Bu çalışma Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK) tarafından F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M .), Amerikan Diyabet Derneği Yenilikçi Temel Bilim Ödülü (#1-19-IBS-192'den G.J..M.)'ye) ve NIDDK destekli Beslenme Obezitesi Araştırma Merkezi (DK-035816), Diyabet Araştırma Merkezi (DK-017047) ve Diyabet, Washington Üniversitesi'nde Obezite ve Metabolizma Eğitimi T32 DK0007247 (T.H.M) hibesi.

Tüm prosedürler Ulusal Sağlık Enstitüleri, Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Rehberi uyarınca onaylandı ve washington Üniversitesi'nde hem Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) hem de Çevre Sağlığı ve Güvenliği tarafından onaylandı.
1. Açılı koordinatların hesaplanması
<ol><li>Bir koronal beyin atlası kullanarak, hipotenüsün hedef ilgi bölgesinden geçmesi için sağ üçgeni işaretleyin. Temsili örnekte (Şekil 1), hipotalamik ventromedial çekirdek (VMN) koronal orta çizgiden 15 ° açıyla hedeflenmiştir. NOT: Şekil 1'de gösterilen dönme ekseninin yerleşimi (ve dolayısıyla C tarafının uzunluğu) rastgeledir ve herhangi bir beyin bölgesini hedef almak için değiştirilebilir. Bu mantıksız görünse de, protokoldeki daha sonraki adımlar başın z eksenindeki konumunu, bu noktanın stereotaktik dönme merkeziyle hizalanacak şekilde ayarlayacaktır (bkz. bölüm 6). Bununla birlikte, baş tutucu aparatının fiziksel kısıtlamaları nedeniyle 15 ° 'lik bir koronal dönüş açısını aşmamanız önerilir.</li>
	<li>İstenen açıyı (a) ve B tarafının tahmini uzunluğunu belirleyin ve A ve C taraflarının uzunluğunu hesaplamak için trigonometri kullanın. Bu adım, dönüş sırasında başın düzgün bir şekilde konumlandırılması için önemlidir. NOT: Şekil 1'dekiörnekte, atlas kılavuz çizgileri B tarafının uzunluğuna yaklaşık olarak kullanılır ve 7.576 mm uzunluk elde edilir. Bu bilgiler, A tarafının uzunluğunu hesaplamak için kullanılır: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ01.jpg"> Bu örnekte, 2,03 mm, baş 15° döndürüldüğünde fiberoptiküllerin beyne girdiği orta çizgiden R/M mesafesini gösterir.<ol>
<li>İsteğe bağlı olarak, D/V koordinatını yaklaşık olarak yaklaşık olarak C tarafının uzunluğunu hesaplayın: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ02.jpg"> NOT: 1) Hipotenozun uzunluğu (C) enjeksiyon derinliğini temsil etmez, ancak düz enjeksiyonlar için B tarafına karşı artan uzunluğa uyum sağlayacak şekilde ayarlanması gerekebilecek D /V koordinatının belirlenmesinde yardımcı olacaktır. Bu nedenle, D/V koordinatını optimize etmek için test enjeksiyonlarının yapılması önerilir. 2) VMN'yi hedefleyen bu örnekte, iki koordinat kümesi elde edilir: biri açılı olmayan mikroenjeksiyon için (A/P = -1.4, R/L = 0°'de 0,4, D/V = -5,7) ve açılı fiberoptik implantasyon için bir tane (A/P = -1,4, R/L = 15°'de 0,0, D/V = -5,4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Açılı prosedür için stereotaksın hazırlanması
<ol><li>Stereotaktik çerçevenin ve mikromanipülatörnün kalibre edildiğini onaylayın (tam protokol için Kopf kılavuzuna bakın).</li>
	<li>Orta yükseklik göstergesini baş tutucu taban plakasının soketine yerleştirin.</li>
	<li>Takım tutucusunda merkezleme kapsamını sabitleyin, ardından kapsamı görün. Artılar hizalanana ve ölçer nişangahlara odaklanana kadar mikromanipülatörnün konumunu ayarlayın. NOT: Bu adım sırasında, kapsam baş tutucunun dönme merkezinin odak düzlemine yer almaktadır. Kurulduktan sonra, mikromanipülatör kalan adımlar sırasında hareket ettirilememelidir.</li>
	<li>Kulak çubuklarını tutuculara yerleştirin ve her iki taraftaki gösterge çizgileri 0'da olacak şekilde ortalayın (Şekil 3A).</li>
	<li>Merkez yükseklik göstergesinin çapraz işaretinin üzerindeki x veydüzlemlerindeki kulak çubuklarını orta hizalamak için baş tutucudaki medial-lateral ve ön-arka düğmeleri kullanın (Şekil 3A).</li>
	<li>Kulak çubuğu konumunu z ekseninde hizalamak için kulak çubuklarını tutucudan çıkarın ve orta yükseklik ölçeri çıkarın. Kulak çubuklarını değiştirin ve 0'da tekrar ortalayın.</li>
	<li>Dürbünle görün. Sırasıyla dikey vites değiştirme düğmesini (Şekil 3B) ve koronal eğim düğmesini kullanarak, dürbün çaprazları koronal dönüş boyunca kulak çubukları arasında ortalanana kadar kulak çubuklarını alçaltır ve döndürün.</li>
	<li>Stereotaks artık kalibre edilmiş ve hazırdır. Baş tutucunun pozisyonunda daha fazla ayarlama yapmayın.</li>
</ol>3. Enjeksiyon/implantasyon için malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Tüm aletlerin, cerrahi aletlerin ve malzemelerin sterilize olduğundan ve stereotaksın yanındaki steril bir cerrahi alana yerleştirildiklerinden emin olun.</li>
	<li>Viral yapıları biyogüvenlik seviyelerine ve ilgili kurumsal biyogüvenlik düzenleyici gerekliliklerine göre ele alın ve saklayın.</li>
	<li>Uygun elleçleme uygulamalarını ve kişisel koruyucu ekipmanları kullanmaya özen ederek virüsü şırınna çekin.</li>
</ol>4. Anestezi
<ol><li>Ameliyattan önce farenin vücut ağırlığını kaydedin.</li>
	<li>Isoflurane kullanarak fareyi derinlemesine uyuşturun.</li>
	<li>Kıtırlık tepkisi olmayana kadar bir parmak sıkışma testi yaparak farenin derinlemesine uyuşturulmasını sağlayın. Hayvan güçlü refleksler göstermeye devam ederse, anestezi konsantrasyonu ve / veya süresini artırın.</li>
	<li>Ameliyat sırasında nemli tutmak için her göze göz merhemi uygulayın.</li>
	<li>Saç kesme makinesi ile kafa derisini kulakların hemen arkasından gözlerin hemen arkasına tıraş edin.</li>
	<li>Fareye IACUC onaylı analjezik sağlayın.</li>
	<li>Cerrahi işlem boyunca hayvanı sürekli izleyin ve termal destek sağlayın.</li>
</ol>5. Cerrahi prosedür
<ol><li>Üst kesici dişleri ısırık çubuğundaki boşluğa yerleştirerek, dilin ısırık çubuğunun altında olduğundan emin olarak başı baş tutucuya yerleştirin.</li>
	<li>Kulak çubuklarını dış işitsel meatus'a hafifçe yerleştirerek başı kulak çubuklarına sabitleyin ve kulak çubuklarının simetrik olarak yerleştirilmesini sağlayın (yetişkin bir fare için genellikle üç ila dört). Bu adım, başın sabit ve dönme için ortalanmış olduğundan emin olmak için kritik öneme sahiptir.</li>
	<li>Aseptik olarak traş kesi bölgesini üç alternatif betadin ve alkol sürüntümü ile veya alternatif kurumsal olarak onaylanmış cerrahi bölge hazırlığı ile hazırlayın.</li>
	<li>Steril bir cerrahi alanı korumak ve ameliyat sonrası enfeksiyon riskini azaltmak için hayvanın üzerine cerrahi bir örtü yerleştirin.</li>
	<li>Kafa derisinin sagittal orta çizgisi boyunca bir kesi yaparak kafatasını ortaya çıkarın. Herhangi bir fasyayı çıkarmak ve dikişleri açığa çıkarmak için kafatasının yüzeyini hafifçe kazıyın. NOT: Dikiş çizgilerinin görselleştirilmesi zorsa, dikiş görselleştirmesini iyileştirmek için steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanılarak kafatasına hidrojen peroksit uygulanabilir.</li>
	<li>Ortalama kapsamını tutucuya yerleştirin ve artı işareti bregma üzerine ortaleyin(Şekil 4, sol panel). Mikromanipülatör sıfır.</li>
	<li>Bregma-lambda (B-L) mesafesine dikkat ederek nişangahları caudally lambda'ya taşıyın. NOT: Dikiş çizgileri orta hat boyunca düz bir çizgi izlemezse, hem bregma hem de lambda aracılığıyla "en uygun çizgi" kullanılarak orta hattın kurulması önerilir. Bununla birlikte, yukarıdaki adımlar izlenirse, kapsam retikülünün ilk yerleşimi kulak çubukları arasında yarı yarıya olmalı ve B-L orta hat dikişine yakından yaklaşmalıdır.</li>
	<li>B-L mesafesi önemli ölçüde 4,21 mm'den küçük veya daha büyükse, 4,21 mm ± 0,2 mm B-L mesafesi elde etmek için atanan bregmayı kademeli olarak ayarlayın.</li>
	<li>Ortalama kapsamını hizalama göstergesiyle değiştirin. Probları lambda ve bregma üzerine yerleştirin ve baş tutucudaki sırt eğme düğmesini sagittal düzlemde (burun yukarı veya aşağı bakacak şekilde) hizaya ayarlayın, ardından bregma'yı yeniden atamak için merkezleme kapsamını kullanın.</li>
	<li>Koronal eğim düğmesini kullanarak koronal düzlemde seviyelendirmek için hizalama göstergesini kullanın. Kafatasındaki yüzey deformasyonlarını hesaba katmak için rostral/kaudal eksen boyunca birden fazla noktada ölçüm alın.</li>
	<li>0° dönüş konumu olduğu için koronal eğim düğmesinin kadranındaki konuma dikkat edin.</li>
</ol>6. Açılı koordinatlar için dönüşün merkezi eksenlerini hizalama
<ol><li>Takım tutucusunda merkezleme kapsamını sabitleyin ve mikromanipülatörü bölüm 1'den hesaplanan koordinata yerleştirin. Açılı implantasyon için R/M koordinatının A tarafının uzunluğuna karşılık geldiğini unutmayın.<ol>
<li>Şekil 1'dekiörnekte, VMN'yi hedefleyen fiberoptik yerleştirme için açılı koordinatlar (A/P = -1.4, R/L = [2.03] 0° koronal rotasyonda, [0.00] 15° koronal rotasyonda, D/V = -5.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kapsamın aşağı doğru görülmesi ve bu koordinatın işaretlenerek (VMN örneği başına orta hattan R/L 2,03 mm; Şekil 4, orta panel). Bu işaret, kafa döndürüldüğünde canüllerin beyne gireceği noktayı temsil eder.</li>
	<li>Mikromanipülatörü orta hat üzerinde yeniden konumlandırın (R/L = 0,00). Başı bölüm 1'de hesaplanan açıya döndürmek için koronal eğim düğmesini kullanın.<ol>
<li>Kapsam artı işaretleri işaretle zaten hizalanırsa, bölüm 7'ye geçin.</li>
		<li>Kapsam artı işaretleri referans işaretiyle hizalanmazsa, çapraz artı işaretleri işarete mümkün olduğunca yakın hizalanana kadar dikey kaydırma düğmesini (Şekil 2) kullanarak z eksenindeki kafa konumunu ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Başı 0° koronal konuma geri döndürün. Dikey kaydırma adım 6.3'te ayarlanmışsa, ortalama kapsamını kullanarak bregma'yı yeniden atayın.</li>
	<li>Kafa döndürüldüğünde artı işaretleri sürekli olarak referans işaretine çarpana kadar 6.3 ve 6.4 adımlarını yineleyin (Şekil 4C).</li>
	<li>Bu noktada, bölüm 1'de kurulan rastgele dönme noktası artık stereotaktik dönme merkezi ile hizalanmalıdır.</li>
</ol>7. Mikroenjeksiyon
<ol><li>Stereotaktik matkabı tutucuya yerleştirin ve mikromanipülatörü ilk enjeksiyon koordinatına manevra yap.<ol>
<li>VMN'yi hedefleme örneğine göre, kafa düzken A/P = -1.4 ve R/L = 0.4'te detaya gidin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Matkabı, uç kafatasının hemen üstünde olana kadar diraye kadar dirdir. Matkabı açın ve uç kafatasını (dura değil) delinene kadar hafifçe diriltin.</li>
	<li>Kontrallateral enjeksiyon bölgesi için tekrarlayın.</li>
	<li>27-30G iğneye (örneğin, steril 0,5 mL insülin şırıngası) 90° büküm sokmak için steril bir iğne sürücüsü kullanın ve bükülen iğneyi dura mater'i hafifçe dürtmek için kullanın.</li>
	<li>NOT: Kanama meydana gelirse, steril pamuk uçlu bir aplikatör ile basınç uygulayın ve kanama durana kadar steril suyla temizleyin.</li>
	<li>Enjekte etmeye hazır olduğunuzda, stereotaktik tutucuya doldurulmuş bir Hamilton şırıncısını dikkatlice yerleştirin. NOT: Mikromanipülatördeki koordinatlar artık yeni bir araca geçtikten sonra geçerli değildir. Enjeksiyon için yeni hedef olarak çapak deliğinin merkezini kullanın.</li>
	<li>İğneyi çapak deliğinin üzerine dikkatlice yerleştirin.</li>
	<li>Çapak deliğinin ortasındaki dura hafifçe dokunana kadar iğneyi dira diri diri diri dürt. KRİtİk: Mikromanipülatöre sadece z ekseninde sıfır, böylece stereotaktik merkezleme kapsamı ve matkap için mikromanipülatördeki koordinatlar korunur.</li>
	<li>İğneyi yavaşça beyne diri olun, iğnenin çapak deliğinin kenarında sapmamasını sağlamak için yakından seyredemeyin. D/V enjeksiyon koordinatı için 0,05 mm ventral olana kadar alçalmaya devam edin ve 1 dakika bekleyin. Bu ekstra adım, iğne çıkarmada viral geri akışı en aza indirmek için küçük bir "cep" oluşturur.</li>
	<li>İğneyi yavaşça D/V koordinatlarına kaldırın ve enjeksiyona başlayın. NOT: Akış hızı ve hacmi hedef bölgeye ve deneysel tasarıma bağlı olarak değişecektir. VMN nöronlarının optogenetik susturulması için yeterli kapsama alanı istenir, bu nedenle 1 nL / s hızında 200 nL virüs enjekte edilir.</li>
	<li>Mikroenjeksiyondan sonra, çekilme sırasında virüs efflux'ını en aza indirmek için enjeksiyon yerinde 10 dakika bekleyin.</li>
	<li>Mikropipti beyinden yaklaşık 1 mm/dk hızla yavaşça çekin.</li>
	<li>İğne kafatasından temizlendikten sonra, iğnenin kan veya doku ile tıkanmadığından emin olmak için küçük bir miktarda virüs fırlatın. Devam etmeden önce virüsü çıkarmak için steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.</li>
	<li>Kontralteral taraf için 7.6–7.12 adımlarını yineleyin.</li>
	<li>İyileşmeyi iyileştirmek için mikroenjeksiyon çapak deliklerini kemik balmumu ile kapatın (Şekil 5B).</li>
</ol>8. Fiberoptik implantasyon
NOT: Viral enjeksiyondan sonra bilateral fiberoptik kanüller bölüm 1 başına hesaplanan açıyla implante edilir. Bu koordinatların bölüm 6'dan kafatasında işaretlenmiş olması gerektiğini unutmayın.
<ol><li>Açılı koordinatlar için 7.1 –7.4 adımlarını yineleyin.</li>
	<li>Başı 0° seviyesi konumuna getirin.</li>
	<li>Daha sonra, kemik vidaları için dört ek delik üretmek için el matkabı kullanın: iki ön ve iki arka olarak yerleştirilmelidir (Şekil 5A). Bunlar, fiberoptikleri kafatasına yapıştırmak için çapa görevi görecektir (Şekil 5D). NOT: Delikleri, fiberoptiğin kafatasının üzerinde bulunan yüksük kısmını barındıracak şekilde açılı koordinat çapak deliklerinden yeterince uzağa boşluk açtığınızdan emin olun.</li>
	<li>Mümkün olduğunca hafifçe, kemik vidalarını kafatasına sıkıca oturacak şekilde ayarlamak için küçük düz başlı tornavidayı kullanın, ancak beyne nüfuz etmezler.</li>
	<li>Fiberoptik bir kanolü, kanon tutucuya kenetleyin ve stereotaktik tutucuya yerleştirin.</li>
	<li>Mikromanipülatördeki koordinatların yeni alet için geçerli olmadığını tekrar belirterek başı hesaplanan açıya döndürün. İmplantasyon hedefi olarak açılı çapak deliklerinin merkezini kullanın.</li>
	<li>Fiberoptiği, çapak deliğinin ortasındaki duraya dokunana kadar küçümseyin (Şekil 5C). Mikromanipülatöre z ekseninde sıfır, ardından fiberoptiği yavaşça D/V açılı koordinata (VMN örneği başına-5,4) yavaşlatın.</li>
	<li>Fiberoptik yüksükleri ipsilateral ankraj vidalarına bağlamak için siyanoakrilat jeli kullanın, ardından bir mikropipette ucu ile bir hızlandırıcı uygulayın (Şekil 5D).</li>
	<li>Siyanoakrilat jel tamamen sertleştikten sonra, kanolün tutucuyu hafifçe gevşetin ve fiberoptik yüksükten temizlenene kadar yükseltin.</li>
	<li>Kontralatör açılı koordinat için 8,5–8,9 arası adımları tekrarlayın, sonra başı düzleştirin. Ekstra güvenlik için, siyanoakrilat jel ve hızlandırıcı ile iki açılı fiberoptik kanolün arasında ek bir bağlantı yapın (Şekil 5D).</li>
	<li>Küçük, nispeten ince miktarda diş çimentosu hazırlayın. Fiberoptik kanonların çapa vidalarını ve tabanını iyice örttürdklerinden emin olarak kafatasının yüzeyine uygulayın. Fiberoptik yama kabloları ile sonraki çiftleşme için yeterince yüksük açık bırakın.</li>
	<li>Çimento kuruduktan sonra fareyi stereotaktik aparattan çıkarın.</li>
	<li>Fareyi termal destek ile bir kurtarma kafesine yerleştirin. Uyanık, hareketli ve tımarlı göründüğünde iyileşmesine ve ev kafesine aktarılmasına izin verin.</li>
</ol>9. Ameliyat sonrası bakım
<ol><li>Hayvanları ameliyat sonrası 3 gün boyunca davranış, duruş, aktivite ve tımar için günlük olarak izleyin ve yiyecek alımı ve vücut ağırlığı kayıtlarını tutun.</li>
	<li>Hayvanlar ağrı veya kötü sağlıkla ilgili herhangi bir genel gösterge sergilerse, veteriner hizmetlerine danışın.</li>
	<li>Davranışsal çalışmalara başlamadan önce farelere iyileşme ve viral ifade için en az 2 hafta izin verin.</li>
</ol>10. Optogenetik
<ol><li>Optogenetik çalışmaların performansı için Sidor ve ark.8.</li>
	<li>Çalışmaların tamamlanmasında viral ekspresy anlatım ve lif yerleşimini doğrulayın.</li>
</ol>

<ol><li>King, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise%2C+fall%2C+and+resurrection+of+the+ventromedial+hypothalamus+in+the+regulation+of+feeding+behavior+and+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight.</a> Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+Neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89, 683-694 (2016).</li>
<li>Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Intracerebral+Stereotaxic+Injections+for+Optogenetic+Stimulation+of+Long-Range+Inputs+in+Mouse+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. , e59534(2019).</li>
<li>Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing%2C+packaging%2C+and+delivery+of+high+titer+crispr+retro+and+lentiviruses+via+stereotaxic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53783(2016).</li>
<li>McSweeney, C., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+Stereotactic+Injection+Technique+to+Study+Genetic+Effects+on+Animal+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52653(2015).</li>
<li>Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Neuroscience+of+Homeostasis+and+Drives+for+Food%2C+Water%2C+and+Salt%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt.</a> New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).</li>
<li>Sidor, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optogenetic+stimulation+of+the+rodent+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51483(2015).</li>
<li>Faber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Neuronal+Projections+from+the+Hypothalamic+Ventromedial+Nucleus+Mediate+Glycemic+and+Behavioral+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects.</a> Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+foundations+of+optogenetics%3A+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Scences%22%5BJournal%5D)">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).</li>
<li>Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+customizable+procedure+for+angled+stereotaxic+implantation+and+microinjection+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Kopf+Carrier%22%5BJournal%5D)">A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain.</a> Kopf Carrier. 96, (2019).</li>
<li>Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+Adeno-associated+Virus+Injection+and+Cannula+Implantation+in+the+Dorsal+Raphe+Nucleus+of+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice.</a> Bio-Protocol. 7, 2549(2017).</li>
<li>Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+topic+in+optogenetics%3A+new+implications+of+in+vivo+tissue+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating.</a> Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Nörobilimdeki son gelişmeler, beyin nörositlerinin aktivitesi ve işlevi hakkında ileri içgörü ve anlayışı desteklemiştir. Bu, ayrık nöronal popülasyonları ve bunların projeksiyon alanlarını in vivo etkinleştirmek veya susturmak için optogenetik ve kemogenetik teknolojilerin uygulanmasını içerir. Daha yakın zamanlarda, bu, serbestçe hareket eden hayvanlarda tanımlanmış bir hücre tipinde nöronal aktivitenin in vivo kaydı için genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin (örneğin, GCaMP, RCaMP) ve diğer florometrik biyosensörlerin (örneğin, dopamin, norepinefrin) geliştirilmesini içermektedir. Bununla birlikte, bu teknolojilerin etkin istihdamı, ilgi çekici bölgeyi hedeflemek için başarılı stereotaktik cerrahiye dayanmaktadır. Birçok beyin bölgesini hedeflemek için uygun olan bu yöntemleri açıklayan birkaç yerleşik protokol olsa da, orta hat boyunca derin beyin bölgelerini hedeflemek önemli ek zorlukları temsil eder. Burada, açılı stereotaktik bir yaklaşımla ayrı beyin bölgelerini hedeflemek için ayrıntılı bir cerrahi teknik gösterilmiştir. Daha da önemlisi, bu teknik çeşitli nörobilim tekniklerine (örneğin optogenetik, kemogenetik ve fiber fotometri yaklaşımları) uyarlanabilir ve uygulanabilir.
Bu yaklaşımı kullanarak, nöronal nitrik oksit sintazını (VMNNOS1 nöronları) ifade eden VMN nöronlarının akut optogenetik susturulmasının farelerde insülin kaynaklı hipoglisemiye glukagon yanıtlarını körelttiği gösterilmiştir9. Biraz değiştirilmiş bir yaklaşım kullanılarak, VMN NOS1 nöronlarının1) tek taraflı aktivasyonunun, normalde hipoglisemiye yanıt için ayrılmış karşıt yanıtlar tarafından yönlendirilen sağlam hiperglisemiyi ortaya çıkardığı ve 2) savunma hareketsizliği davranışını ortaya çıkardığı gösterilmiştir. Ayrıca, bu davranışsal ve metabolik yanıtlar farklı beyin bölgelerine nöronal projeksiyonları içerir. Özellikle, stria terminalilerin ön yatak çekirdeğine yansıtan VMNNOS1 nöronlarının aktivasyonu glisemik yanıtlarda yer larken, periaqueductal griye yansıtan VMNNOS1 nöronları korku kaynaklı davranış yanıtlarına bağlıdır9.
Protokolün Kopf Model 1900 stereotaks ve beraberindeki aksesuarlara son derece özel olduğu belirtilmelidir. Bu sistem, beyin bölgelerini ayırmak için hassas, tekrarlanabilir implantasyonun yanı sıra mikroenjeksiyon sağlarken (birden fazla araç arasında ortak bir merkez çizgisi konumu ile), strateji ve yaklaşım diğer stereotaksik çerçevelere uyacak şekilde uyarlanabilir. Özellikle, açılı mikroenjeksiyonlar ve implantasyonlar yapmak için başı döndürmek yerine, alternatif bir yaklaşım aynı ilkeleri kullanmak ve bunun yerine dorsal-ventral manipülatörü döndürmektir (bkz. Correia vd.12).
Her yeni yöntemde olduğu gibi, bireylerin bir deneyin güvenilirliğini, tutarlılığını ve doğruluğunu geliştirmek için tekniği optimize etmesi kritik öneme sahiptir. Ek olarak, verilerin uygun analizi ve yorumlanması için gerekli uygun kontrollerin dahil edilmesi önemlidir. Bunlar arasında Cre-negatif çöp arkadaşı kontrollerinin kullanımı, viral muhabir kontrolleri (yani AAV-GFP), elektrofizyoloji kullanılarak ışığa bağımlı nöronal ateşleme modülasyonunun doğrulanması ve (çalışma tamamlandığında) ilgi çekici bölgede viral hedefleme ve fiberoptik yerleşimin doğrulanması sayar. Teknik hususların ve önerilen kontrollerin ayrıntılı bir incelemesi için Cardozo ve Lammel13 tarafından yayına başvurmanız önerilir.
Özetle, daha gelişmiş ve hassas sinirbilim tekniklerinin tanıtılması, beynin davranış, biliş ve fizyolojideki rolünün önemli bir ilerlemesini ve anlaşılmasını desteklemiştir ve bu gelişmeler CNS ile ilgili bozukluklar için potansiyel tedavilere yol açabilir.

Davranış, beslenme ve metabolizmanın sinirsel kontrolü, son derece karmaşık, bütünleştirici ve gereksiz nörosürücülerin koordinasyonunu içerir. Nörobilim alanının itici bir amacı, nöronal devre yapısı ve işlevi arasındaki ilişkiyi parçalamaktır. Klasik sinirbilim araçları (yani lezyonlama, lokal farmakolojik enjeksiyonlar ve elektriksel stimülasyon) davranışı ve metabolizmayı kontrol eden belirli beyin bölgelerinin rolü hakkında hayati bilgileri ortaya çıkarmış olsa da, bu araçlar özgüllük ve geri döndürülebilirlik eksikliği ile sınırlıdır1.
Nörobilim alanındaki son gelişmeler, devre fonksiyonunu yüksek mekansal çözünürlükle hücre tipi spesifik bir şekilde sorgulama ve manipüle etme yeteneğini büyük ölçüde geliştirmiştir. Örneğin optogenetik2 ve kemogenetik3 yaklaşımları, serbestçe hareket eden hayvanların genetik olarak tanımlanmış hücre tiplerinde aktivitenin hızlı ve geri dönüşümlü manipülasyonuna izin verir. Optogenetik, nöronal aktiviteyi kontrol etmek için channelrhodopsins olarak adlandırılan ışığa duyarlı iyon kanallarının kullanımını içerir. Bu tekniğin anahtarı, channelrhodopsin'in gen iletimi ve opsin'i aktive etmek için bir ışık kaynağıdır. Gen iletimi için ortak bir strateji, 1) ayrı nöronlarda Cre-rekombinaz ifade eden genetik olarak tasarlanmış fareler ve 2) Channelrhodopsin kodlaması için cre-dependent viral vektörler kombinasyonudur.
Optogenetik nöronal aktiviteyi kontrol etmek için zarif, son derece hassas bir araç sağlarken, yöntem viral vektörün başarılı stereotaktik mikroenjeksiyonuna ve tanımlanmış bir beyin bölgesine fiberoptik yerleştirmeye dayatılır. Stereotaktik prosedürler modern sinirbilim laboratuvarında yaygın olmasına rağmen (ve bu prosedürü tanımlayan birkaç mükemmel protokol vardır)4,5,6, orta hat boyunca ayrı beyin bölgelerini tutarlı ve tekrar tekrar hedefleyebilmek (yani, homeostatik fonksiyonların düzenlenmesi için kritik bir beyin alanı olan mediobaz hipotalamus) ek zorluklar sunar. Bu zorluklar arasında üstün sagittal sinüsten, üçüncü ventrikülden ve bitişik hipotalamik çekirdeklerden kaçınmak yer almaktadır. Ek olarak, inhibisyon çalışmaları için gerekli olan donanımın bilateral implantasyonunda önemli mekansal sınırlamalar vardır. Bu zorlukları göz önünde bulundurarak, bu protokol burada açılı bir stereotaktik yaklaşımla ayrı beyin bölgelerini hedeflemek için değiştirilebilir bir prosedür sunar.

<table><tbody><tr><td>Fiberoptic Cannulae</td><td>Doric Lenses</td><td>MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT</td><td>Customizable</td></tr><tr><td>Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System</td><td>Kopf</td><td>Model 1900</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge</td><td>Kopf</td><td>Model 1900-51</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1905 Alignment Indicator</td><td>Kopf</td><td>Model 1905</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill</td><td>Kopf</td><td>Model 1911</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1915 Centering Scope</td><td>Kopf</td><td>Model 1915</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars</td><td>Kopf</td><td>Model 1922</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td><td>Kopf</td><td>Model 1923-B</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1940 Micro Manipulator</td><td>Kopf</td><td>Model 1940</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 Microinjection System</td><td>World Precision Instruments</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>Mouse bone screws</td><td>Plastics One</td><td>00-96 X 1/16</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule</td><td>Thor Labs</td><td>XCL</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Drill</td><td>Cell Point Scientific</td><td>Ideal Micro Drill</td><td></td></tr></tbody></table>

adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques

Stereotaktik cerrahi, modern sinirbilim laboratuvarında önemli bir araçtır. Bununla birlikte, ulaşılması zor beyin bölgelerini tam ve doğru bir şekilde hedefleme yeteneği, özellikle orta hat boyunca beyin yapılarını hedeflerken hala bir zorluk teşkil etmektedir. Bu zorluklar arasında üstün sagittal sinüs ve üçüncü ventrikülden kaçınmak ve seçici ve ayrık beyin çekirdeklerini sürekli olarak hedefleme yeteneği yer almaktadır. Ek olarak, daha gelişmiş sinirbilim teknikleri (örneğin, optogenetik, lifli fotometri ve iki foton görüntüleme) beyne önemli donanımların hedefli implantasyonuna dayanır ve mekansal sınırlamalar yaygın bir engeldir. Burada, açılı bir koronal yaklaşım kullanılarak kemirgen beyin yapılarının stereotaktik olarak hedeflimi için değiştirilebilir bir protokol sunulmaktadır. 1) fare veya sıçan modellerine, 2) çeşitli sinirbilim tekniklerine ve 3) birden fazla beyin bölgesine uyarlanabilir. Temsili bir örnek olarak, bir optogenetik inhibisyon deneyi için fare hipotalamik ventromedial çekirdeğinin (VMN) hedeflanması için stereotaktik koordinatların hesaplanmasını içerir. Bu prosedür, adeno ilişkili bir virüsün (AAV) ışığa duyarlı bir klorür kanalını (SwiChR++) Cre'ye bağımlı bir fare modeline kodlaması ve ardından fiberoptik kanonun açılı bilateral implantasyonu ile başlar. Bu yaklaşımı kullanarak, bulgular insülin kaynaklı hipoglisemiye karşı sağlam glikoz karşı-gülatör yanıtları için VMN nöronlarının bir alt kümesinin aktivasyonunun gerekli olduğunu göstermektedir.

Bu protokol, hipotalamik VMN nöronlarının glisemik kontrol9'dakirolünü sorgulamak için optogenetik çalışmaları yapmak için cerrahi bir prosedürü açıklar. İlk olarak VMN'ye inhibitör bir channelrhodopsin virüsünün bilateral mikroenjeksiyon için standart (açılı olmayan) stereotaktik bir yaklaşım kullanılmıştır. Açılı bir yaklaşım da uygun olsa da, ilgi çekici beyin bölgesini hedeflemek yeterli olduğu ve kolay, güvenilir ve tutarlı bir yaklaşım olduğu için standart (açılı olmayan) yaklaşım seçilmiştir. Bununla birlikte, VMN'nin orta çizgiye yakınlığı göz önüne alındığında, uzay kısıtlamaları bilateral fiberoptiklerin açılı olmayan implantasyonuna izin vermemiş ve fiberoptiklerin bir açıyla hassas bir şekilde implante edilmesi için cerrahi bir strateji geliştirilmesinigerektirmiştir (Şekil 6).
Bu cerrahi stratejiyi kullanarak, "SwiChR++" virüs10olarak adlandırılan floresan muhabirle kaynaşmış modifiye bir channelrhodopsin anion-iletken kanalını ifade eden Cre'ye bağımlı bir AAV'yi mikroenjaktize ettik , nos1-cre farelerinin VMN'sine iki taraflı olarak. Bunu, her enjeksiyon bölgesine orta çizgiden 15° açıyla optik fiber dorsolateral implantasyonu izledi. Beklendiği gibi, viral ekspresyon VMN ile sınırlıydı ve diğer beyin bölgelerinde tespit edildi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60965/60965fig01.jpg"> Şekil 1: Hipotalamik ventromedial çekirdeği hedefleyen açılı koordinatların hesaplanması için temsili örnek. Açılar ve çizgi parçaları ölçeklemek için çizilmez. (A) Bu uzunluk temel trigonometri kullanılarak hesaplanmalıdır. Bu örnekte, A = 2,03 mm. (B) Rasgele döndürme ekseninin atanmasına dayalı tahmini uzunluk. Bu örnekte, B = 7.576 mm. (C) Hesaplanan hipotenoz. Fiberoptik/iğne yerleştirme derinliğinin optimizasyon gerektiren hedef bölgeye istenilen yakınlığa bağlı olduğu unutulmamalıdır. Bu rakam Faber ve ark. 201911'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60965/60965fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60965/60965fig02.jpg"> Şekil 2: Stereotaktik kafa tutucu aparatı için ayar düğmeleri. Bu rakam Faber ve ark. 201911'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60965/60965fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60965/60965fig03.jpg"> Şekil 3: Baş tutucunun dönme merkezini hizalama. (A) Kulak çubuklarının yerleştirilmesi. (B) 0° seviye koronal dönüş sırasında (solda), dikey kaymayı ayarlamadan önce 15° dönüş sırasında ve dönüş merkezi yanlış hizalanır (ortada) ve dikey kaymayı ayarladıktan sonra 15° döndürme sırasında ve dönüş merkezi düzgün bir şekilde hizalanır (sağda). Bu rakam Faber ve ark. 201911'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60965/60965fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60965/60965fig04.jpg"> Şekil 4: Bregma atama ve hayvan başını merkezi dönme eksenleriyle hizalama. (A) Tipik bregma yerleşimini gösteren temsili resim. (B) Hizalamadan önce, kafa düzken bir referans işareti çizme. (C) Dikey kaymayı ayarladıktan ve bregma'yı yeniden ayarladıktan sonra düzgün hizalanmış dönme ekseni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60965/60965fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60965/60965fig05.jpg"> Şekil 5: Fiberoptik implantasyon prosedürü. (A) Mikroenjeksiyon (m), fiberoptik (f) ve çapa vidaları (*) için pilot deliklerin ortalama kapsamı görünümü. (B) yerleştirilen çapa vidalarının ve kemik balmumu kaplı mikroenjeksiyon matkap deliklerinin ortalama kapsamı görünümü. (C) Açılı implantasyon sırasında fiberoptiğin yerine yerleştirilmesi. (D) Temsili bilateral açılı fiberoptik yerleştirme. Noktalı siyah oklar, fiberoptiği ankraj vidalarına ve ipsilateral fiberoptiklere tutturmak için süper tutkalın kullanıldığı alanları gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60965/60965fig5v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60965/60965fig06.jpg"> Şekil 6: Ventromedial hipotalamusun bilateral hedeflemesi için temsili sonuçlar. (A) VMN'yi hedeflemek için bilateral mikroenjeksiyon ve açılı fiberoptik stratejiyi temsil eden şematik. (B) SwiChR-GFP'nin bilateral ekspresyonını ve açılı fiberoptik sistemlerden doku hasarını gösteren temsili görüntü. 3V = üçüncü ventrikül, ARC = arcuate çekirdeği ve VMN = ventromedial çekirdek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60965/60965fig6v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques at JoVE.com

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Burada açıklanan, açılı bir koronal yaklaşım kullanarak zorlu ve ulaşılması zor beyin bölgelerini (mekansal sınırlamalar nedeniyle) hedef alabilen stereotaktik bir prosedürdür. Bu protokol hem fare hem de sıçan modellerine uyarlanabilir ve kanül implantasyonu ve viral yapıların mikroenjectionları da dahil olmak üzere çeşitli nörobilimsel uygulamalara uygulanabilir.

Çok Yönlü Nörobilim Teknikleri için Uyarlanabilir Açılı Stereotaktik Yaklaşım

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

adaptable-angled-stereotactic-approach-for-versatile-neuroscience

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

5.0K Görüntüleme.  University of Washington. Burada açıklanan, açılı bir koronal yaklaşım kullanarak zorlu ve ulaşılması zor beyin bölgelerini (mekansal sınırlamalar nedeniyle) hedef alabilen stereotaktik bir prosedürdür. Bu protokol hem fare hem de sıçan modellerine uyarlanabilir ve kanül implantasyonu ve viral yapıların mikroenjectionları da dahil olmak üzere çeşitli nörobilimsel uygulamalara uygulanabilir.

Video: Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer scale. However, current methods mostly rely on tethered cable recordings or only use unidirectional systems, allowing either recording or stimulation of neural activity, but not at the same time or same target. Here, a new wireless, bidirectional device for simultaneous multichannel recording and stimulation of neural activity in freely behaving rats is described. The system operates through a single portable head stage that both transmits recorded activity and can be targeted in real-time for brain stimulation using a telemetry-based multichannel software. The head stage is equipped with a preamplifier and a rechargeable battery, allowing stable long-term recordings or stimulation for up to 1 h. Importantly, the head stage is compact, weighs 12 g (including battery) and thus has minimal impact on the animal&#180;s behavioral repertoire, making the method applicable to a broad set of behavioral tasks. Moreover, the method has the major advantage that the effect of brain stimulation on neural activity and behavior can be measured simultaneously, providing a tool to assess the causal relationships between specific brain activation patterns and behavior. This feature makes the method particularly valuable for the field of deep brain stimulation, allowing precise assessment, monitoring, and adjustment of stimulation parameters during long-term behavioral experiments. The applicability of the system has been validated using the inferior colliculus as a model structure.

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A wireless, bidirectional system for multi-channel neural recordings and stimulation in freely behaving rats is introduced. The system is light and compact, thus having minimal impact on the animal&#180;s behavioral repertoire. Moreover, this bidirectional system provides a sophisticated tool to assess causal relationships between brain activation patterns and behavior.

Kablosuz, Vivo içinde kayıt ve fareler serbestçe davranışlar içinde sinirsel aktivite uyarılması için çift yönlü arayüzü

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Davranış

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

İntrakraniyal Enjeksiyon ve Manyetik Rezonans Görüntüleme Ile Beyin Metastazlarının Modellenmesi

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Kanser Araştırmaları

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Tıp

Operative Technique and Nuances for the Stereoelectroencephalographic (SEEG) Methodology Utilizing a Robotic Stereotactic Guidance System

The SEEG methodology has gained favor in North America over the last decade as a means of localizing the epileptogenic zone (EZ) prior to epilepsy surgery. Recently, the application of a robotic stereotactic guidance system for implantation of SEEG electrodes has become more popular in many epilepsy centers. The technique for the use of the robot requires extreme precision in the pre-surgical planning phase and then the technique is streamlined during the operative portion of the methodology, as the robot and surgeon work in concert to implant the electrodes. Herein is detailed precise operative methodology of using the robot to guide implantation of SEEG electrodes. A major limitation of the procedure, namely its heavy reliance on the ability to register the patient to a preoperative volumetric magnetic resonance image (MRI), is also discussed. Overall, this procedure has been shown to have a low morbidity rate and an extremely low mortality rate. The use of a robotic stereotactic guidance system for the implantation of SEEG electrodes is an efficient, fast, safe, and accurate alternative to conventional manual implantation strategies.

Operative Technique and Nuances for the Stereoelectroencephalographic SEEG Methodology Utilizing a Robotic Stereotactic Guidance System

The SEEG methodology is simplified and made faster with a stereotactic robot. Careful attention must be paid to the registration of the preoperative volumetric MRI to the patient prior to use of the robot in the OR. The robot streamlines the procedure, leading to decreased operative times and accurate implantations.

Robotik stereotaktik rehberlik sistemi kullanan stereoelektroensefalografik (SEEG) metodoloji için operatif teknik ve nüanslar

The SEEG methodology has gained favor in North America over the last decade as a means of localizing the epileptogenic zone (EZ) prior to epilepsy ...

Investigating the Function of Deep Cortical and Subcortical Structures Using Stereotactic Electroencephalography: Lessons from the Anterior Cingulate Cortex

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure involves the chronic placement of multiple depth electrodes into regions of the brain typically inaccessible via subdural grid electrode placement. SEEG thus provides a unique opportunity to investigate brain function. In this paper we demonstrate how SEEG can be used to investigate the role of the dorsal anterior cingulate cortex (dACC) in cognitive control. We include a description of the SEEG procedure, demonstrating the surgical placement of the electrodes. We describe the components and process required to record local field potential (LFP) data from consenting subjects while they are engaged in a behavioral task. In the example provided, subjects play a cognitive interference task, and we demonstrate how signals are recorded and analyzed from electrodes in the dorsal anterior cingulate cortex, an area intimately involved in decision-making. We conclude with further suggestions of ways in which this method can be used for investigating human cognitive processes.

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is an operative technique used in epilepsy surgery to help localize seizure foci. It also affords a unique opportunity to investigate brain function. Here we describe how SEEG can be used to investigate cognitive processes in human subjects.

Stereotaktik Elektroensefalografi kullanarak Derin KORTİKAL Fonksiyonu ve subkortikal yapıları incelenmesi: Ön Singulat Korteks Dersler

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure ...

Nörobilim

A MRI-Based Toolbox for Neurosurgical Planning in Nonhuman Primates

In this paper, we outline a method for surgical preparation that allows for the practical planning of a variety of neurosurgeries in NHPs solely using data extracted from magnetic resonance imaging (MRI). This protocol allows for the generation of 3D printed anatomically accurate physical models of the brain and skull, as well as an agarose gel model of the brain modeling some of the mechanical properties of the brain. These models can be extracted from MRI using brain extraction software for the model of the brain, and custom code for the model of the skull. The preparation protocol takes advantage of state-of-the-art 3D printing technology to make interfacing brains, skulls, and molds for gel brain models. The skull and brain models can be used to visualize brain tissue inside the skull with the addition of a craniotomy in the custom code, allowing for better preparation for surgeries directly involving the brain. The applications of these methods are designed for surgeries involved in neurological stimulation and recording as well as injection, but the versatility of the system allows for future expansion of the protocol, extraction techniques, and models to a wider scope of surgeries.

The method outlined below aims to provide a comprehensive protocol for the preparation of nonhuman primate (NHP) neurosurgery using a novel combination of three-dimensional (3D) printing methods and MRI data extraction.

İnsan olmayan Primatlarda Nöroşirürji Planlaması için MRI Tabanlı Araç Kutusu

In this paper, we outline a method for surgical preparation that allows for the practical planning of a variety of neurosurgeries in NHPs solely using ...

Biyomühendislik

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

Kemirgenlerde Kan-Beyin Bariyeri Açıklığı için Yüksek Verimli Görüntü Destekli Stereotaktik Nöronavigasyon ve Odaklanmış Ultrason Sistemi

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

Derin Beyin In Vivo Kalsiyum Görüntüleme için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Degrade İndeks Lens İmplantasyonu

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Magnetic Resonance-Guided Stereotaxy for Infusions to the Pig Brain

The overall goal of this procedure is to perform stereotaxy in the pig brain with real-time magnetic resonance (MR) visualization guidance to provide precise infusions. The subject was positioned prone in the MR bore for optimal access to the top of the skull with the torso raised, the neck flexed, and the head inclined downward. Two anchor pins anchored on the bilateral zygoma held the head steady using the head holder. A magnetic resonance imaging (MRI) flex-coil was placed rostrally across the head holder so that the skull was accessible for the intervention procedure. A planning grid placed on the scalp was used to determine the appropriate entry point of the cannula. The stereotactic frame was secured and aligned iteratively through software projection until the projected radial error was less than 0.5 mm. A hand drill was used to create a burr hole for insertion of the cannula. A gadolinium-enhanced co-infusion was used to visualize the infusion of a cell suspension. Repeated T1-weighted MRI scans were registered in real time during the agent delivery process to visualize the volume of gadolinium distribution. MRI-guided stereotaxy allows for precise and controlled infusion into the pig brain, with concurrent monitoring of cannula insertion accuracy and determination of the agent volume of distribution.

The protocol presented here demonstrates stereotaxy to the pig brain using convection-enhanced infusions, with real-time magnetic resonance imaging (MRI) visualization guidance and real-time infusion distribution visualization.

Domuz Beynine İnfüzyonlar için Manyetik Rezonans Rehberliğinde Stereotaksi

The overall goal of this procedure is to perform stereotaxy in the pig brain with real-time magnetic resonance (MR) visualization guidance to provide ...

<meta charset="utf8"></head><body>fMRI Çalışmalarında Gelişmiş Elektrot Yerleştirme Doğruluğu için Nöronavigasyonlu tDCS

Neuronavigated Focalized Transcranial Direct Current Stimulation Administered During Functional Magnetic Resonance Imaging

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive brain stimulation technique that allows the modulation of the excitability and plasticity of the human brain. Focalized tDCS setups use specific electrode arrangements to constrain the current flow to circumscribed brain regions. However, the effectiveness of focalized tDCS can be compromised by electrode positioning errors on the scalp, resulting in significant reductions of the current dose reaching the target brain regions for tDCS. Electrode placement guided by neuronavigation based on the individual&#39;s head and brain anatomy derived from structural magnetic resonance imaging (MRI) data may be suited to improve positioning accuracy.
This protocol describes the method of neuronavigated electrode placement for a focalized tDCS setup, which is suitable for concurrent administration during functional MRI (fMRI). We also quantify the accuracy of electrode placement and investigate electrode drift in a concurrent tDCS-fMRI experiment. Critical steps involve the optimization of electrode positions based on current modeling that considers the individual&#39;s head and brain anatomy, the implementation of neuronavigated electrode placement on the scalp, and the administration of optimized and focal tDCS during fMRI.
The regional precision of electrode placement is quantified using the Euclidean norm (L2&#160;Norm) to determine deviations of the actual from the intended electrode positions during a concurrent tDCS-fMRI study. Any potential displacement of electrodes (drift) during the experiment is investigated by comparing actual electrode positions before and after the fMRI acquisition. In addition, we directly compare the placement accuracy of neuronavigated tDCS to that achieved by a scalp-based targeting approach (a 10-20 Electroencephalography (EEG) system). These analyses demonstrate superior placement accuracy for neuronavigation compared to scalp-based electrode placement and negligible electrode drift across a 20 min scanning period.

<meta charset="utf8"></head><body>Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Sırasında Uygulanan Nöronavigasyonlu Fokalize Transkraniyal Doğru Akım Stimülasyonu

This protocol describes the method of neuronavigated electrode placement for focal, transcranial direct current stimulation (tDCS) administered during functional magnetic resonance imaging (fMRI).

Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Sırasında Uygulanan Nöronavigasyonlu Fokalize Transkraniyal Doğru Akım Stimülasyonu

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive brain stimulation technique that allows the modulation of the excitability and plasticity ...