健康を改善するために植物を使用する習慣は何千年も前にさかのぼります。最近、需要の増加は、持続不可能な収穫慣行や気候変動と相まって、サプライチェーンにストレスを与えています。このため、植物の不調が懸念されつつあり、植物の識別は品質管理のますます不可欠な部分となっています。
理想的には、識別はソースにできるだけ近く行われるため、リソースを適切な ID の材料に効率的に割り当てることができます。植物の識別には多くのアプローチがあります。従来、植物同定は形態学的評価と化学分析法によって行われる。
形態学的同定は、植物材料の巨視的および顕微鏡的特徴の違いに基づいている。しかし、それは十分な訓練を受けた植物学者を必要とし、粉末植物材料への適用は限られています。化学分析法は、薬理工学や研究所で広く使用されていますが、機器の大きさや環境要件により、現場試験には適していません。
近年、植物材料におけるゲノム情報の高い忠実度と特異性により、植物種同定の代替技術としてゲノム法が出現しています。分子診断ツールをポータブルデバイスの形で利用できるようになったので、このアプローチは、フィールドアプリケーションのために可能になります。このプロトコルの目的は、移植性qPCRシステムを使用して、植物材料を供給する農場など、実験室の機器や専門知識へのアクセスが制限されている状況で植物同定の方法を導入することです。
マトリカリアシャモミラ, 一般的にドイツのカモミールとして知られています, 何世紀にもわたって健康を促進するためのハーブ薬として使用されています。.現在の方法の特異性を実証するために、ローマのカモミールとして知られている別の一般的に使用されるカモミールの花からのドイツのカモミールの分化が比較のために含まれています。フィールド識別手順は、ドイツのカモミール農場の真ん中で実証されています。
平らで水平な面を持つフィールドにテストエリアを設定します。カモミールの花畑の植物の大半の特性を反映する代表的な植物を特定します。滅菌手袋を使用して代表的な植物から花の頭を選びます。
サンプルを2.0ミリリットルの回収チューブに入れる。同じ植物から約0.5〜0.7センチメートルのリーフレットを繰り返し収集します。乾式バスインキュベーターを摂氏95度に予熱します。
各回収管に、植物DNA抽出キットから100マイクロリットルの抽出液を加える。DNA抽出効率を向上するために、組織の害虫を使用してサンプルを粉砕します。チューブを閉じます。
植物組織が抽出プロセス全体を通して抽出液で覆われていることを確認します。コレクションチューブを予熱乾燥式バスインキュベーターに入れ、10分後に摂氏95度で回収管を10分間インキュベートし、乾燥浴インキュベーターからチューブを取り出します。DNA抽出キットから100マイクロリットルの希釈液を加え、上下にピペットを数回加えることで溶液を混合します。
リーフレット抽出についても同じ手順を繰り返します。さらに溶液を混ぜるために振ります。植物の問題は、通常、この治療後に劣化しているようには見えません。
液体の色が変わり、曇りになる可能性があります。表1に従ってqPCR器のサーモサイクリング条件を設定し、最初の変性のための一定温度ステップから始まり、25サイクルの増幅が続き、温度ランピングで終わり、高解像度の融解曲線を得る。使用前に、表2に記載されているqPCRマスターミックスとプライマーを解凍します。
各井戸にロードされる反応を計画します。標的種との陽性対照を含むウェル、非標的種、サンプルおよび陰性対照を有する陽性対照。この例では、10の井戸が使用され、5つはドイツのカモミール識別試験に用いられ、もう5つはローマのカモミール識別試験のために使用される。
各種同定試験の種類ごとに、1つの井戸は、対象種の参照材料から抽出されたDNAを有する陽性対照を含み、1つの井戸は非標的種基準物質から抽出されたDNAを有する陽性対照を含み、2つの井戸はフィールドから抽出された花および葉のDNAサンプルで満たされ、1つの井戸は否定的な対照のために割り当てられる。表 3 は、各ウェル・タイプについて説明しています。各植物種同定試験用に表4に従って反応マスターミックスを用意する。
典型的な反応マスターミックスは、普遍的なqPCRマスターミックス、2回、順方向および逆種特異的プライマー、およびヌクレアーゼフリー水が含まれています。使用前にピペッティングして反応マスターミックスを十分に混合した。PCR 反応カートリッジの表面を平らで安定した面に置きます。
ここで定義されたウェルに従って、前のステップで構成された反応マスターミックスの18マイクロリットルをカートリッジウェルにロードします。このデモンストレーションでは、ドイツのカモミール同定試験反応マスターミックスをGCテスト用にラベル付けされたウェル、GCTを井戸1、3、5、7、9、およびローマカモミール同定試験反応マスターミックスをRCテスト用にラベル付けされたウェルに、RCTをウェル2、4、6、8、10に追加します。DNA抽出チューブの上清から2マイクロリットルのサンプルDNAを、あらかじめ抽出したDNA陽性制御をqPCRマスターミックスでプリロードされたカートリッジウェルに移します。
各DNAテンプレートをqPCRマスターミックスに加えた後、ピペット処理で溶液を軽く混ぜます。カートリッジを粘着フィルムで丁寧に密封します。カートリッジをサーモサイクリング室に積み込み、閉じます。
実行する qPCR インストゥルメントを設定します。現在のプロトコルでは、中間色素を使用して、標的断片の増幅をリアルタイムで測定します。Ct値は、蛍光シグナルが事前定義された閾値を超えるために必要なサイクル数として定義されます。
25サイクル未満のCt値は、陽性増幅と考えられた。この図では、ローマ陽性対照はローマのカモミール同定試験でのみ増幅されたが、ドイツのカモミール同定試験では増幅されなかった。ドイツのカモミール陽性対照およびフィールドサンプルは、ドイツのカモミール同定試験でのみ増幅されたが、ローマのカモミール同定試験では増幅されなかった。
どちらの試験でも陰性対照は増幅されなかった。陽性制御およびサンプルにおける特異的な増幅をさらに確認するために、各ウェルからのPCRおよび産物の画分を実験室で2%アガロースゲルで実行した。Ct値が25未満のすべてのウェルは、ドイツのカモミールとローマのカモミールの間で異なる予想サイズでアンプリコンを生み出しました。
残りの車線は、フィールドテストで観察されたこれらのウェルの蛍光シグナルの欠如と一致して、特定の増幅産物を示さなかった。PCR増幅後、蛍光シグナルをモニタリングするために使用したのと同じソフトウェアを用いて融解曲線解析を行った。温度の上昇に伴い、二本鎖アンプリコンは解化を開始し、蛍光強度の低下をもたらす。
蛍光強度の変化はさらに、その特徴的な融解ピークによってローマのカモミールからドイツのカモミールをさらに分化するために融解ピーク曲線に変換された。この図では、ドイツのカモミール正の対照の融解ピークは摂氏85.6度であり、それはローマのカモミール正の対照の融解ピークとは異なる。フィールドサンプルのPCRアンプリコンは、ドイツのカモミール陽性制御に近い融解ピークを生成します。
フィールドサンプルのアイデンティティは、制御に一致する特定の増幅と特性融解温度に基づいて決定されます。この例では、畑で採取された花と葉の両方が、マトリカリア・シャモミラ、ドイツのカモミールとして識別されます。これら2つのサンプルのローマカモミール試験結果は陰性である。
このプロトコルは、携帯用qPCRシステムを使用して、フィールド内のドイツのカモミールの同定を示しています。同様の方法を開発して、テストできる植物のポートフォリオを拡大することができます。このビデオは、現場や限られた実験室機器を持つ環境で植物の同定を行う非専門家でさえ、科学者にとって貴重なトレーニング資料を提供することを願っています。
DNAベースのフィールド同定試験は、実験室での分析に一致する高精度な結果を生み出すだけでなく、実験室で行われる従来の方法に関連する時間とコストを削減します。
