önemli bir parçası haline.
İdeal olarak, tanımlama kaynağa mümkün olduğunca yakın gerçekleştirilir, böylece kaynaklar doğru kimlik materyaline verimli bir şekilde tahsis edilebilir. Botanik tanımlama için çeşitli yaklaşımlar vardır. Geleneksel olarak, botanik tanımlama morfolojik değerlendirme ve kimyasal analitik yöntemlerle gerçekleştirilir.
Morfolojik tanımlama, bitki malzemelerinin makroskopik ve mikroskobik özelliklerindeki farklılıklara dayanmaktadır. Ancak, iyi eğitimli bir botanikçi gerektirir ve toz botanik malzemelere uygulanması sınırlıdır. Farmakope ve laboratuvarlarda kimyasal analitik yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak aletlerin boyutu ve çevre gereksinimleri nedeniyle saha testleri için ideal değildir.
Son zamanlarda genomik yöntemler, bitki materyallerindeki genomik bilgilerin yüksek sadakati ve özgüllüğü nedeniyle botanik türlerin tanımlanması için alternatif bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Moleküler tanı araçları artık taşınabilir cihazlar şeklinde kullanılabilir ile, bu yaklaşım alan uygulaması için mümkün hale gelir. Bu protokolün amacı, taşınabilir bir qPCR sistemi kullanarak, laboratuvar ekipmanı ve uzmanlığının sınırlı olduğu durumlarda, botanik malzeme sağlayan çiftlik gibi durumlarda botanik tanımlama yöntemi ni tanıtmaktır.
Matricaria papatya, yaygın Alman papatya olarak bilinen, yüzyıllardır sağlığı teşvik etmek için bir bitkisel ilaç olarak kullanılmaktadır. Mevcut yöntemin özgüllüğünü göstermek için, Roma papatya olarak bilinen başka bir yaygın olarak kullanılan papatya çiçek Alman papatya farklılaşması, karşılaştırma için dahildir. Alan tanımlama prosedürü bir Alman papatya çiftliğinin ortasında gösterilmiştir.
Düz ve yatay bir yüzeye sahip bir test alanı ayarlayın. Papatya çiçek alanında bitkilerin çoğunluğunun özelliklerini yansıtan temsili bir bitki tanımlayın. Steril eldiven kullanarak temsili bitki bir çiçek kafası seçin.
Numuneyi 2,0 mililitrelik toplama tüpüne yerleştirin. Aynı bitkiden yaklaşık 0,5 ila 0,7 santimetre uzunluğunda bir broşürü tekrarlayın ve toplayın. Kuru banyo kuluçka makinesini 95 dereceye ısıtın.
Her toplama tüpüne, bitki DNA ekstraksiyon kitinden 100 mikrolitre ekstraksiyon çözeltisi ekleyin. Daha iyi DNA ekstraksiyon verimliliği için, bir doku pestisit kullanarak örnek eziyet. Tüpü kapatın.
Botanik dokunun ekstraksiyon işlemi boyunca ekstraksiyon çözeltisi ile kaplı olduğundan emin olun. Toplama tüplerini önceden ısıtılmış kuru banyo kuluçka makinesine yerleştirin ve toplama tüplerini 10 dakika boyunca 95 derecede kuluçkaya yatırın, 10 dakika sonra tüpleri kuru banyo kuluçka makinesinden alın. DNA çıkarma kitinden 100 mikrolitre seyreltme çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı borulandırarak karıştırın.
Broşür çıkarma için aynı adımı tekrarlayın. Çözeltiyi daha fazla karıştırmak için sallayın. Bitki sorunu genellikle bu tedaviden sonra bozulmuş gibi görünmüyor.
Sıvı rengi değişebilir ve bulutlu olabilir. QPCR alet termobisiklet koşullarını, ilk denatürasyon için sabit bir sıcaklık adımı ile başlayan, ardından 25 döngü amplifikasyon ile başlayan ve yüksek çözünürlüklü bir erime eğrisi elde etmek için sıcaklık rampasıyla sona eren tablo bire göre yapılandırın. QPCR ana karışımını ve ikinci tabloda listelenen astarları kullanmadan önce oda sıcaklığında eritin.
Her kuyuya yüklenecek reaksiyonu planlayın. Hedef türlerle pozitif kontroller, hedef olmayan türler ile pozitif kontroller, numuneler ve negatif kontroller içeren kuyular. Bu örnekte, 10 kuyu, Beş Alman papatya tanımlama testi ve roma papatya tanımlama testi için başka bir beş kullanılır.
Türlerin tanımlama testi her türü için, bir kuyu hedeflenen türler referans malzemeden çıkarılan DNA ile pozitif kontrol içerir, bir kuyu hedeflenmemiş türler referans malzemeden çıkarılan DNA ile pozitif kontrol içerir, iki kuyu alandan çıkarılan çiçek ve yaprak DNA örnekleri ile doldurulur, ve bir kuyu negatif kontrol için ayrılmıştır. Tablo üç her iyi türü açıklar. Her botanik tür tanımlama testi için tablo dört göre bir reaksiyon ana karışımı hazırlayın.
Tipik bir reaksiyon ana karışımı evrensel qPCR ana karışımı, iki kez, ileri ve ters türler belirli astarlar ve nükleaz içermeyen su içerir. Kullanmadan önce pipetleme ile reaksiyon ana karışımını iyice karıştırın. PCR reaksiyon kartuşu yüzeyini düz ve sabit bir yüzeye yerleştirin.
Burada tanımlanan kuyulara göre kartuş kuyularına bir önceki adımda yapılandırılan reaksiyon ana karışımının 18 mikrolitresini yükleyin. Bu gösteri için, GC testi için etiketlenmiş kuyulara Alman papatya kimlik testi reaksiyonu ana karışımını ekleyin, GCT 1, üç, beş, yedi, dokuz, ve Roma papatya kimlik testi reaksiyon ana karışımı rc testi için etiketlenmiş kuyular içine, RCT kuyuları iki, dört, altı, sekiz, 10. DNA ekstraksiyon tüplerinin süpernatantından iki mikrolitre örnek DNA aktarın ve önceden çıkarılmış DNA pozitif kontrolleri qPCR ana karışımı ile önceden yüklenmiş kartuş kuyularına aktarın.
QPCR ana karışımına her DNA şablonu ekledikten sonra, çözeltiyi pipetleme ile hafifçe karıştırın. Kartuşunu yapışkan filmle dikkatlice kapatın. Kartuşu termobisiklet odasına yükleyin ve kapatın.
QPCR aracını çalışacak şekilde ayarlayın. Geçerli protokolde, hedef parçaların gerçek zamanlı olarak amplifikasyon ölçmek için intercalating boya kullanılır. Ct değeri, floresan sinyalin önceden tanımlanmış eşiği geçmesi için gereken döngü sayısı olarak tanımlanır.
25 döngüden daha küçük bir Ct değeri pozitif amplifikasyon olarak kabul edildi. Bu şekilde, Roma pozitif kontrolü sadece Roma papatya tanımlama testinde güçlendirilmiştir, ancak Alman papatya tanımlama testinde değil. Alman papatya pozitif kontrol ve alan örnekleri sadece Alman papatya tanımlama testinde yükseltildi, ancak Roma papatya tanımlama testinde güçlendirildi.
Negatif kontrol her iki testte de yükseltilemedi. Pozitif kontrol ve numunelerde spesifik amplifikasyonu doğrulamak için, her kuyudan PCR ve ürün fraksiyonları laboratuvarda %2 agarose jel üzerinde çalıştırıldı. Ct değeri 25'ten az olan tüm kuyular, Alman papatyası ve Roma papatyası arasında farklılık gösteren beklenen boyutlarda amlikon vermiştir.
Şeritlerin geri kalanı, saha testlerinde gözlenen bu kuyular için floresan sinyal yokluğu ile uyum içinde, belirli bir amplifikasyon ürünü gösterdi. PCR amplifikasyonunun ardından floresan sinyali izlemek için kullanılan aynı yazılım kullanılarak bir erime eğrisi analizi yapıldı. Sıcaklığın artmasıyla, çift iplikli amfisler ayrışmaya başlar ve floresan şiddetinin azalmasına neden olur.
Floresan yoğunluğu değişiklikleri, Alman papatyasının karakteristik erime zirveleri ile Roma papatyasından daha fazla farklılaşması için erime tepe eğrilerine dönüştürüldü. Bu rakam, Alman papatya pozitif kontrolü erime zirvesi 85.6 santigrat derece ve Roma papatya pozitif kontrolü erime zirvesinden farklıdır. Alan örneklerinden alınan PCR amplicon'lar, Alman papatya pozitif kontrolüne yakın erime zirveleri üretir.
Alan numunesinin kimliği, kontrollere uyan spesifik amplifikasyon ve karakteristik erime sıcaklığına göre belirlenir. Bu örnekte, tarlada toplanan hem çiçek hem de yaprak Matricaria chamomilla, Alman papatyası olarak tanımlanmıştır. Bu iki örnek için Roma papatya test sonuçları negatiftir.
Protokol, taşınabilir bir qPCR sistemi kullanılarak alman papatyasının sahada tanımlanmasını göstermektedir. Benzer yöntemler test edilebilir botanik portföyünü genişletmek için geliştirebilirsiniz. Bu videonun bilim adamları için değerli eğitim materyalleri sağlayacağını umuyoruz, hatta uzman olmayan kişiler de sahada veya sınırlı laboratuvar ekipmanı olan bir ortamda botanik tanımlama yapmak için.
DNA tabanlı alan tanımlama testleri sadece laboratuvar analizine uyan son derece doğru sonuçlar üretmekle kalmamış, aynı zamanda laboratuvarda uygulanan geleneksel yöntemlerle ilişkili zaman ve maliyetleri de azaltır.
