Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK) concede F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), um American Diabetes Association Innovative Basic Science Award (#1-19-IBS-192 para G.J.M.) e o Centro de Pesquisa em Obesidade Nutricional financiado pelo NIDDK (DK-035816), O Centro de Pesquisa em Diabetes (DK-017047) e diabetes, Treinamento de obesidade e metabolismo Grant T32 DK0007247 (T.H.M) na Universidade de Washington.

Todos os procedimentos foram aprovados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde, o Guia de Cuidado e Uso de Animais e foram aprovados tanto pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) quanto pela Saúde e Segurança Ambiental da Universidade de Washington.
1. Cálculo de coordenadas angulares
<ol><li>Usando um atlas cerebral coronal, marque um triângulo retângulo para que a hipotenusa passe pela região alvo de interesse. No exemplo representativo(Figura 1),o núcleo ventromedial hipotalâmico (VMN) é direcionado a um ângulo de 15° da linha média coronal. NOTA: A colocação do eixo de rotação retratado na Figura 1 (e, portanto, o comprimento do lado C) é arbitrária e pode ser modificada para atingir qualquer região cerebral. Embora isso possa parecer contra-intuitivo, etapas posteriores no protocolo ajustarão a posição da cabeça no eixo z de modo que este ponto se alinhe com o centro estereotático de rotação (ver seção 6). No entanto, recomenda-se não exceder um ângulo de rotação coronal de 15° devido a restrições físicas do aparelho do porta-cabeça.</li>
	<li>Estabeleça o ângulo desejado (a) e o comprimento estimado do lado B e use trigonometria para calcular o comprimento dos lados A e C. Esta etapa é importante para o posicionamento adequado da cabeça durante a rotação. NOTA: No exemplo da Figura 1,as linhas de grade atlas são usadas para aproximar o comprimento do lado B, rendendo um comprimento de 7.576 mm. Essas informações são usadas para calcular o comprimento do lado A: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ01.jpg"> Neste exemplo, 2,03 mm indica a distância de R/L da linha média em que a cânula fibraótica entra no cérebro quando a cabeça é girada em 15°.<ol>
<li>Opcionalmente, calcule o comprimento do lado C para aproximar a coordenada D/V: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ02.jpg"> NOTA: 1) O comprimento do hipoteno (C) não representa a profundidade da injeção, mas será útil na determinação da coordenada D/V, que pode precisar ser ajustada para acomodar o comprimento aumentado versus o lado B para injeções diretas. Recomenda-se, portanto, realizar injeções de teste para otimizar a coordenada D/V. 2) Neste exemplo visando a VMN, dois conjuntos de coordenadas são obtidos: um para a microinjeção que não é angular (A/P = -1,4, R/L = 0,4 a 0°, D/V = -5,7) e um para a implantação em ângulo de fibra óptica (A/P = -1,4, R/L = 0,0 a 15°, D/V = -5,4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação do estereotax para procedimento em ângulo
<ol><li>Confirme se o quadro estereotático e o micromanipulador foram calibrados (consulte o manual kopf para o protocolo completo).</li>
	<li>Coloque o medidor de altura central na tomada da placa base do suporte da cabeça.</li>
	<li>Fixar o escopo de centralidade no suporte da ferramenta e, em seguida, avistar o escopo. Ajuste a posição do micromanipulador até que a mira esteja alinhada e focada na mira do medidor. NOTA: Durante esta etapa, o escopo está sendo posicionado no plano focal do centro de rotação do porta-cabeça. Uma vez estabelecido, o micromanipulador não deve ser movido durante as etapas restantes.</li>
	<li>Coloque as barras de ouvido nos suportes e centrale-as de forma que as linhas indicadoras de ambos os lados estejam em 0 (Figura 3A).</li>
	<li>Use os botões medial-lateral e anterior-posterior no suporte da cabeça (Figura 2) para alinhar as barras de ouvido no x- e y-planos acima da mira do medidor de altura central(Figura 3A).</li>
	<li>Para alinhar a posição da barra de ouvido no eixo z, remova as barras da orelha do suporte e remova o medidor de altura central. Substitua as barras de ouvido e centrale-as novamente em 0.</li>
	<li>Visão para baixo do escopo. Use o botão de mudança vertical(Figura 3B) e o botão de inclinação coronal, respectivamente, para baixar e girar as barras de ouvido até que a mira do escopo permaneça centrada entre as barras de ouvido durante a rotação coronal.</li>
	<li>O estereotax está agora calibrado e pronto. Não faça mais ajustes na posição do titular.</li>
</ol>3. Preparação de materiais para injeção/implantação
<ol><li>Certifique-se de que todos os instrumentos, ferramentas cirúrgicas e materiais sejam esterilizados e colocados em um campo cirúrgico estéril ao lado do estereotax.</li>
	<li>Manuseie e armazene construções virais de acordo com seu nível de biossegurança e requisitos regulatórios de biossegurança institucionais relevantes.</li>
	<li>Desenhe o vírus na seringa, tomando cuidado para usar práticas de manuseio adequadas e equipamentos de proteção individual.</li>
</ol>4. Anestesia
<ol><li>Grave o peso corporal do rato antes da cirurgia.</li>
	<li>Anestesia profundamente o rato usando isoflurano.</li>
	<li>Certifique-se de que o mouse está profundamente anestesiado realizando um teste de beliscão do dedo do dedo do dedo até que a resposta vacilante esteja ausente. Se o animal continuar a apresentar reflexos fortes, aumente a concentração e/ou duração da anestesia.</li>
	<li>Aplique pomada ocular em cada olho para mantê-los úmidos durante a cirurgia.</li>
	<li>Raspe o couro cabeludo de trás das orelhas para apenas atrás dos olhos com um cortador de cabelo.</li>
	<li>Forneça ao mouse analgésico aprovado pelo IACUC.</li>
	<li>Monitore continuamente o animal durante todo o procedimento cirúrgico e forneça suporte térmico.</li>
</ol>5. Procedimento cirúrgico
<ol><li>Coloque a cabeça no suporte da cabeça colocando os incisivos superiores na abertura da barra de mordida, certificando-se de que a língua está abaixo da barra de mordida.</li>
	<li>Fixar a cabeça nas barras de ouvido inserindo suavemente as barras de ouvido no meatus auditivo externo, garantindo que as barras de ouvido sejam colocadas simetricamente (tipicamente entre três e quatro para um rato adulto). Esta etapa é fundamental para garantir que a cabeça esteja estável e centrada para rotação.</li>
	<li>Prepare aseticamente a área de incisão raspada com três esfoliantes alternados de cotonetes betadina e álcool, ou com preparação alternativa do local cirúrgico aprovado institucionalmente.</li>
	<li>Coloque uma cortina cirúrgica sobre o animal para manter um campo cirúrgico estéril e reduzir o risco de infecção pós-operatória.</li>
	<li>Exponha o crânio fazendo uma incisão ao longo da linha média sagital do couro cabeludo. Raspe suavemente a superfície do crânio para remover qualquer fáscia e expor as suturas. NOTA: Se as linhas de sutura forem difíceis de visualizar, o peróxido de hidrogênio pode ser aplicado ao crânio usando um aplicador de ponta de algodão estéril para melhorar a visualização da sutura.</li>
	<li>Coloque o escopo central no suporte e centralizar a mira na bregma(Figura 4, painel esquerdo). Zero o micromanipulador.</li>
	<li>Mova a mira caudaly para lambda, observando a distância bregma-lambda (B-L). NOTA: Se as linhas de sutura não seguirem uma linha reta ao longo da linha média, recomenda-se estabelecer a linha média usando a "linha de melhor ajuste" através de bregma e lambda. No entanto, se os passos acima forem seguidos, a colocação inicial da ântice de escopo deve estar no meio do caminho entre as barras de ouvido e aproximar-se de perto da sutura de linha média B-L.</li>
	<li>Se a distância B-L for significativamente menor ou superior a 4,21 mm, ajuste gradualmente o bregma atribuído para obter uma distância B-L de 4,21 mm ± 0,2 mm.</li>
	<li>Substitua o escopo central de centro pelo indicador de alinhamento. Coloque as sondas em lambda e bregma e ajuste o botão de inclinação dorsal no suporte da cabeça para nivelar no plano sagital (nariz voltado para cima ou para baixo), em seguida, use o escopo central para redesignar bregma.</li>
	<li>Use o indicador de alinhamento para nivelar no plano coronal usando o botão de inclinação coronal. Meça em vários pontos ao longo do eixo rostral/caudal para explicar as deformações superficiais no crânio.</li>
	<li>Observe a posição no mostrador do botão de inclinação coronal, pois esta é a posição de rotação 0°.</li>
</ol>6. Alinhando os eixos centrais de rotação para coordenadas angulares
<ol><li>Fixar o escopo de centralidade no suporte da ferramenta e posicionar o micromanipulador à coordenada calculada da seção 1. Observe que a coordenada R/L para a implantação em ângulo corresponde ao comprimento do lado A.<ol>
<li>No exemplo da Figura 1,as coordenadas angulares para colocação em fibra óptica visando o VMN são (A/P = -1,4, R/L = [2,03] a rotação coronal de 0°, [0,00] a 15° rotação coronal, D/V = -5,4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avistar o escopo e marcar esta coordenada (R/L 2,03 mm da linha média pelo exemplo VMN; Figura 4, painel do meio). Esta marca representa o ponto em que a cânula entrará no cérebro assim que a cabeça for girada.</li>
	<li>Reposicionar o micromanipulador sobre a linha média (R/L = 0,00). Use o botão de inclinação coronal para girar a cabeça para o ângulo calculado na seção 1.<ol>
<li>Se a mira já estiver alinhada com a marca, siga para a seção 7.</li>
		<li>Se a mira do escopo não se alinhar com a marca de referência, ajuste a posição da cabeça no eixo z usando o botão de mudança vertical(Figura 2) até que a mira se aproxime o mais possível da marca.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gire a cabeça de volta para a posição coronal de 0°. Se a mudança vertical foi ajustada na etapa 6.3, reatribuir bregma usando o escopo central.</li>
	<li>Repita as etapas 6.3 e 6.4 até que a mira atinja consistentemente a marca de referência quando a cabeça é girada(Figura 4C).</li>
	<li>Neste ponto, o ponto arbitrário de rotação estabelecido na seção 1 deve agora estar alinhado com o centro estereotático de rotação.</li>
</ol>7. Microinjeção
<ol><li>Coloque a broca estereotática no suporte e manoenda o micromanipulador até a primeira coordenada de injeção.<ol>
<li>Por exemplo de mira da VMN, fure em A/P = -1,4 e R/L = 0,4 enquanto a cabeça estiver nivelada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abaixe a broca até que a broca esteja logo acima do crânio. Ligue a broca e baixe suavemente até que a broca tenha perfurado o crânio (não a duraza).</li>
	<li>Repita para o local de injeção contralateral.</li>
	<li>Use um condutor de agulha estéril para introduzir uma curva de 90° em uma agulha de 27-30G (por exemplo, de uma seringa de insulina estéril de 0,5 mL), e use a agulha dobrada para cutucar suavemente a dura-minga.</li>
	<li>NOTA: Se ocorrer sangramento, aplique pressão com um aplicador estéril com ponta de algodão e limpe com água estéril até que o sangramento pare.</li>
	<li>Quando estiver pronto para injetar, coloque cuidadosamente uma seringa Hamilton preenchida no suporte estereotático. NOTA: As coordenadas do micromanipulador não se aplicam mais após a mudança para uma nova ferramenta. Use o centro do orifício de rebarba como o novo alvo para injeção.</li>
	<li>Posicione cuidadosamente a agulha acima do orifício da rebarba.</li>
	<li>Abaixe a agulha até que toque ligeiramente a dura dentro do centro do orifício da rebarba. CRÍTICA: Zero o micromanipulador apenas no eixo z, de modo que as coordenadas do micromanipulador para o escopo de centro estereotático e broca sejam mantidas.</li>
	<li>Abaixe lentamente a agulha para dentro do cérebro, observando de perto para garantir que a agulha não desvie na borda do orifício da rebarba. Continue baixando até 0,05 mm de ventral para a coordenada de injeção D/V e espere 1 min. Esta etapa extra cria um pequeno "bolso" para minimizar o fluxo de backflow viral na remoção da agulha.</li>
	<li>Levante lentamente a agulha para a coordenada D/V e inicie a injeção. NOTA: A taxa de fluxo e o volume variam dependendo da região alvo e do design experimental. Para o silenciamento optogenético dos neurônios VMN, deseja-se cobertura suficiente, de modo que 200 nL de vírus é injetado a uma taxa de 1 nL/s.</li>
	<li>Após a microinjeção, espere 10 min no local da injeção para minimizar o efflux do vírus durante a retirada.</li>
	<li>Retire lentamente a micropipette do cérebro a uma taxa aproximada de 1 mm/min.</li>
	<li>Uma vez que a agulha esteja limpa do crânio, ejete um pequeno volume de vírus para garantir que a agulha não tenha entupido com sangue ou tecido. Use um aplicador de ponta de algodão estéril para remover o vírus antes de continuar.</li>
	<li>Repita as etapas 7.6-7.12 para o lado contralateral.</li>
	<li>Sele os orifícios de microinjeção com cera óssea para melhorar a cicatrização(Figura 5B).</li>
</ol>8. Implantação de fibra óptica
NOTA: Após a injeção viral, as cânulas de fibra óptica bilaterais são implantadas no ângulo calculado por seção 1. Observe que essas coordenadas já devem estar marcadas no crânio da seção 6.
<ol><li>Repita as etapas 7.1 -7.4 para as coordenadas angulares.</li>
	<li>Volte a cabeça para a posição nível 0°.</li>
	<li>Em seguida, use a broca manual para produzir quatro orifícios adicionais para os parafusos ósseos: dois devem ser colocados anteriormente e dois posteriormente(Figura 5A). Estes servirão como âncoras para fixar as fibras ópticas ao crânio(Figura 5D). NOTA: Certifique-se de espaçar os orifícios longe o suficiente dos orifícios de rebarbas de coordenadas angulares para acomodar a porção de ferrule da fibra óptica que fica acima do crânio.</li>
	<li>O mais suave possível, use a pequena chave de fenda plana para definir os parafusos ósseos de tal forma que eles se sentem firmemente no crânio, mas não penetrem no cérebro.</li>
	<li>Fixar uma cânula fibra óptica no suporte da cânula e colocá-la no suporte estereotático.</li>
	<li>Gire a cabeça para o ângulo calculado, observando novamente que as coordenadas do micromanipulador não se aplicam à nova ferramenta. Use o centro dos orifícios de rebarba angular como alvo de implantação.</li>
	<li>Abaixe a fibra óptica até que ela só toque a dura dentro do centro do orifício de rebarba(Figura 5C). Zero o micromanipulador no eixo z, depois lentamente mais lento o fibra óptica para a coordenada angular D/V (-5,4 por exemplo VMN).</li>
	<li>Use gel de cianoacrilato para conectar a ferrule fibra óptica aos parafusos de âncora ipsilateral e, em seguida, aplique um acelerador com uma ponta de micropipette(Figura 5D).</li>
	<li>Uma vez que o gel de cianoacrilato tenha endurecido completamente, solte suavemente o suporte da cânula e levante até ficar longe da ferrula fibra óptica.</li>
	<li>Repita as etapas 8.5-8.9 para a coordenada em ângulo contralateral e, em seguida, nivele a cabeça. Para maior segurança, faça uma conexão adicional entre as duas cânulas de fibra óptica angulares com o gel cianoacrilato e o acelerador(Figura 5D).</li>
	<li>Prepare uma pequena e relativamente fina quantidade de cimento dental. Aplique na superfície do crânio, certificando-se de cobrir completamente os parafusos de âncora e base das cânulas fibraóticas. Deixe o suficiente da ferrula limpa para o acasalamento subsequente com os cabos de remendo de fibra óptica.</li>
	<li>Uma vez que o cimento esteja seco, remova o mouse do aparelho estereotático.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação com suporte térmico. Permita que ele se recupere e transfira para a gaiola doméstica assim que aparecer alerta, móvel e estiver preparando.</li>
</ol>9. Cuidados pós-cirúrgicos
<ol><li>Monitore os animais diariamente durante 3 dias pós-operatórios para comportamento, postura, atividade e aliciamento, e mantenha registros de ingestão de alimentos e peso corporal.</li>
	<li>Se os animais apresentarem algum indicador geral de dor ou saúde ruim, consulte os serviços veterinários.</li>
	<li>Permita aos camundongos pelo menos 2 semanas para recuperação e para expressão viral antes de iniciar estudos comportamentais.</li>
</ol>10. Optogenética
<ol><li>Para a realização de estudos optogenéticos, consulte Sidor et al.8.</li>
	<li>Validar a expressão viral e a colocação de fibras na conclusão dos estudos.</li>
</ol>

<ol>
	<li>King, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise,+fall,+and+resurrection+of+the+ventromedial+hypothalamus+in+the+regulation+of+feeding+behavior+and+body+weight.">The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight.</a> Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89, 683-694 (2016).</li><li>Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Intracerebral+Stereotaxic+Injections+for+Optogenetic+Stimulation+of+Long-Range+Inputs+in+Mouse+Brain+Slices.">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).</li><li>Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing,+packaging,+and+delivery+of+high+titer+crispr+retro+and+lentiviruses+via+stereotaxic+injection.">Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).</li><li>McSweeney, C., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Stereotactic+Injection+Technique+to+Study+Genetic+Effects+on+Animal+Behaviors.">Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).</li><li>Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Neuroscience+of+Homeostasis+and+Drives+for+Food,+Water,+and+Salt.">New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt.</a> New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).</li><li>Sidor, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optogenetic+stimulation+of+the+rodent+central+nervous+system.">In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).</li><li>Faber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Neuronal+Projections+from+the+Hypothalamic+Ventromedial+Nucleus+Mediate+Glycemic+and+Behavioral+Effects.">Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects.</a> Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+foundations+of+optogenetics:+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity.">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).</li><li>Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+customizable+procedure+for+angled+stereotaxic+implantation+and+microinjection+in+the+rodent+brain.">A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain.</a> Kopf Carrier. 96, (2019).</li><li>Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Adeno-associated+Virus+Injection+and+Cannula+Implantation+in+the+Dorsal+Raphe+Nucleus+of+Mice.">Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice.</a> Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).</li><li>Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+topic+in+optogenetics:+new+implications+of+in+vivo+tissue+heating.">Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating.</a> Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os recentes avanços na neurociência têm apoiado a visão avançada e a compreensão sobre a atividade e a função dos neurociruques cerebrais. Isso inclui a aplicação de tecnologias optogenéticas e quimiéticas para ativar ou silenciar populações neuronais discretas e seus locais de projeção in vivo. Mais recentemente, isso incluiu o desenvolvimento de indicadores de cálcio geneticamente codificados (por exemplo, GCaMP, RCaMP) e outros biosensores fluorométricos (por exemplo, dopamina, norepinefrina) para o ...

O controle neural do comportamento, da alimentação e do metabolismo envolve a coordenação de neurocircuitos altamente complexos, integrativos e redundantes. Um objetivo do campo da neurociência é dissecar a relação entre estrutura de circuito neuronal e função. Embora as ferramentas clássicas de neurociência (ou seja, lesões, injeções farmacológicas locais e estimulação elétrica) tenham descoberto conhecimentos vitais sobre o papel de regiões cerebrais específicas que controlam o comportamento e o metabolismo, essas ferramentas são limitadas pela falta de especificidade e reversibilidade1.
Os recentes avanços no campo da neurociência melhoraram muito a capacidade de interrogar e manipular a função do circuito de forma específica do tipo celular com alta resolução espacial. Abordagens optogenéticas2 equimiogenética 3, por exemplo, permitem a manipulação rápida e reversível da atividade em tipos celulares geneticamente definidos de animais em movimento livre. A optogenética envolve o uso de canais de íons sensíveis à luz, denominados channelrhodopsins, para controlar a atividade neuronal. A chave para esta técnica é a entrega genética de channelrhodopsin e uma fonte de luz para ativar a opsina. Uma estratégia comum para a entrega de genes é através de uma combinação de 1) camundongos geneticamente modificados expressando Cre-recombinase em neurônios discretos, e 2) vetores virais dependentes de Cre codificando channelrhodopsin.
Embora a optogenética forneça um meio elegante e altamente preciso para controlar a atividade neuronal, o método depende da microinjeção estereotática bem sucedida do vetor viral e da colocação fibra óptica em uma região cerebral definida. Embora os procedimentos estereotáticos sejam comuns dentro do moderno laboratório de neurociência (e existem vários protocolos excelentes descrevendo este procedimento)4,5,6, ser capaz de atingir de forma consistente e reprodutivelmente regiões cerebrais discretas ao longo da linha média (ou seja, o hipotálamo mediobasal, uma área cerebral crítica à regulação das funções homeostáticas7) apresenta desafios adicionais. Esses desafios incluem evitar o seio sagital superior, terceiro ventrículo e núcleos hipotalâmicos adjacentes. Além disso, há limitações espaciais significativas para a implantação bilateral de hardware que é necessária para estudos de inibição. Com esses desafios em mente, este protocolo aqui apresenta um procedimento modificável para atingir regiões cerebrais discretas através de uma abordagem estereática angular.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiberoptic Cannulae</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT</td>
			<td>Customizable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1905 Alignment Indicator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1915 Centering Scope</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1940 Micro Manipulator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro4 Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse bone screws</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>00-96 X 1/16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>XCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>Ideal Micro Drill</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques

A cirurgia estereotática é uma ferramenta essencial no laboratório de neurociência moderno. No entanto, a capacidade de atingir com precisão e precisão regiões cerebrais de difícil acesso ainda apresenta um desafio, particularmente quando se mira estruturas cerebrais ao longo da linha média. Esses desafios incluem evitar o seio sagital superior e o terceiro ventrículo e a capacidade de atingir consistentemente núcleos cerebrais seletivos e discretos. Além disso, técnicas de neurociência mais avançadas (por exemplo, optogenética, fotometria de fibras e imagem de dois fótons) dependem da implantação direcionada de hardware significativo para o cérebro, e limitações espaciais são um obstáculo comum. Apresentado aqui é um protocolo modificável para alvo estereotático de estruturas cerebrais de roedores usando uma abordagem coronal angular. Pode ser adaptado para 1) modelos de camundongos ou ratos, 2) várias técnicas de neurociência e 3) múltiplas regiões cerebrais. Como exemplo representativo, inclui o cálculo de coordenadas estereotáticas para direcionamento do núcleo ventromedial hipotalâmico do camundongo (VMN) para um experimento de inibição optogenética. Este procedimento começa com a microinjeção bilateral de um vírus associado ao adeno (AAV) codificando um canal de cloreto sensível à luz (SwiChR++) a um modelo de rato dependente de Cre, seguido pela implantação bilateral em ângulo de cânulas de fibra óptica. Usando essa abordagem, os achados mostram que a ativação de um subconjunto de neurônios VMN é necessária para respostas contra-regulatórias de glicose intactas à hipoglicemia induzida pela insulina.

Este protocolo descreve um procedimento cirúrgico para a realização de estudos optogenéticos para interrogar o papel dos neurônios VMN hipotalâmicos no controle glicêmico9. A primeira utilização foi uma abordagem estereotática padrão (não angular) para a microinjeção bilateral de um vírus de canalrhodopsina inibitória para o VMN. Embora uma abordagem angular também seja adequada, a abordagem padrão (não angular) foi selecionada porque é suficiente para atingir a região do cér...

Watch this Scientific Journal Video about Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques at JoVE.com

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Descrito aqui é um procedimento estereotático que pode atingir regiões cerebrais desafiadoras e de difícil acesso (devido a limitações espaciais) usando uma abordagem coronal angular. Este protocolo é adaptável tanto aos modelos de camundongos quanto a ratos e pode ser aplicado a diversas aplicações neurocientíficas, incluindo implantação de cânulas e microinjeções de construções virais.

Abordagem estereotática angular adaptável para técnicas versáteis de neurociência

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

adaptable-angled-stereotactic-approach-for-versatile-neuroscience

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.8K visualizações.  University of Washington. Descrito aqui é um procedimento estereotático que pode atingir regiões cerebrais desafiadoras e de difícil acesso (devido a limitações espaciais) usando uma abordagem coronal angular. Este protocolo é adaptável tanto aos modelos de camundongos quanto a ratos e pode ser aplicado a diversas aplicações neurocientíficas, incluindo implantação de cânulas e microinjeções de construções virais.

Vídeo: Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

A Novel Approach for Documenting Phosphenes Induced by Transcranial Magnetic Stimulation

Stimulation of the human visual cortex produces a transient perception of light, known as a phosphene. Phosphenes are induced by invasive electrical stimulation of the occipital cortex, but also by non-invasive Transcranial Magnetic Stimulation (TMS)1 of the same cortical regions. The intensity at which a phosphene is induced (phosphene threshold) is a well established measure of visual cortical excitability and is used to study cortico-cortical interactions, functional organization 2, susceptibility to pathology 3,4 and visual processing 5-7. Phosphenes are typically defined by three characteristics: they are observed in the visual hemifield contralateral to stimulation; they are induced when the subject s eyes are open or closed, and their spatial location changes with the direction of gaze 2. Various methods have been used to document phosphenes, but a standardized methodology is lacking. We demonstrate a reliable procedure to obtain phosphene threshold values and introduce a novel system for the documentation and analysis of phosphenes. We developed the Laser Tracking and Painting system (LTaP), a low cost, easily built and operated system that records the location and size of perceived phosphenes in real-time. The LTaP system provides a stable and customizable environment for quantification and analysis of phosphenes.

Phosphenes are transient percepts of light that can be induced by applying Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to visually sensitive regions of cortex. We demonstrate a standard protocol for determining the phosphene threshold value and introduce a novel method for quantifying and analyzing perceived phosphenes.

Uma nova abordagem para a Documentação fosfenos induzidos por estimulação magnética transcraniana

Stimulation of the human visual cortex produces a transient perception of light, known as a phosphene. Phosphenes are induced by invasive electrical ...

Neurociência

High Density Event-related Potential  Data Acquisition in Cognitive Neuroscience

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part because fMRI data acquisition and analysis techniques are readily available. Because fMRI has excellent spatial resolution but poor temporal resolution, this method can only be used to identify the spatial location of brain activity associated with a given cognitive process (and reveals virtually nothing about the time course of brain activity). By contrast, event-related potential (ERP) recording, a method that is used much less frequently than fMRI, has excellent temporal resolution and thus can track rapid temporal modulations in neural activity. Unfortunately, ERPs are under utilized in Cognitive Neuroscience because data acquisition techniques are not readily available and low density ERP recording has poor spatial resolution. In an effort to foster the increased use of ERPs in Cognitive Neuroscience, the present article details key techniques involved in high density ERP data acquisition. Critically, high density ERPs offer the promise of excellent temporal resolution and good spatial resolution (or excellent spatial resolution if coupled with fMRI), which is necessary to capture the spatial-temporal dynamics of human brain function.

Event-related potential (ERP) recording is under utilized in Cognitive Neuroscience because data acquisition techniques are not readily available and this method often has poor spatial resolution. To foster the increased use of ERPs in Cognitive Neuroscience, the present article details key techniques involved in high density ERP data acquisition.

Evento relacionados com alta densidade de Aquisição de Dados Potencial em Neurociência Cognitiva

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

Cirurgia estereotáxica de roedores e animais Melhorias Resultado do Bem-Estar de Neurociência Comportamental

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

Um sistema totalmente automatizado e altamente versátil para testes de várias funções cognitivas e registro das atividades neuronais em roedores

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Investigating the Function of Deep Cortical and Subcortical Structures Using Stereotactic Electroencephalography: Lessons from the Anterior Cingulate Cortex

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure involves the chronic placement of multiple depth electrodes into regions of the brain typically inaccessible via subdural grid electrode placement. SEEG thus provides a unique opportunity to investigate brain function. In this paper we demonstrate how SEEG can be used to investigate the role of the dorsal anterior cingulate cortex (dACC) in cognitive control. We include a description of the SEEG procedure, demonstrating the surgical placement of the electrodes. We describe the components and process required to record local field potential (LFP) data from consenting subjects while they are engaged in a behavioral task. In the example provided, subjects play a cognitive interference task, and we demonstrate how signals are recorded and analyzed from electrodes in the dorsal anterior cingulate cortex, an area intimately involved in decision-making. We conclude with further suggestions of ways in which this method can be used for investigating human cognitive processes.

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is an operative technique used in epilepsy surgery to help localize seizure foci. It also affords a unique opportunity to investigate brain function. Here we describe how SEEG can be used to investigate cognitive processes in human subjects.

Investigar a função do Deep Cortical e estruturas subcorticais Usando estereotáxica Eletroencefalografia: Lições da Cortex cingulado anterior

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

Uma alternativa simples para injeção estereotáxica para Brain Knockdown específico de miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

Abordagem endoscópica Endonasal Trans-esfenoidal: Cirurgia minimamente invasiva para Adenomas da hipófise

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Estereotáxica guiada por Atlas Laser Microdissection de captura de regiões do cérebro afetadas por lesão traumática

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by immunizing mice with neurogenic peptides to direct an inflammatory attack toward components of the peripheral nervous system (PNS). Recent advances have enabled the induction of EAN in the relatively resistant C57BL/6 mouse line using myelin protein zero (P0)106-125 or P0180-199 peptides delivered in adjuvant combined with the injection of pertussis toxin. The ability to induce EAN in the C57BL/6 strain allows for the use of the numerous genetic tools that exist on this mouse background, and thus allows the sophisticated study of disease pathogenesis and interrogation of the mechanistic action of novel therapeutics in combination with transgenic approaches. In this study, we demonstrate a simple approach to successfully induce EAN using the P0180-199 peptide in C57BL/6 mice. We also outline a protocol for the assessment of functional deficits that occur in this model, accompanied by an array of neuropathological features. Thus, this model is a powerful experimental model to study the pathogenesis of human peripheral demyelinating neuropathies, and to determine the efficacy of potential therapies that aim to promote myelin repair and protect against nerve damage in autoimmune neuritis.

This report outlines a simple approach to successfully induce experimental autoimmune neuritis (EAN) using the myelin protein zero (P0)180-199 peptide in combination with Freund&#39;s complete adjuvant and pertussis toxin. We present a sophisticated paradigm capable of accurately assessing the extent of functional deficits and neuropathology that occur in this EAN.

Uma abordagem simples para induzir a neurite auto-imune Experimental em camundongos C57BL/6 para avaliações funcionais e neuropatológicas

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative studies of the changes in densities and distributions of such features, an unbiased sampling protocol is vital for reliable results. Here, we present a workflow for the image acquisition of brain samples. The workflow allows systematic uniform random sampling within a defined brain region, and the images can be analyzed using a disector. This technique is much faster than extensive examination of serial sections but still presents a feasible approach to estimate the densities and distributions of ultrastructure features. Before embedding, stained vibratome sections were used as a reference to identify the brain region under investigation, which helped speed up the overall specimen preparation process. This approach was used for comparative studies investigating the effect of an enriched-housing environment on several ultrastructural parameters in the mouse brain. Based on the successful use of the workflow, we adapted it for the purpose of elemental analysis of brain samples. We optimized the protocol in terms of the time of user-interaction. Automating all the time-consuming steps by compiling a script for the open source software SerialEM helps the user to focus on the main work of acquiring the elemental maps. As in the original workflow, we paid attention to the unbiased sampling approach to guarantee reliable results.

We introduce a novel workflow for electron microscopy investigations of brain tissue. The method allows the user to examine neuronal features in an unbiased fashion. For elemental analysis, we also present a script that automatizes most of the workflow for randomized sampling.

Uma abordagem imparcial de amostragem TEM seções em neurociência

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...