Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) concede F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), un American Diabetes Association Innovative Basic Science Award (#1-19-IBS-192 a G.J.M.) e il Nutrition Obesity Research Center (DK-035816), Diabetes Research Center (DK-017047) e Diabetes, Obesity and Metabolism Training Grant T32 DK0007247 (T.H.M) presso l'Università di Washington.

Tutte le procedure sono state approvate in conformità con il National Institutes of Health, la Guida per la cura e l'uso degli animali e sono state approvate sia dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) che dalla Environmental Health and Safety dell'Università di Washington.
1. Calcolo delle coordinate angolate
<ol><li>Usando un atlante cerebrale coronale, segna un triangolo rettangolo in modo che l'ipoteno passi attraverso la regione target di interesse. Nell'esempio rappresentativo (Figura 1), il nucleo ventromediale ipotalamico (VMN) è mirato ad un angolo di 15° rispetto alla linea mediana coronale. NOTA: Il posizionamento dell'asse di rotazione raffigurato nella Figura 1 (e quindi la lunghezza del lato C) è arbitrario e può essere modificato per colpire qualsiasi regione del cervello. Anche se questo può sembrare controintuitivo, i passaggi successivi del protocollo regoleranno la posizione della testa nell'asse z in modo tale che questo punto si allinei con il centro di rotazione stereotassico (vedere paragrafo 6). Tuttavia, si raccomanda di non superare un angolo di rotazione coronale di 15° a causa di vincoli fisici dell'apparato portatesta.</li>
	<li>Stabilire l'angolo desiderato (a) e la lunghezza stimata del lato B e utilizzare la trigonometria per calcolare la lunghezza dei lati A e C. Questo passaggio è importante per posizionare correttamente la testa durante la rotazione. NOTA: nell'esempio nella Figura 1, le linee della griglia dell'atlante vengono utilizzate per approssimare la lunghezza del lato B, ottenendo una lunghezza di 7,576 mm. Queste informazioni vengono utilizzate per calcolare la lunghezza del lato A: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ01.jpg"> In questo esempio, 2,03 mm indicano la distanza R/L dalla linea mediana alla quale la cannula a fibre ottiche entra nel cervello quando la testa viene ruotata di 15°.<ol>
<li>Facoltativamente, calcolate la lunghezza del lato C per approssimare la coordinata D/V: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ02.jpg"> NOTA: 1) La lunghezza dell'ipoteno (C) non rappresenta la profondità di iniezione, ma sarà utile per determinare la coordinata D / V, che potrebbe essere necessario regolare per adattarsi alla maggiore lunghezza rispetto al lato B per le iniezioni dirette. Si raccomanda pertanto di eseguire iniezioni di prova per ottimizzare la coordinata D/V. 2) In questo esempio mirato al VMN, si ottengono due insiemi di coordinate: una per la microiniezione non angolata (A/P = -1,4, R/L = 0,4 a 0°, D/V = -5,7) e una per l'impianto angolato di fibre ottiche (A/P = -1,4, R/L = 0,0 a 15°, D/V = -5,4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione della stereotassa per la procedura angolata
<ol><li>Verificare che il telaio stereotassico e il micromanipolatore siano stati calibrati (vedere il manuale Kopf per il protocollo completo).</li>
	<li>Posizionare il misuratore di altezza centrale nella presa della piastra di base del supporto della testa.</li>
	<li>Fissare l'oscilloscopio di centraggio nel portautensili, quindi vedere l'oscilloscopio. Regolare la posizione del micromanipolatore fino a quando il mirino non è allineato e focalizzato sul mirino del calibro. NOTA: durante questa fase, l'oscilloscopio viene posizionato nel piano focale del centro di rotazione del supporto della testa. Una volta stabilito, il micromanipolatore non deve essere spostato durante i passaggi rimanenti.</li>
	<li>Posizionare le barre auricolari nei supporti e centrarle in modo che le linee degli indicatori su entrambi i lati siano a 0 (Figura 3A).</li>
	<li>Utilizzare le manopole mediale-laterali e anteriormente-posteriori sul supporto della testa (Figura 2) per allineare al centro le barre auricolari nei piani x e y sopra il mirino del misuratore di altezza centrale (Figura 3A).</li>
	<li>Per allineare la posizione della barra auricolare nell'asse z, rimuovere le barre auricolari dal supporto e rimuovere il misuratore di altezza centrale. Sostituire le barre auricolari e centrarle di nuovo a 0.</li>
	<li>Vista giù per l'ambito. Utilizzare la manopola di spostamento verticale (Figura 3B) e la manopola di inclinazione coronale, rispettivamente, per abbassare e ruotare le barre auricolari fino a quando il mirino dell'oscilloscopio rimane centrato tra le barre auricolari durante la rotazione coronale.</li>
	<li>La stereotassa è ora calibrata e pronta. Non apportare ulteriori modifiche alla posizione del supporto della testa.</li>
</ol>3. Preparazione dei materiali per l'iniezione/impianto
<ol><li>Assicurarsi che tutti gli strumenti, gli strumenti chirurgici e i materiali siano sterilizzati e collocati in un campo chirurgico sterile accanto alla stereotassa.</li>
	<li>Gestire e conservare i costrutti virali in base al loro livello di biosicurezza e ai requisiti normativi istituzionali di biosicurezza pertinenti.</li>
	<li>Aspirare il virus nella siringa, avendo cura di utilizzare pratiche di manipolazione adeguate e dispositivi di protezione individuale.</li>
</ol>4. Anestesia
<ol><li>Registrare il peso corporeo del topo prima dell'intervento chirurgico.</li>
	<li>Anestetizzare profondamente il mouse usando l'isoflurano.</li>
	<li>Assicurarsi che il mouse sia profondamente anestetizzato eseguendo un test di pizzicamento della dita fino a quando la risposta di flinching non è assente. Se l'animale continua a mostrare forti riflessi, aumentare la concentrazione e/o la durata dell'anestesia.</li>
	<li>Applicare unguento per gli occhi su ciascun occhio per mantenerli umidi durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Rasare il cuoio capelluto da appena dietro le orecchie a appena dietro gli occhi con un tagliacapelli.</li>
	<li>Fornire al topo un analgesico approvato da IACUC.</li>
	<li>Monitorare continuamente l'animale durante la procedura chirurgica e fornire supporto termico.</li>
</ol>5. Procedura chirurgica
<ol><li>Posizionare la testa nel supporto della testa posizionando gli incisivi superiori nello spazio nella barra del morso, assicurandosi che la lingua sia al di sotto della barra del morso.</li>
	<li>Fissare la testa nelle barre auricolari inserendo delicatamente le barre auricolari nel meato uditivo esterno, assicurandosi che le barre auricolari siano posizionate simmetricamente (in genere tra tre e quattro per un topo adulto). Questo passaggio è fondamentale per garantire che la testa sia stabile e centrata per la rotazione.</li>
	<li>Preparare asetticamente l'area di incisione rasata con tre scrub alternati di betadina e tamponi alcolici, o con preparazione alternativa del sito chirurgico approvata istituzionalmente.</li>
	<li>Posizionare un drappo chirurgico sopra l'animale per mantenere un campo chirurgico sterile e ridurre il rischio di infezione post-operatoria.</li>
	<li>Esporre il cranio facendo un'incisione lungo la linea mediana sagittale del cuoio capelluto. Raschiare delicatamente la superficie del cranio per rimuovere qualsiasi fascia ed esporre le suture. NOTA: se le linee di sutura sono difficili da visualizzare, il perossido di idrogeno può essere applicato al cranio utilizzando un applicatore sterile con punta di cotone per migliorare la visualizzazione della sutura.</li>
	<li>Posizionare il cannocchiale di centraggio nel supporto e centrare il mirino su bregma (Figura 4, pannello di sinistra). Azzerare il micromanipolatore.</li>
	<li>Sposta caudale il mirino su lambda, notando la distanza bregma-lambda (B-L). NOTA: se le linee di sutura non seguono una linea retta lungo la linea mediana, si consiglia di stabilire la linea mediana utilizzando la "linea di migliore adattamento" attraverso bregma e lambda. Tuttavia, se vengono seguiti i passaggi precedenti, il posizionamento iniziale del reticolo dell'oscilloscopio deve essere a metà strada tra le barre auricolari e avvicinarsi strettamente alla sutura della linea mediana B-L.</li>
	<li>Se la distanza B-L è significativamente inferiore o superiore a 4,21 mm, regolare in modo incrementale il bregma assegnato per ottenere una distanza B-L di 4,21 mm ± 0,2 mm.</li>
	<li>Sostituire l'ambito di centraggio con l'indicatore di allineamento. Posizionare le sonde su lambda e bregma e regolare la manopola di inclinazione dorsale sul supporto della testa per livellare nel piano sagittale (naso rivolto verso l'alto o verso il basso), quindi utilizzare il cannocchiale di centraggio per riassegnare bregma.</li>
	<li>Utilizzare l'indicatore di allineamento per livellare nel piano coronale utilizzando la manopola di inclinazione coronale. Misurare in più punti lungo l'asse rostrale/caudale per tenere conto delle deformazioni superficiali del cranio.</li>
	<li>Si noti la posizione sul quadrante della manopola di inclinazione coronale, in quanto questa è la posizione di rotazione di 0 °.</li>
</ol>6. Allineamento degli assi centrali di rotazione per le coordinate angolate
<ol><li>Fissare l'oscilloscopio di centraggio nel portautensili e posizionare il micromanipolatore sulla coordinata calcolata dalla sezione 1. Si noti che la coordinata R/L per l'impianto angolato corrisponde alla lunghezza del lato A.<ol>
<li>Nell'esempio nella Figura 1, le coordinate angolate per il posizionamento in fibra ottica che mira al VMN sono (A/P = -1.4, R/L = [2.03] a rotazione coronale di 0°, [0.00] a rotazione coronale di 15°, D/V = -5.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avvistare l'oscilloscopio e contrassegnare questa coordinata (R/L 2,03 mm dalla linea mediana per l'esempio VMN; Figura 4, pannello centrale). Questo segno rappresenta il punto in cui la cannula entrerà nel cervello una volta ruotata la testa.</li>
	<li>Riposizionare il micromanipolatore sulla linea mediana (R/L = 0,00). Utilizzare la manopola di inclinazione coronale per ruotare la testa fino all'angolo calcolato nella sezione 1.<ol>
<li>Se il mirino dell'ambito è già allineato con il marchio, procedere alla sezione 7.</li>
		<li>Se il mirino dell'oscilloscopio non è allineato con il segno di riferimento, regolare la posizione della testa nell'asse z utilizzando la manopola di spostamento verticale (Figura 2) fino a quando il mirino non si allinea il più vicino possibile al segno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ruotare la testa all'indietro fino alla posizione coronale di 0°. Se lo spostamento verticale è stato regolato nel passaggio 6.3, riassegnare bregma utilizzando l'oscilloscopio di centraggio.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 6.3 e 6.4 fino a quando il mirino non colpisce costantemente il segno di riferimento quando la testa viene ruotata (Figura 4C).</li>
	<li>A questo punto, il punto di rotazione arbitrario stabilito nella sezione 1 dovrebbe ora essere allineato con il centro di rotazione stereotassico.</li>
</ol>7. Microiniezione
<ol><li>Posizionare il trapano stereotassico nel supporto e manovrare il micromanipolatore alla prima coordinata di iniezione.<ol>
<li>Secondo l'esempio per il targeting del VMN, forare a A/P = -1,4 e R/L = 0,4 mentre la testa è in piano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abbassare il trapano fino a quando la punta è appena sopra il cranio. Accendere il trapano e abbassare delicatamente fino a quando la punta non ha appena perforato il cranio (non la dura).</li>
	<li>Ripetere per il sito di iniezione controlaterale.</li>
	<li>Utilizzare un ago-driver sterile per introdurre una curva a 90° in un ago da 27-30 G (ad esempio, di una siringa da insulina sterile da 0,5 ml) e utilizzare l'ago piegato per colpire delicatamente la dura madre.</li>
	<li>NOTA: in caso di sanguinamento, applicare una pressione con un applicatore sterile con punta di cotone e pulire con acqua sterile fino a quando il sanguinamento non si è fermato.</li>
	<li>Quando è pronto per l'iniezione, posizionare con cura una siringa hamilton piena nel supporto stereotassico. NOTA: le coordinate sul micromanipolatore non si applicano più dopo il passaggio a un nuovo utensile. Utilizzare il centro del foro della bava come nuovo bersaglio per l'iniezione.</li>
	<li>Posizionare con attenzione l'ago sopra il foro della bava.</li>
	<li>Abbassare l'ago fino a quando non tocca leggermente la dura all'interno del centro del foro della bava. CRITICO: Azzerare il micromanipolatore solo nell'asse z, in modo tale che le coordinate sul micromanipolatore per l'oscilloscopio di centraggio stereotassico e il trapano siano mantenute.</li>
	<li>Abbassare lentamente l'ago nel cervello, osservando attentamente per assicurarsi che l'ago non devii sul bordo del foro della bava. Continuare ad abbassare fino a 0,05 mm ventrali alla coordinata di iniezione D/V e attendere 1 min. Questo passaggio aggiuntivo crea una piccola "tasca" per ridurre al minimo il riflusso virale sulla rimozione dell'ago.</li>
	<li>Sollevare lentamente l'ago alla coordinata D/V e iniziare l'iniezione. NOTA: la portata e il volume variano a seconda della regione di destinazione e del progetto sperimentale. Per il silenziamento optogenetico dei neuroni VMN, si desidera una copertura sufficiente, quindi 200 nL di virus vengono iniettati ad una velocità di 1 nL / s.</li>
	<li>Dopo la microiniezione, attendere 10 minuti nel sito di iniezione per ridurre al minimo l'efflusso del virus durante la sospensione.</li>
	<li>Prelevare lentamente la micropipetta dal cervello ad una velocità approssimativa di 1 mm/min.</li>
	<li>Una volta che l'ago è libero dal cranio, espellere un piccolo volume di virus per assicurarsi che l'ago non si sia intasato di sangue o tessuti. Utilizzare un applicatore sterile con punta di cotone per rimuovere il virus prima di continuare.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 7,6 a 7,12 per il lato controlaterale.</li>
	<li>Sigillare i fori della bava di microiniezione con cera ossea per migliorare la guarigione (Figura 5B).</li>
</ol>8. Impianto di fibre ottiche
NOTA: Dopo l'iniezione virale, le cannule bilaterali in fibra ottica vengono impiantate all'angolo calcolato per sezione 1. Si noti che queste coordinate dovrebbero già essere segnate sul cranio dalla sezione 6.
<ol><li>Ripetete i passaggi 7.1 –7.4 per le coordinate angolate.</li>
	<li>Riportare la testa in posizione di livello 0°.</li>
	<li>Quindi, utilizzare il trapano a mano per produrre quattro fori aggiuntivi per le viti ossee: due devono essere posizionati anteriormente e due posteriormente (Figura 5A). Questi serviranno come ancore per fissare le fibre ottiche al cranio (Figura 5D). NOTA: Assicurarsi di distanziare i fori abbastanza lontano dai fori della bava delle coordinate angolate per ospitare la porzione di ghiera della fibra ottica che si trova sopra il cranio.</li>
	<li>Il più delicatamente possibile, utilizzare il piccolo cacciavite a testa piatta per impostare le viti ossee in modo che si siedano saldamente nel cranio ma non penetrino nel cervello.</li>
	<li>Bloccare una cannula a fibre ottiche nel supporto della cannula e posizionarla nel supporto stereotassico.</li>
	<li>Ruotare la testa fino all'angolo calcolato, notando nuovamente che le coordinate sul micromanipolatore non si applicano al nuovo utensile. Utilizzare il centro dei fori di bava angolati come bersaglio dell'impianto.</li>
	<li>Abbassare la fibra ottica fino a quando non tocca la dura all'interno del centro del foro della bava (Figura 5C). Azzerare il micromanipolatore nell'asse z, quindi rallentare lentamente la fibra ottica alla coordinata angolata D/V (-5,4 per l'esempio VMN).</li>
	<li>Utilizzare gel cianoacrilato per collegare la ghiera in fibra ottica alle viti di ancoraggio ipsilaterali, quindi applicare un accelerante con una punta a micropipetta (Figura 5D).</li>
	<li>Una volta che il gel di cianoacrilato si è completamente indurito, allentare delicatamente il supporto della cannula e sollevarlo fino a quando non si libera della ghiera della fibra ottica.</li>
	<li>Ripetete i passaggi da 8,5 a 8,9 per la coordinata angolata controlaterale, quindi livellate la testa. Per una maggiore sicurezza, effettuare una connessione aggiuntiva tra le due cannule angolate in fibra ottica con il gel cianoacrilato e l'accelerante (Figura 5D).</li>
	<li>Preparare una piccola quantità relativamente sottile di cemento dentale. Applicare sulla superficie del cranio, assicurandosi di coprire accuratamente le viti di ancoraggio e la base delle cannule in fibra ottica. Lasciare abbastanza della ghiera pulita per il successivo accoppiamento con i cavi patch in fibra ottica.</li>
	<li>Una volta che il cemento è stato completato a secco, rimuovere il mouse dall'apparato stereotassico.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una gabbia di recupero con supporto termico. Consenti che si riprenda e si trasferisca nella gabbia di casa una volta che appare vigile, mobile e sta pulendo.</li>
</ol>9. Cure post-chirurgiche
<ol><li>Monitorare gli animali ogni giorno per 3 giorni post-operatoriamente per comportamento, postura, attività e toelettatura e tenere registri dell'assunzione di cibo e del peso corporeo.</li>
	<li>Se gli animali presentano indicatori generali di dolore o cattiva salute, consultare i servizi veterinari.</li>
	<li>Consentire ai topi almeno 2 settimane per il recupero e per l'espressione virale prima di iniziare gli studi comportamentali.</li>
</ol>10. Optogenetica
<ol><li>Per l'esecuzione di studi di optogenetica, fare riferimento a Sidor et al.8.</li>
	<li>Convalidare l'espressione virale e il posizionamento delle fibre al completamento degli studi.</li>
</ol>

<ol>
	<li>King, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise,+fall,+and+resurrection+of+the+ventromedial+hypothalamus+in+the+regulation+of+feeding+behavior+and+body+weight.">The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight.</a> Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89, 683-694 (2016).</li><li>Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Intracerebral+Stereotaxic+Injections+for+Optogenetic+Stimulation+of+Long-Range+Inputs+in+Mouse+Brain+Slices.">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).</li><li>Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing,+packaging,+and+delivery+of+high+titer+crispr+retro+and+lentiviruses+via+stereotaxic+injection.">Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).</li><li>McSweeney, C., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Stereotactic+Injection+Technique+to+Study+Genetic+Effects+on+Animal+Behaviors.">Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).</li><li>Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Neuroscience+of+Homeostasis+and+Drives+for+Food,+Water,+and+Salt.">New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt.</a> New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).</li><li>Sidor, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optogenetic+stimulation+of+the+rodent+central+nervous+system.">In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).</li><li>Faber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Neuronal+Projections+from+the+Hypothalamic+Ventromedial+Nucleus+Mediate+Glycemic+and+Behavioral+Effects.">Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects.</a> Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+foundations+of+optogenetics:+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity.">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).</li><li>Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+customizable+procedure+for+angled+stereotaxic+implantation+and+microinjection+in+the+rodent+brain.">A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain.</a> Kopf Carrier. 96, (2019).</li><li>Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Adeno-associated+Virus+Injection+and+Cannula+Implantation+in+the+Dorsal+Raphe+Nucleus+of+Mice.">Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice.</a> Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).</li><li>Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+topic+in+optogenetics:+new+implications+of+in+vivo+tissue+heating.">Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating.</a> Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I recenti progressi nelle neuroscienze hanno supportato l'intuizione avanzata e la comprensione dell'attività e della funzione dei neurocircuiti cerebrali. Ciò include l'applicazione di tecnologie optogenetiche e chemiogenetiche per attivare o silenziare popolazioni neuronali discrete e i loro siti di proiezione in vivo. Più recentemente, questo ha incluso lo sviluppo di indicatori di calcio geneticamente codificati (ad esempio, GCaMP, RCaMP) e altri biosensori fluorometrici (ad esempio, dopamina, noradrenalina) per l...

Il controllo neurale del comportamento, dell'alimentazione e del metabolismo comporta il coordinamento di neurocircuiti altamente complessi, integrativi e ridondanti. Un obiettivo trainante del campo delle neuroscienze è quello di sezionare la relazione tra struttura e funzione del circuito neuronale. Sebbene gli strumenti classici delle neuroscienze (ad esempio, lesioni, iniezioni farmacologiche locali e stimolazione elettrica) abbiano scoperto conoscenze vitali riguardanti il ruolo di specifiche regioni del cervello che controllano il comportamento e il metabolismo, questi strumenti sono limitati dalla loro mancanza di specificità e reversibilità1.
I recenti progressi nel campo delle neuroscienze hanno notevolmente migliorato la capacità di interrogare e manipolare la funzione del circuito in un modo specifico di tipo cellulare con un'alta risoluzione spaziotemporale. Gli approcci optogenetici2 e chemiogenetici3, ad esempio, consentono la manipolazione rapida e reversibile dell'attività in tipi di cellule geneticamente definiti di animali che si muovono liberamente. L'optogenetica prevede l'uso di canali ionici sensibili alla luce, chiamati channelrhodopsins, per controllare l'attività neuronale. La chiave di questa tecnica è la consegna genica di channelrhodopsin e una fonte di luce per attivare l'opsina. Una strategia comune per la consegna dei geni è attraverso una combinazione di 1) topi geneticamente modificati che esprimono Cre-ricombiinasi in neuroni discreti e 2) vettori virali cre-dipendenti che codificano per la channelrhodopsin.
Mentre l'optogenetica fornisce un mezzo elegante e altamente preciso per controllare l'attività neuronale, il metodo è subordinato al successo della microiniezione stereotassica del vettore virale e del posizionamento delle fibre ottiche in una regione cerebrale definita. Sebbene le procedure stereotassica siano comuni all'interno del moderno laboratorio di neuroscienze (e ci sono diversi protocolli eccellenti che descrivono questa procedura)4,5,6, essere in grado di indirizzare in modo coerente e riproducibile regioni cerebrali discrete lungo la linea mediana (cioè l'ipotalamo mediobasale, un'area cerebrale critica per la regolazione delle funzioni omeostatiche7) presenta ulteriori sfide. Queste sfide includono l'evitare il seno sagittale superiore, il terzo ventricolo e i nuclei ipotalamici adiacenti. Inoltre, ci sono significative limitazioni spaziali all'impianto bilaterale di hardware che è necessario per gli studi di inibizione. Con queste sfide in mente, questo protocollo qui presenta una procedura modificabile per il targeting di regioni cerebrali discrete attraverso un approccio stereotassico angolato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiberoptic Cannulae</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT</td>
			<td>Customizable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1905 Alignment Indicator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1915 Centering Scope</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1940 Micro Manipulator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro4 Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse bone screws</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>00-96 X 1/16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>XCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>Ideal Micro Drill</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques

La chirurgia stereotassica è uno strumento essenziale nel moderno laboratorio di neuroscienze. Tuttavia, la capacità di indirizzare in modo preciso e preciso le regioni cerebrali difficili da raggiungere rappresenta ancora una sfida, in particolare quando si prendono di mira le strutture cerebrali lungo la linea mediana. Queste sfide includono l'evitamento del seno sagittale superiore e del terzo ventricolo e la capacità di colpire costantemente nuclei cerebrali selettivi e discreti. Inoltre, le tecniche di neuroscienza più avanzate (ad esempio, optogenetica, fotometria delle fibre e imaging a due fotoni) si basano sull'impianto mirato di hardware significativo al cervello e le limitazioni spaziali sono un ostacolo comune. Qui viene presentato un protocollo modificabile per il targeting stereotassico delle strutture cerebrali dei roditori utilizzando un approccio coronale angolato. Può essere adattato a 1) modelli di topi o ratti, 2) varie tecniche di neuroscienza e 3) più regioni del cervello. Come esempio rappresentativo, include il calcolo delle coordinate stereotassica per il targeting del nucleo ventromediale ipotalamico di topo (VMN) per un esperimento di inibizione optogenetica. Questa procedura inizia con la microiniezione bilaterale di un virus adeno-associato (AAV) che codifica un canale del cloruro sensibile alla luce (SwiChR ++) in un modello murino Cre-dipendente, seguito dall'impianto bilaterale angolato di cannule in fibra ottica. Utilizzando questo approccio, i risultati mostrano che l'attivazione di un sottoinsieme di neuroni VMN è necessaria per le risposte controregolatorie del glucosio intatte all'ipoglicemia indotta dall'insulina.

Questo protocollo descrive una procedura chirurgica per l'esecuzione di studi optogenetici per interrogare il ruolo dei neuroni VMN ipotalamici nel controllo glicemico9. Il primo utilizzo è stato un approccio stereotassico standard (non angolato) per la microiniezione bilaterale di un virus inibitorio channelrhodopsin al VMN. Mentre un approccio angolato sarebbe anche adatto, l'approccio standard (non angolato) è stato scelto perché è sufficiente per indirizzare la regione del cervello di inte...

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Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Qui è descritta una procedura stereotassica che può colpire regioni cerebrali impegnative e difficili da raggiungere (a causa di limitazioni spaziali) utilizzando un approccio coronale angolato. Questo protocollo è adattabile sia a modelli murini che di ratto e può essere applicato a diverse applicazioni neuroscientifiche, tra cui l'impianto di cannule e microiniezioni di costrutti virali.

Approccio stereotassico angolato adattabile per tecniche di neuroscienze versatili

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

adaptable-angled-stereotactic-approach-for-versatile-neuroscience

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.8K Views.  University of Washington. Qui è descritta una procedura stereotassica che può colpire regioni cerebrali impegnative e difficili da raggiungere (a causa di limitazioni spaziali) utilizzando un approccio coronale angolato. Questo protocollo è adattabile sia a modelli murini che di ratto e può essere applicato a diverse applicazioni neuroscientifiche, tra cui l'impianto di cannule e microiniezioni di costrutti virali.

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A Novel Approach for Documenting Phosphenes Induced by Transcranial Magnetic Stimulation

Stimulation of the human visual cortex produces a transient perception of light, known as a phosphene. Phosphenes are induced by invasive electrical stimulation of the occipital cortex, but also by non-invasive Transcranial Magnetic Stimulation (TMS)1 of the same cortical regions. The intensity at which a phosphene is induced (phosphene threshold) is a well established measure of visual cortical excitability and is used to study cortico-cortical interactions, functional organization 2, susceptibility to pathology 3,4 and visual processing 5-7. Phosphenes are typically defined by three characteristics: they are observed in the visual hemifield contralateral to stimulation; they are induced when the subject s eyes are open or closed, and their spatial location changes with the direction of gaze 2. Various methods have been used to document phosphenes, but a standardized methodology is lacking. We demonstrate a reliable procedure to obtain phosphene threshold values and introduce a novel system for the documentation and analysis of phosphenes. We developed the Laser Tracking and Painting system (LTaP), a low cost, easily built and operated system that records the location and size of perceived phosphenes in real-time. The LTaP system provides a stable and customizable environment for quantification and analysis of phosphenes.

Phosphenes are transient percepts of light that can be induced by applying Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to visually sensitive regions of cortex. We demonstrate a standard protocol for determining the phosphene threshold value and introduce a novel method for quantifying and analyzing perceived phosphenes.

Un nuovo approccio per documentare Fosfeni indotta dalla Stimolazione Magnetica Transcranica

Stimulation of the human visual cortex produces a transient perception of light, known as a phosphene. Phosphenes are induced by invasive electrical ...

Ricerca

Neuroscienze

High Density Event-related Potential  Data Acquisition in Cognitive Neuroscience

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part because fMRI data acquisition and analysis techniques are readily available. Because fMRI has excellent spatial resolution but poor temporal resolution, this method can only be used to identify the spatial location of brain activity associated with a given cognitive process (and reveals virtually nothing about the time course of brain activity). By contrast, event-related potential (ERP) recording, a method that is used much less frequently than fMRI, has excellent temporal resolution and thus can track rapid temporal modulations in neural activity. Unfortunately, ERPs are under utilized in Cognitive Neuroscience because data acquisition techniques are not readily available and low density ERP recording has poor spatial resolution. In an effort to foster the increased use of ERPs in Cognitive Neuroscience, the present article details key techniques involved in high density ERP data acquisition. Critically, high density ERPs offer the promise of excellent temporal resolution and good spatial resolution (or excellent spatial resolution if coupled with fMRI), which is necessary to capture the spatial-temporal dynamics of human brain function.

Event-related potential (ERP) recording is under utilized in Cognitive Neuroscience because data acquisition techniques are not readily available and this method often has poor spatial resolution. To foster the increased use of ERPs in Cognitive Neuroscience, the present article details key techniques involved in high density ERP data acquisition.

Ad alta densità di eventi legati potenziale acquisizione dei dati in Neuroscienze Cognitive

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

Chirurgia Stereotassica roditori e animali Miglioramenti Esito di assistenza sociale per Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

Un sistema completamente automatizzato ed altamente versatile per test multi-funzioni cognitive e di registrare le attività neuronali in roditori

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Investigating the Function of Deep Cortical and Subcortical Structures Using Stereotactic Electroencephalography: Lessons from the Anterior Cingulate Cortex

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure involves the chronic placement of multiple depth electrodes into regions of the brain typically inaccessible via subdural grid electrode placement. SEEG thus provides a unique opportunity to investigate brain function. In this paper we demonstrate how SEEG can be used to investigate the role of the dorsal anterior cingulate cortex (dACC) in cognitive control. We include a description of the SEEG procedure, demonstrating the surgical placement of the electrodes. We describe the components and process required to record local field potential (LFP) data from consenting subjects while they are engaged in a behavioral task. In the example provided, subjects play a cognitive interference task, and we demonstrate how signals are recorded and analyzed from electrodes in the dorsal anterior cingulate cortex, an area intimately involved in decision-making. We conclude with further suggestions of ways in which this method can be used for investigating human cognitive processes.

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is an operative technique used in epilepsy surgery to help localize seizure foci. It also affords a unique opportunity to investigate brain function. Here we describe how SEEG can be used to investigate cognitive processes in human subjects.

Indagare la funzione di Deep corticale e strutture sottocorticali Usando stereotassica Elettroencefalografia: gli insegnamenti della corteccia cingolata anteriore

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

Una alternativa semplice per iniezione stereotassica per Brain Knockdown specifico miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

Approccio endoscopico endonasale transfenoidale: Chirurgia mini-invasiva per gli adenomi pituitari

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Atlas-guida stereotassica del Laser Capture Microdissection di regioni del cervello colpite da lesione traumatica

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by immunizing mice with neurogenic peptides to direct an inflammatory attack toward components of the peripheral nervous system (PNS). Recent advances have enabled the induction of EAN in the relatively resistant C57BL/6 mouse line using myelin protein zero (P0)106-125 or P0180-199 peptides delivered in adjuvant combined with the injection of pertussis toxin. The ability to induce EAN in the C57BL/6 strain allows for the use of the numerous genetic tools that exist on this mouse background, and thus allows the sophisticated study of disease pathogenesis and interrogation of the mechanistic action of novel therapeutics in combination with transgenic approaches. In this study, we demonstrate a simple approach to successfully induce EAN using the P0180-199 peptide in C57BL/6 mice. We also outline a protocol for the assessment of functional deficits that occur in this model, accompanied by an array of neuropathological features. Thus, this model is a powerful experimental model to study the pathogenesis of human peripheral demyelinating neuropathies, and to determine the efficacy of potential therapies that aim to promote myelin repair and protect against nerve damage in autoimmune neuritis.

This report outlines a simple approach to successfully induce experimental autoimmune neuritis (EAN) using the myelin protein zero (P0)180-199 peptide in combination with Freund&#39;s complete adjuvant and pertussis toxin. We present a sophisticated paradigm capable of accurately assessing the extent of functional deficits and neuropathology that occur in this EAN.

Un approccio semplice per indurre la neurite Autoimmune Sperimentale in topi C57BL/6 per le valutazioni funzionali e Neuropathological

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative studies of the changes in densities and distributions of such features, an unbiased sampling protocol is vital for reliable results. Here, we present a workflow for the image acquisition of brain samples. The workflow allows systematic uniform random sampling within a defined brain region, and the images can be analyzed using a disector. This technique is much faster than extensive examination of serial sections but still presents a feasible approach to estimate the densities and distributions of ultrastructure features. Before embedding, stained vibratome sections were used as a reference to identify the brain region under investigation, which helped speed up the overall specimen preparation process. This approach was used for comparative studies investigating the effect of an enriched-housing environment on several ultrastructural parameters in the mouse brain. Based on the successful use of the workflow, we adapted it for the purpose of elemental analysis of brain samples. We optimized the protocol in terms of the time of user-interaction. Automating all the time-consuming steps by compiling a script for the open source software SerialEM helps the user to focus on the main work of acquiring the elemental maps. As in the original workflow, we paid attention to the unbiased sampling approach to guarantee reliable results.

We introduce a novel workflow for electron microscopy investigations of brain tissue. The method allows the user to examine neuronal features in an unbiased fashion. For elemental analysis, we also present a script that automatizes most of the workflow for randomized sampling.

Un approccio imparziale di campionamento TEM sezioni in neuroscienze

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...