הנוהג של שימוש בצמחים כדי לשפר את הבריאות שתחילתה אלפי שנים. לאחרונה, הביקוש הגובר, יחד עם שיטות קציר שאינן בנות קיימא ושינויי אקלים, הטילו לחץ על שרשרת האספקה. בגלל זה, ניאוף בוטני הופך לדאגה גוברת, מה שהופך את הזיהוי הבוטני לחלק חיוני יותר ויותר של בקרת איכות.
באופן אידיאלי, הזיהוי מתבצע קרוב ככל האפשר למקור, כך שניתן להקצות משאבים ביעילות לחומר הזהות הנכונה. ישנן מספר גישות לזיהוי בוטני. באופן מסורתי, זיהוי בוטני מתבצע באמצעות הערכה מורפולוגית ושיטות אנליטיות כימיות.
הזיהוי המורפולוגי מבוסס על הבדלים בתכונות מקרוסקופיות ומיקרוסקופיות של חומרים צמחיים. עם זאת, הוא דורש בוטנאי מאומן היטב ויילומנו לאבקת חומרים בוטניים מוגבל. שיטות אנליטיות כימיות נמצאות בשימוש נרחב בפרמקופייאס ובמעבדות, אך אינן אידיאליות לבדיקות שדה בשל גודל המכשירים ודרישות הסביבה.
לאחרונה, שיטות גנומיות התגלו כטכניקה חלופית לזיהוי מינים בוטניים בשל הנאמנות הגבוהה והספציפיות של מידע גנומי בחומרים צמחיים. עם כלי אבחון מולקולרי זמין כעת בצורה של מכשירים ניידים, גישה זו הופכת אפשרית עבור יישום שדה. מטרת פרוטוקול זה היא להציג שיטה לזיהוי בוטני במצבים שבהם הגישה לציוד המעבדה ולמומחיות מוגבלת, כגון החווה המספקת את החומר הבוטני, באמצעות מערכת qPCR ניידת.
קמומילה מטריקאריה, הידוע בכינויו קמומיל גרמני, שימש תרופה צמחית כדי לקדם את הבריאות במשך מאות שנים. כדי להדגים את הספציפיות של השיטה הנוכחית, ההידול של קמומיל גרמני מ פרח קמומיל נפוץ אחר, המכונה קמומיל רומי, כלול להשוואה. הליך זיהוי השדה מוכח באמצע חוות קמומיל גרמנית.
הגדר אזור בדיקה בשדה עם משטח שטוח ואופקי. זהה צמח מייצג המשקף את המאפיינים של רוב הצמחים בשדה פרח קמומיל. בחר ראש פרח מהצמח הייצוגי באמצעות כפפות סטריליות.
מניחים את הדגימה לתוך צינור איסוף 2.0 מיליליטר. יש לחזור ולאסוף עלון באורך של כ-0.5 עד 0.7 ס"מ מאותו צמח. מחממים את חממת האמבטיה היבשה ל-95 מעלות.
לכל צינור איסוף, להוסיף 100 microliters של פתרון החילוץ מתוך ערכת מיצוי DNA הצמח. ליעילות מיצוי דנ"א טובה יותר, יש לטחון את הדגימה באמצעות עלה רקמה. סגור את הצינור.
ודא כי הרקמה הבוטנית מכוסה על ידי פתרון החילוץ לאורך כל תהליך החילוץ. מניחים את צינורות האיסוף באינקובטור אמבטיה יבש שחומם מראש, ומטמיעה את צינורות האיסוף ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאחר 10 דקות, מוציאים את הצינורות מחממת האמבטיה היבשה. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של פתרון הדילול מתוך ערכת מיצוי הדנ"א ומערבבים את הפתרון על ידי צינור למעלה ולמטה מספר פעמים.
חזור על אותו שלב לחילוץ עלונים. לנער כדי לערבב את הפתרון עוד יותר. הבעיה הצמחית בדרך כלל לא נראה מושפל לאחר טיפול זה.
הצבע הנוזלי עשוי להשתנות ולהיות מעונן. הגדר את תנאי התרמוצ'יליזציה של מכשיר qPCR על פי טבלה אחת, אשר מתחיל עם צעד טמפרטורה קבוע עבור denaturation הראשונית, ואחריו 25 מחזורים של הגברה ומסתיים עם הטמפרטורה ramping כדי לקבל עקומת התכה ברזולוציה גבוהה. הפשר את תערובת המאסטר qPCR ואת פריימרים המפורטים בטבלה 2 בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
תכנן את התגובה שתטען בכל באר. בארות המכילות בקרות חיוביות עם מיני המטרה, בקרות חיוביות עם מינים שאינם מטרה, דגימות ובקרות שליליות. בדוגמה זו, 10 בארות משמשות, חמש למבחן זיהוי קמומיל הגרמני ועוד חמש למבחן זיהוי קמומיל הרומי.
עבור כל סוג של בדיקת זיהוי מינים, באר אחת מכילה שליטה חיובית עם דנ"א המופק מחומר הייחוס למינים הממוקדים, באר אחת מכילה שליטה חיובית עם דנ"א המופק מחומר התייחסות למינים לא ממוקדים, שתי בארות מלאות בדגימות דנ"א של פרחים ועלים המופקות מהשדה, באר אחת מוקצית לשליטה שלילית. טבלה 3 מתארת כל סוג באר. הכינו תערובת אמן תגובה לפי טבלה 4 לכל בדיקת זיהוי מינים בוטניים.
תערובת אב טיפוסית לתגובה מכילה תערובת ראשית אוניברסלית של qPCR, פעמיים, פריימרים ספציפיים למינים קדמיים והפוךים, ומים נטולי גרעין. ערבב ביסודיות את תערובת אמן התגובה על ידי צינורות לפני השימוש. מקם את מחסנית תגובת PCR עם הפנים כלפי מעלה על משטח שטוח ויציב.
טען 18 מיקרוליטרים של תערובת תבנית הבסיס לתגובה שהוגדרה בשלב הקודם לתוך בארות המחסנית בהתאם ל בארות שהוגדרו כאן. להדגמה זו, להוסיף את התערובת הראשית של תגובת מבחן זיהוי קמומיל הגרמנית לתוך בארות שכותרתו עבור מבחן GC, GCT בארות אחת, שלוש, חמש, שבע, תשע, ואת מבחן קמומיל הרומית מבחן תגובת תמהיל לתוך בארות שכותרתו עבור מבחן RC, RCT בארות שתיים, ארבע, שש, שמונה, 10. להעביר שני microliters של DNA מדגם מן supernatant של צינורות מיצוי DNA ופקדים חיוביים DNA שחולצו מראש לתוך בארות מחסנית טעון מראש עם תערובת ראשית qPCR.
לאחר הוספת כל תבנית DNA לתערובת הראשית של qPCR, מערבבים בעדינות את הפתרון על ידי צינורות. בזהירות לאטום את המחסנית עם סרט דבק. טען את המחסנית לתא התרמוצ'יקלה וסגור אותה.
הגדר את כלי ה- qPCR לפעול. בפרוטוקול הנוכחי, צבע משולב משמש למדידת הגברה של שברי מטרה בזמן אמת. הערך Ct מוגדר כמספר המחזורים הדרושים לאות הפלואורסצנטי כדי לחצות את הסף המוגדר מראש.
ערך Ct פחות מ 25 מחזורים נחשב הגברה חיובית. בנתון זה, השליטה החיובית הרומית הוגברה רק במבחן זיהוי קמומיל רומי, אך לא במבחן זיהוי קמומיל הגרמני. השליטה החיובית בקמומיל הגרמנית ודגימות השדה הוגברו רק במבחן זיהוי קמומיל הגרמני, אך לא במבחן זיהוי קמומיל רומי.
הבקרה השלילית לא הוגברה באף אחד מהמבחןים. כדי לאשר עוד יותר הגברה ספציפית בבקרות ודגימות חיוביות, שברים של PCR ומוצרים מכל באר נוהלו על 2%agarose ג'ל במעבדה. כל בארות עם ערך Ct פחות מ 25 אמפילונים הניבו בגדלים הצפויים שלהם, אשר נבדלים בין קמומיל גרמני קמומיל הרומי.
שאר הנתיבים לא הראו שום מוצר הגברה ספציפי, בהסכמה עם היעדר אות פלואורסצנטי ל בארות אלה כפי שנצפה בבדיקות שדה. לאחר הגברה PCR, ניתוח עקומת התכה בוצע באמצעות אותה תוכנה ששימשה לניטור אות הפלואורסצנטי. עם עליית הטמפרטורה, אמפיליקונים דו-גדיליים מתחילים להתנתק, וכתוצאה מכך הירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות.
השינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות הוסבו עוד יותר לעקומות שיא נמסות לבידול נוסף של קמומיל גרמני מקמומיל רומי על ידי פסגות ההיתוך האופייניות להם. בנתון זה, שיא ההיתוך של השליטה החיובית בקמומיל הגרמני הוא 85.6 מעלות צלזיוס והוא נבדל מהשיא הנמס של השליטה החיובית בקמומיל הרומי. אמפיליקונים PCR מדגימות שדה לייצר פסגות נמסות קרוב לשליטה חיובית קמומיל הגרמני.
זהות דגימת השדה נקבעת בהתבסס על הגברה ספציפית וטמפרטורת התכה אופיינית התואמת לפקדים. בדוגמה זו, הן פרח ועלה שנאספו בשדה מזוהים כמו קמומילה מטריקאריה, קמומיל גרמני. תוצאות בדיקת קמומיל הרומית עבור שתי דגימות אלה הן שליליות.
הפרוטוקול מדגים את הזיהוי של קמומיל גרמני בשטח באמצעות מערכת qPCR ניידת. שיטות דומות אנו יכולים לפתח כדי להרחיב את הפורטפוליו של צמחים שניתן לבדוק. אנו מקווים שסרטון זה יספק חומרי הדרכה יקרי ערך למדענים, אפילו לא מומחים לביצוע זיהוי בוטני בשטח או בסביבה עם ציוד מעבדה מוגבל.
בדיקות זיהוי שדה מבוססות DNA לא רק מייצרות תוצאות מדויקות ביותר התואמות לניתוח מעבדה, אלא גם מפחיתות את הזמן והעלויות הכרוכים בשיטות מסורתיות המבוצעות במעבדה.
