Практика использования растительных растений для улучшения здоровья восходит тысячи лет. В последнее время возросшей спрос в сочетании с неустойчивой практикой уборки урожая и изменением климата сделал все возможное для цепочки поставок. Из-за этого, ботаническая фальсификация становится растущей проблемой, что делает ботаническую идентификацию все более важной частью контроля качества.
В идеале идентификация выполняется как можно ближе к источнику, поэтому ресурсы могут быть эффективно распределены на материал правильной идентификации. Существует ряд подходов к ботанической идентификации. Традиционно ботаническая идентификация проводится с помощью морфологической оценки и химических аналитических методов.
Морфологическая идентификация основана на различиях в макроскопических и микроскопических особенностях растительных материалов. Тем не менее, он требует хорошо обученный ботаник и его применение к порошкообразным растительным материалам ограничено. Химические аналитические методы широко используются в фармакопеях и лабораториях, но не идеально подходят для полевых испытаний из-за размера приборов и потребностей в окружающей среде.
В последнее время геномные методы стали альтернативным методом идентификации ботанических видов из-за высокой точности и специфичности геномной информации в растительных материалах. С помощью молекулярно-диагностических инструментов, доступных в виде портативных устройств, этот подход становится возможным для применения на местах. Цель этого протокола заключается в внедрении метода ботанической идентификации в ситуациях, когда доступ к лабораторному оборудованию и экспертизе ограничен, например, ферма, поставляющей ботанический материал, с использованием портативной системы qPCR.
Matricaria ромашки, широко известный как немецкая ромашка, был использован в качестве травяного лекарства для укрепления здоровья на протяжении веков. Чтобы продемонстрировать специфику нынешнего метода, для сравнения включена дифференциация немецкой ромашки от другого широко используемого цветка ромашки, известного как римская ромашка. Процедура идентификации поля продемонстрирована в середине немецкой фермы ромашки.
Настройка испытательного полигона в поле с плоской и горизонтальной поверхностью. Определите репрезентативное растение, отражающее характеристики большинства растений в ромашковом цветочном поле. Выберите головку цветка от представительного завода используя стерильные перчатки.
Поместите образец в трубку сбора 2,0 миллилитров. Повторите и соберите листовку длиной от 0,5 до 0,7 сантиметра от того же растения. Разогреть инкубатор сухой ванны до 95 градусов по Цельсию.
К каждой коллекторной трубке добавьте 100 микролитров раствора экстракции из набора для извлечения ДНК растения. Для лучшей эффективности извлечения ДНК, молоть образец с помощью ткани пестик. Закройте трубку.
Убедитесь, что ботаническая ткань покрыта раствором экстракции на протяжении всего процесса экстракции. Поместите трубки коллекции в разогретый инкубатор сухой ванны и инкубировать трубки сбора при 95 градусах по Цельсию в течение 10 минут После 10 минут, возьмите трубки из инкубатора сухой ванны. Добавьте 100 микролитров раствора разбавления из набора для экстракции ДНК и смешайте раствор, несколько раз смахив трубку вверх и вниз.
Повторите тот же шаг для извлечения листовок. Встряхните, чтобы смешать раствор дальше. Проблема растений, как правило, не кажется, деградировали после этой обработки.
Цвет жидкости может измениться и стать облачным. Настройте условия термоциклирования прибора qPCR в соответствии с таблицей, которая начинается с постоянного шага температуры для первоначальной денатурации, а затем 25 циклов усиления и заканчивается повышением температуры для получения кривой плавления с высоким разрешением. Оттепель qPCR мастер смеси и грунтовки, перечисленные в таблице два при комнатной температуре до использования.
План реакции, которые будут загружены в каждой хорошо. Скважины, содержащие положительный контроль с целевыми видами, положительный контроль с нецелеми видами, образцы и отрицательный контроль. В этом примере используются 10 скважин, пять для немецкого теста на идентификацию ромашки и еще пять для римского теста на идентификацию ромашки.
Для каждого типа теста на идентификацию видов, один хорошо содержит положительный контроль с ДНК, извлеченной из целевого вида справочного материала, один хорошо содержит положительный контроль с ДНК, извлеченной из не целевых видов справочного материала, две скважины заполнены цветок и лист ДНК образцов, извлеченных из поля, и один хорошо выделяется для отрицательного контроля. Таблица 3 описывает каждый тип хорошо. Подготовьте смесь мастера реакции согласно таблице 4 для каждого теста идентификации ботанических видов.
Типичная смесь мастера реакции содержит универсальный qPCR мастер смесь, два раза, вперед и обратного вида конкретных грунтовки, и нуклеазы свободной воды. Тщательно смешанные реакции мастер смесь трубопроводов перед использованием. Поместите картридж реакции ПЦР лицом вверх на плоскую и стабильную поверхность.
Загрузите 18 микролитров смеси мастера реакции, настроенной на предыдущем шаге в картриджные скважины в соответствии с скважинами, определенными здесь. Для этой демонстрации, добавить немецкий ромашки идентификации тест реакции мастер смесь в скважины помечены для испытания GC, GCT в скважинах один, три, пять, семь, девять, и римской ромашки идентификации тест реакции мастер смеси в скважины помечены для RC тест, RCT в скважинах два, четыре, шесть, восемь, 10. Передача двух микролитров образцовой ДНК из супернатантов трубок извлечения ДНК и предварительно извлеченного положительного контроля ДНК в картриджные скважины, предварительно загруженные мастер-миксом qPCR.
После добавления каждого шаблона ДНК в мастер-микс qPCR, аккуратно смешайте раствор с помощью пипетки. Аккуратно загерметив картридж клейкой пленкой. Загрузите картридж на термоциклинговую камеру и закройте его.
Установите инструмент qPCR для запуска. В текущем протоколе интеркалирующий краситель используется для измерения усиления фрагментов мишени в режиме реального времени. Значение Ct определяется как количество циклов, необходимых для того, чтобы флуоресцентный сигнал пересек заранее определенный порог.
Значение Ct менее 25 циклов было рассмотрено как положительное усиление. На этом рисунке римский положительный контроль был усилен только в римском тесте на идентификацию ромашки, но не в немецком тесте на идентификацию ромашки. Немецкий положительный контроль ромашки и пробы поля были только усилены в немецком тесте идентификации ромашки, но не в римском тесте идентификации ромашки.
Отрицательный контроль не был усилен ни в одном из испытаний. Для дальнейшего подтверждения специфического усиления в положительном контроле и образцах, фракции ПЦР и продуктов из каждой колодец были запущены на 2%agarose гель в лаборатории. Все скважины со значением Ct менее 25 дали ампликонов при ожидаемых размерах, которые отличаются между немецкой ромашкой и римской ромашкой.
Остальные полосы движения не показали никакого конкретного продукта усиления, в связи с отсутствием флуоресцентного сигнала для этих скважин, как это наблюдалось в ходе полевых испытаний. После усиления ПЦР анализ кривой плавления проводился с использованием того же программного обеспечения, которое использовалось для мониторинга флуоресцентного сигнала. С повышением температуры двухтысячие ампликации начинают разобщаться, что приводит к снижению интенсивности флуоресценции.
Изменения интенсивности флуоресценции были дополнительно преобразованы в кривые пика плавления для дальнейшей дифференциации немецкой ромашки от римской ромашки по их характерным пикам плавления. На этом рисунке пик плавления немецкой ромашки положительного контроля составляет 85,6 градуса по Цельсию и отличается от таяния пика римской ромашки положительным контролем. ПЦР-ампликоны из полевых образцов производят пики плавления вблизи положительного контроля над немецкой ромашкой.
Идентификация образца поля определяется на основе специфического усиления и характерной температуры плавления, которая соответствует контролю. В этом примере, как цветок и лист, собранные в поле определены как Matricaria ромашки, немецкая ромашка. Результаты римского теста ромашки для этих двух образцов являются отрицательными.
Протокол демонстрирует идентификацию немецкой ромашки в полевых условиях с помощью портативной системы qPCR. Подобные методы мы можем разработать, чтобы расширить портфолио растительных, которые могут быть проверены. Мы надеемся, что это видео обеспечит ценные учебные материалы для ученых, даже не-экспертов для выполнения ботанической идентификации в полевых условиях или в среде с ограниченным лабораторным оборудованием.
Тестирование на основе ДНК на местах не только дает очень точные результаты, которые соответствуют лабораторному анализу, но и сокращают время и затраты, связанные с традиционными методами, выполняемыми в лаборатории.
