Name: adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques
Uploaded: 2020-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
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この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)がF31-DK-113673(C.L.F.)、T32-GM-095421(C.L.F.)、DK-089056(C.L.F.)を助成金で支えました(.M 米国糖尿病学会革新的基礎科学賞(#1-19-IBS-192からG.J.M)、NIDDK出資の栄養肥満研究センター(DK-035816)、糖尿病研究センター(DK-017047)、糖尿病、 肥満と代謝トレーニンググラントT32 DK0007247(T.H.M)ワシントン大学で。

すべての手順は、国立衛生研究所、動物のケアと使用のためのガイドに従って承認され、ワシントン大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)と環境安全衛生の両方によって承認されました。
1. 角度付き座標の計算
<ol><li>コロナ脳アトラスを使用して、斜辺が対象のターゲット領域を通過するように直角三角形をマークします。代表例(図1)では、視床下部心室核(VMN)は、コロナ中線から15°の角度で標的化されています。 注: 図 1 に示されている回転軸の位置 (つまり、側面 C の長さ) は任意であり、任意の脳領域を対象とするように変更できます。これは直感に反しているように見えるかもしれませんが、プロトコルの後のステップでは、この点が回転の定位中心に合うように z 軸の頭部の位置を調整します (セクション 6 を参照)。ただし、ヘッドホルダー装置の物理的な制約により、コロナ回転角度15°を超えないようにすることをお勧めします。</li>
	<li>必要な角度(a)と辺Bの推定長さを設定し、三角法を使用して側面AとCの長さを計算します。このステップは、回転中にヘッドを適切に配置するために重要です。 注: 図 1の例では、アトラスグリッド線を使用して側面 B の長さを近似し、長さが 7.576 mm になります。この情報は、辺 A の長さを計算するために使用されます。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ01.jpg"> この例では、2.03 mm は、頭が 15 度回転したときに光ファイバーカニューレが脳に入る正線からの R/L 距離を示しています。<ol>
<li>必要に応じて、D/V 座標を近似するために、側面 C の長さを計算します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ02.jpg"> 注: 1) 斜辺の長さ (C) は射出深度を表しませんが、D/V 座標を決定するのに役立ちます。したがって、D/V 座標を最適化するためにテストインジェクションを実行することをお勧めします。2) VMNを対象としたこの例では、角度のないマイクロインジェクション(A/ P = -1.4、R/L = 0.4 0°、D/V = -5.7)の2つの座標と、角度付き光ファイバー移植用(A/P = -1.4、R/L = 0.0、15°、D/V-5.4)の2つの座標が得られます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 角度付き手順のためのステレオタックスの準備
<ol><li>定位フレームとマイクロマニピュレータがキャリブレーションされていることを確認します(完全なプロトコルについてはKopfのマニュアルを参照してください)。</li>
	<li>ヘッドホルダーベースプレートのソケットに中央の高さゲージを配置します。</li>
	<li>ツールホルダーの中央のスコープを固定し、スコープを見下ろします。十字線が位置合わせされ、ゲージの十字線に焦点が合わされるまで、マイクロマニピュレータの位置を調整します。 注: このステップでは、スコープはヘッドホルダーの回転中心の焦点面に配置されます。いったん確立された後は、残りのステップ中にマイクロマニピュレータを移動しないでください。</li>
	<li>イヤーバーをホルダーに配置し、両側のインジケータ線が0になるように中央に配置します(図3A)。</li>
	<li>ヘッドホルダーの内側横および前後部ノブ(図2)を使用して、中央の高さゲージの十字線の上にあるX面とY面のイヤーバーを中央揃えにします(図3A)。</li>
	<li>Z 軸のイヤー バーの位置を揃えるには、ホルダーからイヤー バーを取り外し、中央の高さゲージを取り外します。イヤーバーを交換し、0でもう一度中央に配置します。</li>
	<li>スコープを見下ろす。垂直シフトノブ(図3B)とコロナチルトノブをそれぞれ使用して、スコープのクロスヘアがコロナ回転中ずっとイヤーバーの間を中央に配置されるまで、イヤーバーを下方向に回転させます。</li>
	<li>ステレオタックスは現在、キャリブレーションされ、準備ができています。ヘッドホルダーの位置を調整しないでください。</li>
</ol>3. 注射・注入用材料の調製
<ol><li>すべての器具、手術器具、材料が滅菌され、ステレオタックスの隣の無菌外科分野に置かれていることを確認してください。</li>
	<li>バイオセーフティレベルおよび関連する機関バイオセーフティ規制要件に従って、ウイルス構造を取り扱い、保管します。</li>
	<li>適切な取り扱いの練習と個人的な保護具を使用するように注意して、注射器にウイルスを引き出します。</li>
</ol>4. 麻酔
<ol><li>手術前にマウスの体重を記録します。</li>
	<li>イオブルランを使用してマウスを深く麻酔します。</li>
	<li>ひるむ応答がなくなるまでつま先ピンチテストを実行して、マウスが深く麻酔されていることを確認します。動物が強い反射神経を示し続ける場合は、濃度および/または麻酔の持続時間を増加させます。</li>
	<li>手術中にしっとりと保つために、各目に眼軟膏を塗布します。</li>
	<li>頭皮を耳のすぐ後ろから、髪の毛のクリッパーで目のすぐ後ろに剃ります。</li>
	<li>マウスにIACUC承認鎮痛薬を提供します。</li>
	<li>外科処置を通して動物を絶えず監視し、熱的サポートを提供する。</li>
</ol>5. 外科的処置
<ol><li>上部切歯を咬切り棒の隙間に入れ、舌が咬棒の下であることを確認してヘッドホルダーに入れる。</li>
	<li>耳の棒を外耳の肉にそっと挿入して、耳の棒を優しく挿入して、耳の棒が対称的に配置されるようにします(通常、大人のマウスでは3から4の間)。このステップは、ヘッドが安定し、回転に向けて中心を保つために重要です。</li>
	<li>無菌は、ベタジンとアルコール綿棒の3つの交互スクラブ、または代替機関承認の外科的部位製剤で剃った切開領域を調製する。</li>
	<li>動物の上に外科用ドレープを置いて、無菌の外科フィールドを維持し、術後感染のリスクを減らす。</li>
	<li>頭皮の矢状中線に沿って切開を行うことによって頭蓋骨を露出させる。頭蓋骨の表面を静かにこすって筋膜を取り除き、縫合糸を露出させます。 注:縫合線を視覚化するのが難しい場合は、無菌綿先端アプリケータを使用して頭蓋骨に過酸化水素を適用して縫合体の視覚化を改善することができます。</li>
	<li>中央のスコープをホルダーに配置し、十字線をブレグマの中央に配置します(図4、左パネル)。マイクロマニピュレータをゼロにします。</li>
	<li>ブレグマ-ラムダ(B-L)距離に、十字線をλに移動します。 注: 縫合線が正線に沿って直線に沿っていない場合は、bregma とラムダの両方を通して「最適な線」を使用して正線を確立することをお勧めします。ただし、上記の手順に従う場合、スコープレチクルの初期配置は、耳のバーの中間に、B-L正線縫合糸を近似する必要があります。</li>
	<li>B-L距離が4.21mmより大幅に小さいか大きい場合は、割り当てられたブレグマを段階的に調整して、4.21mm±0.2mmのB-L距離を得ます。</li>
	<li>中央揃えのスコープを配置インジケーターに置き換えます。プローブをラムダとブレグマに置き、ヘッドホルダーの後側チルトノブを矢状平面(上または下向きの機首)に調整し、センタリングスコープを使用してブレグマを再割り当てします。</li>
	<li>アライメントインジケータを使用して、コロナチルトノブを使用してコロナ平面のレベルを設定します。頭蓋骨の表面変形を考慮して、ロストラル/尾軸全体の複数のポイントで測定します。</li>
	<li>コロナチルトノブのダイヤル上の位置は0°回転位置です。</li>
</ol>6. 角度の付いた座標に対する回転の中心軸の位置合わせ
<ol><li>ツールホルダの中央のスコープを固定し、マイクロマニピュレータをセクション 1 から計算された座標に配置します。角度付き注入のR/L座標は、側面Aの長さに対応することに注意してください。<ol>
<li>図 1の例では、VMN をターゲットとする光ファイバー配置の角度付き座標は、(A/P = -1.4、R/L = 0°コロナ回転で [2.03] 、コロナ回転が 15° の [0.00] 、D/V = -5.4) です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スコープを見下ろし、この座標をマークします(VMN の例ごとに、中間線から R/L 2.03 mm をマークします。 図4、中央パネル)。このマークは、頭が回転するとカニューレが脳に入るポイントを表します。</li>
	<li>マイクロマニピュレータを正中線に重ね合わせ(R/L = 0.00)します。コロナチルトノブを使用して、セクション1で計算された角度に頭を回転させます。<ol>
<li>スコープの十字線が既にマークに沿っている場合は、セクション 7 に進みます。</li>
		<li>スコープの十字線が基準マークに合っていない場合は、垂直シフトノブ(図 2)を使用して Z 軸のヘッド位置を調整し、十字線がマークにできるだけ近づくまで調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ヘッドを 0° コロナ位置まで戻します。ステップ 6.3 で垂直シフトを調整した場合は、センタリングスコープを使用して bregma を再割り当てします。</li>
	<li>ヘッドを回転したときにクロスヘアが一貫して基準マークに当たるまで、手順6.3と6.4を繰り返します(図4C)。</li>
	<li>この時点で、セクション 1 で設定された任意の回転ポイントが、回転の定位中心に合わせて配置されます。</li>
</ol>7. マイクロインジェクション
<ol><li>ホルダに立体訓練を入れ、マイクロマニピュレータを最初の射出座標に操作します。<ol>
<li>VMN をターゲットにする例では、A/P = -1.4、R/L = 0.4 でドリルヘッドがレベルである間にドリルします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ビットが頭蓋骨のすぐ上になるまでドリルを下げます。ドリルをオンにし、ビットが頭蓋骨(硬膜ではなく)を通り抜けるまで穏やかに下げます。</li>
	<li>対側注射部位について繰り返します。</li>
	<li>滅菌ニードルドライバーを使用して、27〜30Gの針(例えば、無菌0.5mLインスリン注射器の)に90°ベンドを導入し、曲がった針を使用してデュラマーターを優しく突き刺します。</li>
	<li>注:出血が発生した場合は、無菌綿チップアプリケーターで圧力をかけ、出血が止まるまで無菌水で洗浄してください。</li>
	<li>注入する準備ができたら、慎重に定位ホルダーに充填されたハミルトン注射器を配置します。 メモ: 新しいツールに切り替えた後、マイクロマニピュレータの座標が適用されなくなりました。バリ穴の中心を、新しい注入のターゲットとして使用します。</li>
	<li>針をバリ穴の上に慎重に配置します。</li>
	<li>針を下げて、バリ穴の中央の硬膜にわずかに触れます。CRITICAL: ステレオチックセンタリングスコープとドリル用のマイクロマニピュレータの座標が維持されるように、マイクロマニピュレータをZ軸でのみゼロにします。</li>
	<li>針がバリ穴の端に偏向しないように注意深く見て、ゆっくりと針を脳に下げます。D/V射出座標まで0.05mmの腹側まで下げ続け、1分待ちます。この余分なステップは針の取り外しのウイルスの背流れを最小にする小さい「ポケット」を作成する。</li>
	<li>ゆっくりと針をD/V座標に上げ、注入を開始します。 注: 流量と体積は、ターゲット領域と実験計画によって異なります。VMNニューロンの光遺伝学的サイレンシングでは十分なカバレッジが望まれるため、200 nLのウイルスが1nL/sの割合で注入されます。</li>
	<li>マイクロインジェクションの後、退出中のウイルスの流出を最小限に抑えるために注射部位で10分待ちます。</li>
	<li>マイクロピペットを脳から1mm/分のおよその速度でゆっくりと引き出します。</li>
	<li>針が頭蓋骨から取り出されたら、少量のウイルスを排出して、針が血液や組織で詰まっていないかどうかを確認します。続行する前に、無菌綿チップアプリケーターを使用してウイルスを除去してください。</li>
	<li>反対側の手順 7.6 ~ 7.12 を繰り返します。</li>
	<li>マイクロインジェクションバリ穴を骨ワックスで密封して治癒を改善する(図5B)。</li>
</ol>8. 光ファイバー移植
注:ウイルス注入後、両側光ファイバーカニューレは、セクション1ごとに計算された角度で埋め込まれます。これらの座標は、セクション 6 から頭蓋骨に既にマークされている必要があることに注意してください。
<ol><li>角度付き座標について、手順 7.1 ~ 7.4 を繰り返します。</li>
	<li>ヘッドを 0°のレベルに戻します。</li>
	<li>次に、ハンドドリルを使用して、骨ねじ用の4つの追加の穴を生成します:2つは前に配置し、2つは後に配置する必要があります(図5A)。これらは、頭蓋に光ファイバーを貼り付けるアンカーとして機能します(図5D)。 注:頭蓋骨の上に座っている光ファイバーのフェルール部分を収容するために、角度付きの座標バリ穴から十分に離れた穴を配置してください。</li>
	<li>可能な限り穏やかに、小さなフラットヘッドドライバーを使用して、頭蓋骨にしっかりと座っているが、脳に浸透しないように骨ねじを設定します。</li>
	<li>光ファイバーカニューレをカニューレホルダーにクランプし、立体ホルダに入れる。</li>
	<li>計算された角度にヘッドを回転し、マイクロマニピュレータの座標が新しいツールに適用されないことに再度示します。傾斜したバリ穴の中心を埋め込み対象として使用します。</li>
	<li>バリ穴の中央にある硬膜に触れるまで光ファイバーを下げます(図5C)。マイクロマニピュレータを z 軸にゼロにしてから、光ファイバーを D/V 角度の座標 (VMN の例ごとに -5.4) までゆっくりと遅くします。</li>
	<li>シアノアクリル酸ゲルを使用して光ファイバーフェルールをイプシラアンカースクリューに接続し、マイクロピペットチップを備えた加速剤を塗布します(図5D)。</li>
	<li>シアノクリレートゲルが完全に硬化したら、カニューレホルダーを緩め、光ファイバーのフェルールがクリアになるまで上げます。</li>
	<li>反対側の角度の座標に対してステップ 8.5 ~ 8.9 を繰り返し、ヘッドをレベル付けします。さらにセキュリティを強化するために、シアノクリレートゲルと加速器を使用して2つの角度光ファイバーカニューレとの間に追加の接続を行います(図5D)。</li>
	<li>歯科用セメントの小さな、比較的薄い量を準備します。頭蓋骨の表面に塗布し、光ファイバーカニューレのアンカーネジとベースを徹底的に覆うようにします。光ファイバーパッチケーブルでの後の交配のために、フェルールを十分に清潔にしておきます。</li>
	<li>セメントが乾燥したら、本位戦術装置からマウスを取り外します。</li>
	<li>サーマルサポート付きの回復ケージにマウスを置きます。それがアラート、モバイル、およびグルーミングが表示されたら、それが回復し、ホームケージに転送することを許可します。</li>
</ol>9. 手術後のケア
<ol><li>行動、姿勢、活動、グルーミングについて、手術後3日間毎日動物を監視し、食物摂取量と体重の記録を保持します。</li>
	<li>動物が痛みや健康状態の悪さの一般的な指標を示す場合は、獣医師のサービスに相談してください。</li>
	<li>行動研究を開始する前に、回復とウイルス発現のために少なくとも2週間マウスを許可する。</li>
</ol>10. 光遺伝学
<ol><li>光遺伝学研究のパフォーマンスについては、 Sidorら 8 を参照してください。</li>
	<li>研究の完了時にウイルス発現と繊維の配置を検証する。</li>
</ol>

<ol>
	<li>King, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise,+fall,+and+resurrection+of+the+ventromedial+hypothalamus+in+the+regulation+of+feeding+behavior+and+body+weight.">The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight.</a> Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Roth, B. 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F., Lammel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+topic+in+optogenetics:+new+implications+of+in+vivo+tissue+heating.">Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating.</a> Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

最近の神経科学の進歩は、脳神経回路の活動と機能に関する高度な洞察と理解を支えています。これには、生体内の離散ニューロン集団とその投影部位を活性化または沈黙させる光遺伝学的および化学遺伝学的技術の適用が含まれる。最近では、遺伝子組み換えカルシウム指標(GCaMP、RCaMPなど)および他の蛍光バイオセンサー(ドーパミン、ノルエピネフリンなど)の開発が含まれており、自由?...

行動、摂食、代謝の神経制御は、高度に複雑で統合的で冗長な神経回路の調整を伴う。神経科学分野の駆動目標は、神経回路構造と機能の関係を解剖することです。古典的な神経科学ツール(すなわち、病変、局所薬理注射、および電気刺激)は、行動および代謝を制御する特定の脳領域の役割に関する重要な知識を発見しているが、これらのツールは特異性および可逆性の欠如によって制限される。
近年の神経科学分野の進歩により、高い時空間分解能を持つ細胞型特異的な方法で回路機能を問い合わせて操作する能力が大幅に向上しています。例えば、光遺伝学2 および化学遺伝学的3 アプローチは、自由に動く動物の遺伝的に定義された細胞タイプにおける活動の迅速かつ可逆的な操作を可能にする。光遺伝学は、神経活動を制御するために、光感受性イオンチャネル、いわゆるチャネルロドプシンの使用を含む。この技術の鍵は、オプシンを活性化するチャネルロドプシンおよび光源の遺伝子送達である。遺伝子導入の一般的な戦略は、1)離散ニューロンでCre-recombinaseを発現する遺伝子操作マウスと、2)チャネルロドプシンをコードするCre依存性ウイルスベクターの組み合わせによるものである。
光遺伝学は、神経活動を制御するためのエレガントで非常に正確な手段を提供するが、この方法は、定義された脳領域へのウイルスベクターおよび光ファイバー配置の正常な立体的マイクロインジェクションに依存する。立体的な手順は現代の神経科学研究室では一般的であるが(そして、この手順を記述するいくつかの優れたプロトコルがある)4、5、6、中線に沿って一貫して再現的に離散的な脳領域を標的にすることができる(すなわち、心座視下部、恒常性機能の調節に不可欠な脳領域7)は、追加の課題を提示する。これらの課題には、優れた矢状の座頭座、第3心室、および隣接する視床下部核の回避が含まれる。さらに、阻害研究に必要なハードウェアの二国間注入には有意な空間的制限がある。これらの課題を念頭に置いて、本明細書では、このプロトコルは、角度付きの定位的アプローチを介して離散的な脳領域を標的にするための変更可能な手順を提示する。

<table><tbody><tr><td>Fiberoptic Cannulae</td><td>Doric Lenses</td><td>MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT</td><td>Customizable</td></tr><tr><td>Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System</td><td>Kopf</td><td>Model 1900</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge</td><td>Kopf</td><td>Model 1900-51</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1905 Alignment Indicator</td><td>Kopf</td><td>Model 1905</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill</td><td>Kopf</td><td>Model 1911</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1915 Centering Scope</td><td>Kopf</td><td>Model 1915</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars</td><td>Kopf</td><td>Model 1922</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td><td>Kopf</td><td>Model 1923-B</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1940 Micro Manipulator</td><td>Kopf</td><td>Model 1940</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 Microinjection System</td><td>World Precision Instruments</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>Mouse bone screws</td><td>Plastics One</td><td>00-96 X 1/16</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule</td><td>Thor Labs</td><td>XCL</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Drill</td><td>Cell Point Scientific</td><td>Ideal Micro Drill</td><td></td></tr></tbody></table>

adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques

定位外科は現代の神経科学研究室で不可欠なツールです。しかし、到達困難な脳領域を正確かつ正確に標的にする能力は、特に正中線に沿って脳構造を標的とする場合には依然として課題を提示する。これらの課題には、優れた矢状脳および第3心室の回避と、選択的および離散的な脳核を一貫して標的とする能力が含まれる。さらに、より高度な神経科学技術(例えば、光遺伝学、光測定、2光子イメージング)は、脳への重要なハードウェアの標的移植に依存しており、空間的な制限は一般的な障害である。ここで提示される、角度付きコロナアプローチを用いたげっ歯類の脳構造の定位的な標的化のための変更可能なプロトコルである。1)マウスまたはラットモデル、2)様々な神経科学技術、および3)複数の脳領域に適応することができる。代表的な例として、光遺伝学的阻害実験に対するマウス視床下部心室核(VMN)の標的化に関する定位座標の計算が含まれる。この手順は、光感受性クロリドチャネル(SwiChR++)をクレ依存的なマウスモデルにコードするアデノ関連ウイルス(AAV)の二国間マイクロインジェクションから始まり、続いて光ファイバーカニューレの斜めの両側移植が行われます。このアプローチを用いて、インシュリン誘発低血糖に対するグルコース対調節応答に対するVMNニューロンのサブセットの活性化が必要であることを示す。

このプロトコルは、血糖制御における視床下部VMNニューロンの役割を問い合う光遺伝学的研究を行うための外科的処置を説明する9。最初に利用されたのは、抑制性チャネルロドプシンウイルスのVMNへの二国間マイクロインジェクションに対する標準的な(非角度)定位的アプローチであった。角度付きアプローチも適していますが、対象となる脳領域をターゲットにするのに?...

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Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

ここでは、角度付きコロナアプローチを使用して(空間的な制限のために)困難で到達しにくい脳領域を標的にすることができる定位的手順を説明します。このプロトコルは、マウスおよびラットモデルの両方に適応可能であり、カニューレ移植およびウイルス構築物のマイクロインジェクションを含む多様な神経科学的用途に適用することができる。

多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

adaptable-angled-stereotactic-approach-for-versatile-neuroscience

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.9K ビュー.  University of Washington. ここでは、角度付きコロナアプローチを使用して(空間的な制限のために)困難で到達しにくい脳領域を標的にすることができる定位的手順を説明します。このプロトコルは、マウスおよびラットモデルの両方に適応可能であり、カニューレ移植およびウイルス構築物のマイクロインジェクションを含む多様な神経科学的用途に適用することができる。

ビデオ: Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer scale. However, current methods mostly rely on tethered cable recordings or only use unidirectional systems, allowing either recording or stimulation of neural activity, but not at the same time or same target. Here, a new wireless, bidirectional device for simultaneous multichannel recording and stimulation of neural activity in freely behaving rats is described. The system operates through a single portable head stage that both transmits recorded activity and can be targeted in real-time for brain stimulation using a telemetry-based multichannel software. The head stage is equipped with a preamplifier and a rechargeable battery, allowing stable long-term recordings or stimulation for up to 1 h. Importantly, the head stage is compact, weighs 12 g (including battery) and thus has minimal impact on the animal&#180;s behavioral repertoire, making the method applicable to a broad set of behavioral tasks. Moreover, the method has the major advantage that the effect of brain stimulation on neural activity and behavior can be measured simultaneously, providing a tool to assess the causal relationships between specific brain activation patterns and behavior. This feature makes the method particularly valuable for the field of deep brain stimulation, allowing precise assessment, monitoring, and adjustment of stimulation parameters during long-term behavioral experiments. The applicability of the system has been validated using the inferior colliculus as a model structure.

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A wireless, bidirectional system for multi-channel neural recordings and stimulation in freely behaving rats is introduced. The system is light and compact, thus having minimal impact on the animal&#180;s behavioral repertoire. Moreover, this bidirectional system provides a sophisticated tool to assess causal relationships between brain activation patterns and behavior.

ワイヤレス、 In Vivo記録そして自由行動下ラットにおける神経活動の刺激のための双方向インタ フェース

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

行動学

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

がん研究

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

新規高分解能<em生体内で&gt;</em腫瘍増殖と治療に頭蓋内構造物の動的応答を研究する&gt;イメージング技術

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

医学

Operative Technique and Nuances for the Stereoelectroencephalographic (SEEG) Methodology Utilizing a Robotic Stereotactic Guidance System

The SEEG methodology has gained favor in North America over the last decade as a means of localizing the epileptogenic zone (EZ) prior to epilepsy surgery. Recently, the application of a robotic stereotactic guidance system for implantation of SEEG electrodes has become more popular in many epilepsy centers. The technique for the use of the robot requires extreme precision in the pre-surgical planning phase and then the technique is streamlined during the operative portion of the methodology, as the robot and surgeon work in concert to implant the electrodes. Herein is detailed precise operative methodology of using the robot to guide implantation of SEEG electrodes. A major limitation of the procedure, namely its heavy reliance on the ability to register the patient to a preoperative volumetric magnetic resonance image (MRI), is also discussed. Overall, this procedure has been shown to have a low morbidity rate and an extremely low mortality rate. The use of a robotic stereotactic guidance system for the implantation of SEEG electrodes is an efficient, fast, safe, and accurate alternative to conventional manual implantation strategies.

Operative Technique and Nuances for the Stereoelectroencephalographic SEEG Methodology Utilizing a Robotic Stereotactic Guidance System

The SEEG methodology is simplified and made faster with a stereotactic robot. Careful attention must be paid to the registration of the preoperative volumetric MRI to the patient prior to use of the robot in the OR. The robot streamlines the procedure, leading to decreased operative times and accurate implantations.

ロボット定位誘導システムを用いた立体脳波(SEEG)法の手術技術とニュアンス

The SEEG methodology has gained favor in North America over the last decade as a means of localizing the epileptogenic zone (EZ) prior to epilepsy ...

Investigating the Function of Deep Cortical and Subcortical Structures Using Stereotactic Electroencephalography: Lessons from the Anterior Cingulate Cortex

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure involves the chronic placement of multiple depth electrodes into regions of the brain typically inaccessible via subdural grid electrode placement. SEEG thus provides a unique opportunity to investigate brain function. In this paper we demonstrate how SEEG can be used to investigate the role of the dorsal anterior cingulate cortex (dACC) in cognitive control. We include a description of the SEEG procedure, demonstrating the surgical placement of the electrodes. We describe the components and process required to record local field potential (LFP) data from consenting subjects while they are engaged in a behavioral task. In the example provided, subjects play a cognitive interference task, and we demonstrate how signals are recorded and analyzed from electrodes in the dorsal anterior cingulate cortex, an area intimately involved in decision-making. We conclude with further suggestions of ways in which this method can be used for investigating human cognitive processes.

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is an operative technique used in epilepsy surgery to help localize seizure foci. It also affords a unique opportunity to investigate brain function. Here we describe how SEEG can be used to investigate cognitive processes in human subjects.

定位脳波を使用して、ディープ皮質の機能と下構造の調査：前帯状皮質からの教訓は、

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure ...

神経科学

A MRI-Based Toolbox for Neurosurgical Planning in Nonhuman Primates

In this paper, we outline a method for surgical preparation that allows for the practical planning of a variety of neurosurgeries in NHPs solely using data extracted from magnetic resonance imaging (MRI). This protocol allows for the generation of 3D printed anatomically accurate physical models of the brain and skull, as well as an agarose gel model of the brain modeling some of the mechanical properties of the brain. These models can be extracted from MRI using brain extraction software for the model of the brain, and custom code for the model of the skull. The preparation protocol takes advantage of state-of-the-art 3D printing technology to make interfacing brains, skulls, and molds for gel brain models. The skull and brain models can be used to visualize brain tissue inside the skull with the addition of a craniotomy in the custom code, allowing for better preparation for surgeries directly involving the brain. The applications of these methods are designed for surgeries involved in neurological stimulation and recording as well as injection, but the versatility of the system allows for future expansion of the protocol, extraction techniques, and models to a wider scope of surgeries.

The method outlined below aims to provide a comprehensive protocol for the preparation of nonhuman primate (NHP) neurosurgery using a novel combination of three-dimensional (3D) printing methods and MRI data extraction.

非ヒト霊長類の脳神経外科計画のためのMRIベースのツールボックス

In this paper, we outline a method for surgical preparation that allows for the practical planning of a variety of neurosurgeries in NHPs solely using ...

生物工学

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

生体 内 カルシウムイメージングのための定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Magnetic Resonance-Guided Stereotaxy for Infusions to the Pig Brain

The overall goal of this procedure is to perform stereotaxy in the pig brain with real-time magnetic resonance (MR) visualization guidance to provide precise infusions. The subject was positioned prone in the MR bore for optimal access to the top of the skull with the torso raised, the neck flexed, and the head inclined downward. Two anchor pins anchored on the bilateral zygoma held the head steady using the head holder. A magnetic resonance imaging (MRI) flex-coil was placed rostrally across the head holder so that the skull was accessible for the intervention procedure. A planning grid placed on the scalp was used to determine the appropriate entry point of the cannula. The stereotactic frame was secured and aligned iteratively through software projection until the projected radial error was less than 0.5 mm. A hand drill was used to create a burr hole for insertion of the cannula. A gadolinium-enhanced co-infusion was used to visualize the infusion of a cell suspension. Repeated T1-weighted MRI scans were registered in real time during the agent delivery process to visualize the volume of gadolinium distribution. MRI-guided stereotaxy allows for precise and controlled infusion into the pig brain, with concurrent monitoring of cannula insertion accuracy and determination of the agent volume of distribution.

The protocol presented here demonstrates stereotaxy to the pig brain using convection-enhanced infusions, with real-time magnetic resonance imaging (MRI) visualization guidance and real-time infusion distribution visualization.

ブタ脳への注入のための磁気共鳴ガイド下定位固定装置

The overall goal of this procedure is to perform stereotaxy in the pig brain with real-time magnetic resonance (MR) visualization guidance to provide ...

<meta charset="utf8"></head><body>fMRI研究における電極配置精度向上のためのニューロナビゲーションtDCS

Neuronavigated Focalized Transcranial Direct Current Stimulation Administered During Functional Magnetic Resonance Imaging

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive brain stimulation technique that allows the modulation of the excitability and plasticity of the human brain. Focalized tDCS setups use specific electrode arrangements to constrain the current flow to circumscribed brain regions. However, the effectiveness of focalized tDCS can be compromised by electrode positioning errors on the scalp, resulting in significant reductions of the current dose reaching the target brain regions for tDCS. Electrode placement guided by neuronavigation based on the individual&#39;s head and brain anatomy derived from structural magnetic resonance imaging (MRI) data may be suited to improve positioning accuracy.
This protocol describes the method of neuronavigated electrode placement for a focalized tDCS setup, which is suitable for concurrent administration during functional MRI (fMRI). We also quantify the accuracy of electrode placement and investigate electrode drift in a concurrent tDCS-fMRI experiment. Critical steps involve the optimization of electrode positions based on current modeling that considers the individual&#39;s head and brain anatomy, the implementation of neuronavigated electrode placement on the scalp, and the administration of optimized and focal tDCS during fMRI.
The regional precision of electrode placement is quantified using the Euclidean norm (L2&#160;Norm) to determine deviations of the actual from the intended electrode positions during a concurrent tDCS-fMRI study. Any potential displacement of electrodes (drift) during the experiment is investigated by comparing actual electrode positions before and after the fMRI acquisition. In addition, we directly compare the placement accuracy of neuronavigated tDCS to that achieved by a scalp-based targeting approach (a 10-20 Electroencephalography (EEG) system). These analyses demonstrate superior placement accuracy for neuronavigation compared to scalp-based electrode placement and negligible electrode drift across a 20 min scanning period.

<meta charset="utf8"></head><body>機能的磁気共鳴画像法中に投与される神経ナビゲートされた焦点化経頭蓋直流刺激

This protocol describes the method of neuronavigated electrode placement for focal, transcranial direct current stimulation (tDCS) administered during functional magnetic resonance imaging (fMRI).

機能的磁気共鳴画像法中に投与される神経ナビゲートされた焦点化経頭蓋直流刺激

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive brain stimulation technique that allows the modulation of the excitability and plasticity ...

多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ

要約

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ワイヤレス、 In Vivo記録そして自由行動下ラットにおける神経活動の刺激のための双方向インタフェース

頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化

新規高分解能

ロボット定位誘導システムを用いた立体脳波(SEEG)法の手術技術とニュアンス

定位脳波を使用して、ディープ皮質の機能と下構造の調査：前帯状皮質からの教訓は、

非ヒト霊長類の脳神経外科計画のためのMRIベースのツールボックス

げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

生体内カルシウムイメージングのための定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植

ブタ脳への注入のための磁気共鳴ガイド下定位固定装置

機能的磁気共鳴画像法中に投与される神経ナビゲートされた焦点化経頭蓋直流刺激

多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ

要約

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頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化

新規高分解能

ロボット定位誘導システムを用いた立体脳波(SEEG)法の手術技術とニュアンス

定位脳波を使用して、ディープ皮質の機能と下構造の調査：前帯状皮質からの教訓は、

非ヒト霊長類の脳神経外科計画のためのMRIベースのツールボックス

げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

生体 内 カルシウムイメージングのための定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植

ブタ脳への注入のための磁気共鳴ガイド下定位固定装置

機能的磁気共鳴画像法中に投与される神経ナビゲートされた焦点化経頭蓋直流刺激

ワイヤレス、 In Vivo記録そして自由行動下ラットにおける神経活動の刺激のための双方向インタフェース

生体内カルシウムイメージングのための定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植