この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)がF31-DK-113673(C.L.F.)、T32-GM-095421(C.L.F.)、DK-089056(C.L.F.)を助成金で支えました(.M 米国糖尿病学会革新的基礎科学賞(#1-19-IBS-192からG.J.M)、NIDDK出資の栄養肥満研究センター(DK-035816)、糖尿病研究センター(DK-017047)、糖尿病、 肥満と代謝トレーニンググラントT32 DK0007247(T.H.M)ワシントン大学で。

すべての手順は、国立衛生研究所、動物のケアと使用のためのガイドに従って承認され、ワシントン大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)と環境安全衛生の両方によって承認されました。
1. 角度付き座標の計算
<ol><li>コロナ脳アトラスを使用して、斜辺が対象のターゲット領域を通過するように直角三角形をマークします。代表例(図1)では、視床下部心室核(VMN)は、コロナ中線から15°の角度で標的化されています。 注: 図 1 に示されている回転軸の位置 (つまり、側面 C の長さ) は任意であり、任意の脳領域を対象とするように変更できます。これは直感に反しているように見えるかもしれませんが、プロトコルの後のステップでは、この点が回転の定位中心に合うように z 軸の頭部の位置を調整します (セクション 6 を参照)。ただし、ヘッドホルダー装置の物理的な制約により、コロナ回転角度15°を超えないようにすることをお勧めします。</li>
	<li>必要な角度(a)と辺Bの推定長さを設定し、三角法を使用して側面AとCの長さを計算します。このステップは、回転中にヘッドを適切に配置するために重要です。 注: 図 1の例では、アトラスグリッド線を使用して側面 B の長さを近似し、長さが 7.576 mm になります。この情報は、辺 A の長さを計算するために使用されます。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ01.jpg"> この例では、2.03 mm は、頭が 15 度回転したときに光ファイバーカニューレが脳に入る正線からの R/L 距離を示しています。<ol>
<li>必要に応じて、D/V 座標を近似するために、側面 C の長さを計算します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ02.jpg"> 注: 1) 斜辺の長さ (C) は射出深度を表しませんが、D/V 座標を決定するのに役立ちます。したがって、D/V 座標を最適化するためにテストインジェクションを実行することをお勧めします。2) VMNを対象としたこの例では、角度のないマイクロインジェクション(A/ P = -1.4、R/L = 0.4 0°、D/V = -5.7)の2つの座標と、角度付き光ファイバー移植用(A/P = -1.4、R/L = 0.0、15°、D/V-5.4)の2つの座標が得られます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 角度付き手順のためのステレオタックスの準備
<ol><li>定位フレームとマイクロマニピュレータがキャリブレーションされていることを確認します(完全なプロトコルについてはKopfのマニュアルを参照してください)。</li>
	<li>ヘッドホルダーベースプレートのソケットに中央の高さゲージを配置します。</li>
	<li>ツールホルダーの中央のスコープを固定し、スコープを見下ろします。十字線が位置合わせされ、ゲージの十字線に焦点が合わされるまで、マイクロマニピュレータの位置を調整します。 注: このステップでは、スコープはヘッドホルダーの回転中心の焦点面に配置されます。いったん確立された後は、残りのステップ中にマイクロマニピュレータを移動しないでください。</li>
	<li>イヤーバーをホルダーに配置し、両側のインジケータ線が0になるように中央に配置します(図3A)。</li>
	<li>ヘッドホルダーの内側横および前後部ノブ(図2)を使用して、中央の高さゲージの十字線の上にあるX面とY面のイヤーバーを中央揃えにします(図3A)。</li>
	<li>Z 軸のイヤー バーの位置を揃えるには、ホルダーからイヤー バーを取り外し、中央の高さゲージを取り外します。イヤーバーを交換し、0でもう一度中央に配置します。</li>
	<li>スコープを見下ろす。垂直シフトノブ(図3B)とコロナチルトノブをそれぞれ使用して、スコープのクロスヘアがコロナ回転中ずっとイヤーバーの間を中央に配置されるまで、イヤーバーを下方向に回転させます。</li>
	<li>ステレオタックスは現在、キャリブレーションされ、準備ができています。ヘッドホルダーの位置を調整しないでください。</li>
</ol>3. 注射・注入用材料の調製
<ol><li>すべての器具、手術器具、材料が滅菌され、ステレオタックスの隣の無菌外科分野に置かれていることを確認してください。</li>
	<li>バイオセーフティレベルおよび関連する機関バイオセーフティ規制要件に従って、ウイルス構造を取り扱い、保管します。</li>
	<li>適切な取り扱いの練習と個人的な保護具を使用するように注意して、注射器にウイルスを引き出します。</li>
</ol>4. 麻酔
<ol><li>手術前にマウスの体重を記録します。</li>
	<li>イオブルランを使用してマウスを深く麻酔します。</li>
	<li>ひるむ応答がなくなるまでつま先ピンチテストを実行して、マウスが深く麻酔されていることを確認します。動物が強い反射神経を示し続ける場合は、濃度および/または麻酔の持続時間を増加させます。</li>
	<li>手術中にしっとりと保つために、各目に眼軟膏を塗布します。</li>
	<li>頭皮を耳のすぐ後ろから、髪の毛のクリッパーで目のすぐ後ろに剃ります。</li>
	<li>マウスにIACUC承認鎮痛薬を提供します。</li>
	<li>外科処置を通して動物を絶えず監視し、熱的サポートを提供する。</li>
</ol>5. 外科的処置
<ol><li>上部切歯を咬切り棒の隙間に入れ、舌が咬棒の下であることを確認してヘッドホルダーに入れる。</li>
	<li>耳の棒を外耳の肉にそっと挿入して、耳の棒を優しく挿入して、耳の棒が対称的に配置されるようにします(通常、大人のマウスでは3から4の間)。このステップは、ヘッドが安定し、回転に向けて中心を保つために重要です。</li>
	<li>無菌は、ベタジンとアルコール綿棒の3つの交互スクラブ、または代替機関承認の外科的部位製剤で剃った切開領域を調製する。</li>
	<li>動物の上に外科用ドレープを置いて、無菌の外科フィールドを維持し、術後感染のリスクを減らす。</li>
	<li>頭皮の矢状中線に沿って切開を行うことによって頭蓋骨を露出させる。頭蓋骨の表面を静かにこすって筋膜を取り除き、縫合糸を露出させます。 注:縫合線を視覚化するのが難しい場合は、無菌綿先端アプリケータを使用して頭蓋骨に過酸化水素を適用して縫合体の視覚化を改善することができます。</li>
	<li>中央のスコープをホルダーに配置し、十字線をブレグマの中央に配置します(図4、左パネル)。マイクロマニピュレータをゼロにします。</li>
	<li>ブレグマ-ラムダ(B-L)距離に、十字線をλに移動します。 注: 縫合線が正線に沿って直線に沿っていない場合は、bregma とラムダの両方を通して「最適な線」を使用して正線を確立することをお勧めします。ただし、上記の手順に従う場合、スコープレチクルの初期配置は、耳のバーの中間に、B-L正線縫合糸を近似する必要があります。</li>
	<li>B-L距離が4.21mmより大幅に小さいか大きい場合は、割り当てられたブレグマを段階的に調整して、4.21mm±0.2mmのB-L距離を得ます。</li>
	<li>中央揃えのスコープを配置インジケーターに置き換えます。プローブをラムダとブレグマに置き、ヘッドホルダーの後側チルトノブを矢状平面(上または下向きの機首)に調整し、センタリングスコープを使用してブレグマを再割り当てします。</li>
	<li>アライメントインジケータを使用して、コロナチルトノブを使用してコロナ平面のレベルを設定します。頭蓋骨の表面変形を考慮して、ロストラル/尾軸全体の複数のポイントで測定します。</li>
	<li>コロナチルトノブのダイヤル上の位置は0°回転位置です。</li>
</ol>6. 角度の付いた座標に対する回転の中心軸の位置合わせ
<ol><li>ツールホルダの中央のスコープを固定し、マイクロマニピュレータをセクション 1 から計算された座標に配置します。角度付き注入のR/L座標は、側面Aの長さに対応することに注意してください。<ol>
<li>図 1の例では、VMN をターゲットとする光ファイバー配置の角度付き座標は、(A/P = -1.4、R/L = 0°コロナ回転で [2.03] 、コロナ回転が 15° の [0.00] 、D/V = -5.4) です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スコープを見下ろし、この座標をマークします(VMN の例ごとに、中間線から R/L 2.03 mm をマークします。 図4、中央パネル)。このマークは、頭が回転するとカニューレが脳に入るポイントを表します。</li>
	<li>マイクロマニピュレータを正中線に重ね合わせ(R/L = 0.00)します。コロナチルトノブを使用して、セクション1で計算された角度に頭を回転させます。<ol>
<li>スコープの十字線が既にマークに沿っている場合は、セクション 7 に進みます。</li>
		<li>スコープの十字線が基準マークに合っていない場合は、垂直シフトノブ(図 2)を使用して Z 軸のヘッド位置を調整し、十字線がマークにできるだけ近づくまで調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ヘッドを 0° コロナ位置まで戻します。ステップ 6.3 で垂直シフトを調整した場合は、センタリングスコープを使用して bregma を再割り当てします。</li>
	<li>ヘッドを回転したときにクロスヘアが一貫して基準マークに当たるまで、手順6.3と6.4を繰り返します(図4C)。</li>
	<li>この時点で、セクション 1 で設定された任意の回転ポイントが、回転の定位中心に合わせて配置されます。</li>
</ol>7. マイクロインジェクション
<ol><li>ホルダに立体訓練を入れ、マイクロマニピュレータを最初の射出座標に操作します。<ol>
<li>VMN をターゲットにする例では、A/P = -1.4、R/L = 0.4 でドリルヘッドがレベルである間にドリルします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ビットが頭蓋骨のすぐ上になるまでドリルを下げます。ドリルをオンにし、ビットが頭蓋骨(硬膜ではなく)を通り抜けるまで穏やかに下げます。</li>
	<li>対側注射部位について繰り返します。</li>
	<li>滅菌ニードルドライバーを使用して、27〜30Gの針(例えば、無菌0.5mLインスリン注射器の)に90°ベンドを導入し、曲がった針を使用してデュラマーターを優しく突き刺します。</li>
	<li>注:出血が発生した場合は、無菌綿チップアプリケーターで圧力をかけ、出血が止まるまで無菌水で洗浄してください。</li>
	<li>注入する準備ができたら、慎重に定位ホルダーに充填されたハミルトン注射器を配置します。 メモ: 新しいツールに切り替えた後、マイクロマニピュレータの座標が適用されなくなりました。バリ穴の中心を、新しい注入のターゲットとして使用します。</li>
	<li>針をバリ穴の上に慎重に配置します。</li>
	<li>針を下げて、バリ穴の中央の硬膜にわずかに触れます。CRITICAL: ステレオチックセンタリングスコープとドリル用のマイクロマニピュレータの座標が維持されるように、マイクロマニピュレータをZ軸でのみゼロにします。</li>
	<li>針がバリ穴の端に偏向しないように注意深く見て、ゆっくりと針を脳に下げます。D/V射出座標まで0.05mmの腹側まで下げ続け、1分待ちます。この余分なステップは針の取り外しのウイルスの背流れを最小にする小さい「ポケット」を作成する。</li>
	<li>ゆっくりと針をD/V座標に上げ、注入を開始します。 注: 流量と体積は、ターゲット領域と実験計画によって異なります。VMNニューロンの光遺伝学的サイレンシングでは十分なカバレッジが望まれるため、200 nLのウイルスが1nL/sの割合で注入されます。</li>
	<li>マイクロインジェクションの後、退出中のウイルスの流出を最小限に抑えるために注射部位で10分待ちます。</li>
	<li>マイクロピペットを脳から1mm/分のおよその速度でゆっくりと引き出します。</li>
	<li>針が頭蓋骨から取り出されたら、少量のウイルスを排出して、針が血液や組織で詰まっていないかどうかを確認します。続行する前に、無菌綿チップアプリケーターを使用してウイルスを除去してください。</li>
	<li>反対側の手順 7.6 ~ 7.12 を繰り返します。</li>
	<li>マイクロインジェクションバリ穴を骨ワックスで密封して治癒を改善する(図5B)。</li>
</ol>8. 光ファイバー移植
注:ウイルス注入後、両側光ファイバーカニューレは、セクション1ごとに計算された角度で埋め込まれます。これらの座標は、セクション 6 から頭蓋骨に既にマークされている必要があることに注意してください。
<ol><li>角度付き座標について、手順 7.1 ~ 7.4 を繰り返します。</li>
	<li>ヘッドを 0°のレベルに戻します。</li>
	<li>次に、ハンドドリルを使用して、骨ねじ用の4つの追加の穴を生成します:2つは前に配置し、2つは後に配置する必要があります(図5A)。これらは、頭蓋に光ファイバーを貼り付けるアンカーとして機能します(図5D)。 注:頭蓋骨の上に座っている光ファイバーのフェルール部分を収容するために、角度付きの座標バリ穴から十分に離れた穴を配置してください。</li>
	<li>可能な限り穏やかに、小さなフラットヘッドドライバーを使用して、頭蓋骨にしっかりと座っているが、脳に浸透しないように骨ねじを設定します。</li>
	<li>光ファイバーカニューレをカニューレホルダーにクランプし、立体ホルダに入れる。</li>
	<li>計算された角度にヘッドを回転し、マイクロマニピュレータの座標が新しいツールに適用されないことに再度示します。傾斜したバリ穴の中心を埋め込み対象として使用します。</li>
	<li>バリ穴の中央にある硬膜に触れるまで光ファイバーを下げます(図5C)。マイクロマニピュレータを z 軸にゼロにしてから、光ファイバーを D/V 角度の座標 (VMN の例ごとに -5.4) までゆっくりと遅くします。</li>
	<li>シアノアクリル酸ゲルを使用して光ファイバーフェルールをイプシラアンカースクリューに接続し、マイクロピペットチップを備えた加速剤を塗布します(図5D)。</li>
	<li>シアノクリレートゲルが完全に硬化したら、カニューレホルダーを緩め、光ファイバーのフェルールがクリアになるまで上げます。</li>
	<li>反対側の角度の座標に対してステップ 8.5 ~ 8.9 を繰り返し、ヘッドをレベル付けします。さらにセキュリティを強化するために、シアノクリレートゲルと加速器を使用して2つの角度光ファイバーカニューレとの間に追加の接続を行います(図5D)。</li>
	<li>歯科用セメントの小さな、比較的薄い量を準備します。頭蓋骨の表面に塗布し、光ファイバーカニューレのアンカーネジとベースを徹底的に覆うようにします。光ファイバーパッチケーブルでの後の交配のために、フェルールを十分に清潔にしておきます。</li>
	<li>セメントが乾燥したら、本位戦術装置からマウスを取り外します。</li>
	<li>サーマルサポート付きの回復ケージにマウスを置きます。それがアラート、モバイル、およびグルーミングが表示されたら、それが回復し、ホームケージに転送することを許可します。</li>
</ol>9. 手術後のケア
<ol><li>行動、姿勢、活動、グルーミングについて、手術後3日間毎日動物を監視し、食物摂取量と体重の記録を保持します。</li>
	<li>動物が痛みや健康状態の悪さの一般的な指標を示す場合は、獣医師のサービスに相談してください。</li>
	<li>行動研究を開始する前に、回復とウイルス発現のために少なくとも2週間マウスを許可する。</li>
</ol>10. 光遺伝学
<ol><li>光遺伝学研究のパフォーマンスについては、 Sidorら 8 を参照してください。</li>
	<li>研究の完了時にウイルス発現と繊維の配置を検証する。</li>
</ol>

<ol>
	<li>King, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise,+fall,+and+resurrection+of+the+ventromedial+hypothalamus+in+the+regulation+of+feeding+behavior+and+body+weight.">The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight.</a> Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89, 683-694 (2016).</li><li>Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Intracerebral+Stereotaxic+Injections+for+Optogenetic+Stimulation+of+Long-Range+Inputs+in+Mouse+Brain+Slices.">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).</li><li>Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing,+packaging,+and+delivery+of+high+titer+crispr+retro+and+lentiviruses+via+stereotaxic+injection.">Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).</li><li>McSweeney, C., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Stereotactic+Injection+Technique+to+Study+Genetic+Effects+on+Animal+Behaviors.">Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).</li><li>Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Neuroscience+of+Homeostasis+and+Drives+for+Food,+Water,+and+Salt.">New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt.</a> New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).</li><li>Sidor, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optogenetic+stimulation+of+the+rodent+central+nervous+system.">In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).</li><li>Faber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Neuronal+Projections+from+the+Hypothalamic+Ventromedial+Nucleus+Mediate+Glycemic+and+Behavioral+Effects.">Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects.</a> Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+foundations+of+optogenetics:+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity.">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).</li><li>Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+customizable+procedure+for+angled+stereotaxic+implantation+and+microinjection+in+the+rodent+brain.">A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain.</a> Kopf Carrier. 96, (2019).</li><li>Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Adeno-associated+Virus+Injection+and+Cannula+Implantation+in+the+Dorsal+Raphe+Nucleus+of+Mice.">Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice.</a> Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).</li><li>Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+topic+in+optogenetics:+new+implications+of+in+vivo+tissue+heating.">Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating.</a> Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

最近の神経科学の進歩は、脳神経回路の活動と機能に関する高度な洞察と理解を支えています。これには、生体内の離散ニューロン集団とその投影部位を活性化または沈黙させる光遺伝学的および化学遺伝学的技術の適用が含まれる。最近では、遺伝子組み換えカルシウム指標(GCaMP、RCaMPなど)および他の蛍光バイオセンサー(ドーパミン、ノルエピネフリンなど)の開発が含まれており、自由?...

行動、摂食、代謝の神経制御は、高度に複雑で統合的で冗長な神経回路の調整を伴う。神経科学分野の駆動目標は、神経回路構造と機能の関係を解剖することです。古典的な神経科学ツール(すなわち、病変、局所薬理注射、および電気刺激)は、行動および代謝を制御する特定の脳領域の役割に関する重要な知識を発見しているが、これらのツールは特異性および可逆性の欠如によって制限される。
近年の神経科学分野の進歩により、高い時空間分解能を持つ細胞型特異的な方法で回路機能を問い合わせて操作する能力が大幅に向上しています。例えば、光遺伝学2 および化学遺伝学的3 アプローチは、自由に動く動物の遺伝的に定義された細胞タイプにおける活動の迅速かつ可逆的な操作を可能にする。光遺伝学は、神経活動を制御するために、光感受性イオンチャネル、いわゆるチャネルロドプシンの使用を含む。この技術の鍵は、オプシンを活性化するチャネルロドプシンおよび光源の遺伝子送達である。遺伝子導入の一般的な戦略は、1)離散ニューロンでCre-recombinaseを発現する遺伝子操作マウスと、2)チャネルロドプシンをコードするCre依存性ウイルスベクターの組み合わせによるものである。
光遺伝学は、神経活動を制御するためのエレガントで非常に正確な手段を提供するが、この方法は、定義された脳領域へのウイルスベクターおよび光ファイバー配置の正常な立体的マイクロインジェクションに依存する。立体的な手順は現代の神経科学研究室では一般的であるが(そして、この手順を記述するいくつかの優れたプロトコルがある)4、5、6、中線に沿って一貫して再現的に離散的な脳領域を標的にすることができる(すなわち、心座視下部、恒常性機能の調節に不可欠な脳領域7)は、追加の課題を提示する。これらの課題には、優れた矢状の座頭座、第3心室、および隣接する視床下部核の回避が含まれる。さらに、阻害研究に必要なハードウェアの二国間注入には有意な空間的制限がある。これらの課題を念頭に置いて、本明細書では、このプロトコルは、角度付きの定位的アプローチを介して離散的な脳領域を標的にするための変更可能な手順を提示する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiberoptic Cannulae</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT</td>
			<td>Customizable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1905 Alignment Indicator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1915 Centering Scope</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1940 Micro Manipulator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro4 Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse bone screws</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>00-96 X 1/16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>XCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>Ideal Micro Drill</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques

定位外科は現代の神経科学研究室で不可欠なツールです。しかし、到達困難な脳領域を正確かつ正確に標的にする能力は、特に正中線に沿って脳構造を標的とする場合には依然として課題を提示する。これらの課題には、優れた矢状脳および第3心室の回避と、選択的および離散的な脳核を一貫して標的とする能力が含まれる。さらに、より高度な神経科学技術(例えば、光遺伝学、光測定、2光子イメージング)は、脳への重要なハードウェアの標的移植に依存しており、空間的な制限は一般的な障害である。ここで提示される、角度付きコロナアプローチを用いたげっ歯類の脳構造の定位的な標的化のための変更可能なプロトコルである。1)マウスまたはラットモデル、2)様々な神経科学技術、および3)複数の脳領域に適応することができる。代表的な例として、光遺伝学的阻害実験に対するマウス視床下部心室核(VMN)の標的化に関する定位座標の計算が含まれる。この手順は、光感受性クロリドチャネル(SwiChR++)をクレ依存的なマウスモデルにコードするアデノ関連ウイルス(AAV)の二国間マイクロインジェクションから始まり、続いて光ファイバーカニューレの斜めの両側移植が行われます。このアプローチを用いて、インシュリン誘発低血糖に対するグルコース対調節応答に対するVMNニューロンのサブセットの活性化が必要であることを示す。

このプロトコルは、血糖制御における視床下部VMNニューロンの役割を問い合う光遺伝学的研究を行うための外科的処置を説明する9。最初に利用されたのは、抑制性チャネルロドプシンウイルスのVMNへの二国間マイクロインジェクションに対する標準的な(非角度)定位的アプローチであった。角度付きアプローチも適していますが、対象となる脳領域をターゲットにするのに?...

Watch this Scientific Journal Video about Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques at JoVE.com

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

ここでは、角度付きコロナアプローチを使用して(空間的な制限のために)困難で到達しにくい脳領域を標的にすることができる定位的手順を説明します。このプロトコルは、マウスおよびラットモデルの両方に適応可能であり、カニューレ移植およびウイルス構築物のマイクロインジェクションを含む多様な神経科学的用途に適用することができる。

多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

adaptable-angled-stereotactic-approach-for-versatile-neuroscience

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.9K ビュー.  University of Washington. ここでは、角度付きコロナアプローチを使用して(空間的な制限のために)困難で到達しにくい脳領域を標的にすることができる定位的手順を説明します。このプロトコルは、マウスおよびラットモデルの両方に適応可能であり、カニューレ移植およびウイルス構築物のマイクロインジェクションを含む多様な神経科学的用途に適用することができる。

ビデオ: Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

A Novel Approach for Documenting Phosphenes Induced by Transcranial Magnetic Stimulation

Stimulation of the human visual cortex produces a transient perception of light, known as a phosphene. Phosphenes are induced by invasive electrical stimulation of the occipital cortex, but also by non-invasive Transcranial Magnetic Stimulation (TMS)1 of the same cortical regions. The intensity at which a phosphene is induced (phosphene threshold) is a well established measure of visual cortical excitability and is used to study cortico-cortical interactions, functional organization 2, susceptibility to pathology 3,4 and visual processing 5-7. Phosphenes are typically defined by three characteristics: they are observed in the visual hemifield contralateral to stimulation; they are induced when the subject s eyes are open or closed, and their spatial location changes with the direction of gaze 2. Various methods have been used to document phosphenes, but a standardized methodology is lacking. We demonstrate a reliable procedure to obtain phosphene threshold values and introduce a novel system for the documentation and analysis of phosphenes. We developed the Laser Tracking and Painting system (LTaP), a low cost, easily built and operated system that records the location and size of perceived phosphenes in real-time. The LTaP system provides a stable and customizable environment for quantification and analysis of phosphenes.

Phosphenes are transient percepts of light that can be induced by applying Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to visually sensitive regions of cortex. We demonstrate a standard protocol for determining the phosphene threshold value and introduce a novel method for quantifying and analyzing perceived phosphenes.

経頭蓋磁気刺激による閃光を文書化するための斬新なアプローチ

Stimulation of the human visual cortex produces a transient perception of light, known as a phosphene. Phosphenes are induced by invasive electrical ...

神経科学

High Density Event-related Potential  Data Acquisition in Cognitive Neuroscience

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part because fMRI data acquisition and analysis techniques are readily available. Because fMRI has excellent spatial resolution but poor temporal resolution, this method can only be used to identify the spatial location of brain activity associated with a given cognitive process (and reveals virtually nothing about the time course of brain activity). By contrast, event-related potential (ERP) recording, a method that is used much less frequently than fMRI, has excellent temporal resolution and thus can track rapid temporal modulations in neural activity. Unfortunately, ERPs are under utilized in Cognitive Neuroscience because data acquisition techniques are not readily available and low density ERP recording has poor spatial resolution. In an effort to foster the increased use of ERPs in Cognitive Neuroscience, the present article details key techniques involved in high density ERP data acquisition. Critically, high density ERPs offer the promise of excellent temporal resolution and good spatial resolution (or excellent spatial resolution if coupled with fMRI), which is necessary to capture the spatial-temporal dynamics of human brain function.

Event-related potential (ERP) recording is under utilized in Cognitive Neuroscience because data acquisition techniques are not readily available and this method often has poor spatial resolution. To foster the increased use of ERPs in Cognitive Neuroscience, the present article details key techniques involved in high density ERP data acquisition.

高密度のイベントに関連する認知神経科学における潜在的なデータ収集

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

行動神経科学のための齧歯類定位手術と動物福祉のアウトカムの改善

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

マルチ認知機能のテストとげっ歯類の神経活動を記録するための完全に自動化された汎用性の高いシステム

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Investigating the Function of Deep Cortical and Subcortical Structures Using Stereotactic Electroencephalography: Lessons from the Anterior Cingulate Cortex

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure involves the chronic placement of multiple depth electrodes into regions of the brain typically inaccessible via subdural grid electrode placement. SEEG thus provides a unique opportunity to investigate brain function. In this paper we demonstrate how SEEG can be used to investigate the role of the dorsal anterior cingulate cortex (dACC) in cognitive control. We include a description of the SEEG procedure, demonstrating the surgical placement of the electrodes. We describe the components and process required to record local field potential (LFP) data from consenting subjects while they are engaged in a behavioral task. In the example provided, subjects play a cognitive interference task, and we demonstrate how signals are recorded and analyzed from electrodes in the dorsal anterior cingulate cortex, an area intimately involved in decision-making. We conclude with further suggestions of ways in which this method can be used for investigating human cognitive processes.

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is an operative technique used in epilepsy surgery to help localize seizure foci. It also affords a unique opportunity to investigate brain function. Here we describe how SEEG can be used to investigate cognitive processes in human subjects.

定位脳波を使用して、ディープ皮質の機能と下構造の調査：前帯状皮質からの教訓は、

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

miRNAの脳特異的ノックダウンのための定位注射への単純な代替

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

内視鏡内視鏡下鼻内のトランス蝶アプローチ: 下垂体腺腫に対する低侵襲手術

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

外傷によって影響を受ける脳のレーザーキャプチャーマイクロダイ セクション定位アトラス誘導レーザー

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by immunizing mice with neurogenic peptides to direct an inflammatory attack toward components of the peripheral nervous system (PNS). Recent advances have enabled the induction of EAN in the relatively resistant C57BL/6 mouse line using myelin protein zero (P0)106-125 or P0180-199 peptides delivered in adjuvant combined with the injection of pertussis toxin. The ability to induce EAN in the C57BL/6 strain allows for the use of the numerous genetic tools that exist on this mouse background, and thus allows the sophisticated study of disease pathogenesis and interrogation of the mechanistic action of novel therapeutics in combination with transgenic approaches. In this study, we demonstrate a simple approach to successfully induce EAN using the P0180-199 peptide in C57BL/6 mice. We also outline a protocol for the assessment of functional deficits that occur in this model, accompanied by an array of neuropathological features. Thus, this model is a powerful experimental model to study the pathogenesis of human peripheral demyelinating neuropathies, and to determine the efficacy of potential therapies that aim to promote myelin repair and protect against nerve damage in autoimmune neuritis.

This report outlines a simple approach to successfully induce experimental autoimmune neuritis (EAN) using the myelin protein zero (P0)180-199 peptide in combination with Freund&#39;s complete adjuvant and pertussis toxin. We present a sophisticated paradigm capable of accurately assessing the extent of functional deficits and neuropathology that occur in this EAN.

機能と神経病理学的評価の c57bl/6 マウスの実験的自己免疫性視神経炎を誘導するための単純なアプローチ

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative studies of the changes in densities and distributions of such features, an unbiased sampling protocol is vital for reliable results. Here, we present a workflow for the image acquisition of brain samples. The workflow allows systematic uniform random sampling within a defined brain region, and the images can be analyzed using a disector. This technique is much faster than extensive examination of serial sections but still presents a feasible approach to estimate the densities and distributions of ultrastructure features. Before embedding, stained vibratome sections were used as a reference to identify the brain region under investigation, which helped speed up the overall specimen preparation process. This approach was used for comparative studies investigating the effect of an enriched-housing environment on several ultrastructural parameters in the mouse brain. Based on the successful use of the workflow, we adapted it for the purpose of elemental analysis of brain samples. We optimized the protocol in terms of the time of user-interaction. Automating all the time-consuming steps by compiling a script for the open source software SerialEM helps the user to focus on the main work of acquiring the elemental maps. As in the original workflow, we paid attention to the unbiased sampling approach to guarantee reliable results.

We introduce a novel workflow for electron microscopy investigations of brain tissue. The method allows the user to examine neuronal features in an unbiased fashion. For elemental analysis, we also present a script that automatizes most of the workflow for randomized sampling.

神経科学の TEM セクションをサンプリングの公平なアプローチ

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...