Bizim zebrabalığı ksenogreft ilaç tarama iş akışı otomatik görüntüleme ve insan kanser hücrelerinin sayısallaştırılması ve ilaç tedavisine yanıt sağlar. Hızla bilinen ilaçlara bir sabır kanser hücrelerinin tepkisini test etmek veya yeni antikanser bileşikleri belirlemek için kullanılabilir. Zebra balığı knenograf modelleri ve ilaç tarama kullanarak daha önce sadece in vitro sistemleri ile elde edildi Inviva çoğaltma numaraları sağlar.
Ayrıca bileşiklerin büyük kütüphaneleri ile tarama fare modelleri çok daha uygun maliyetlidir. Bu iş akışı, zebra balığındaki kanser hücrelerinin interjeksiyonundan görsel gösteri ile en iyi öğrenilen ilaç yanıtının görüntülenmesine kadar çeşitli adımlara sahiptir. Başlamak için, beş dakika boyunca 200 kez g'de beş milimetre PBS altıncı hücrelere en az iki kez 10 santrifüj ve supernatant aspire.
Hücre paletini beş milimetre lik dii boyama çözeltisi içinde yeniden askıya alın. Hücreleri 37 derecede, ışıktan 20 dakika boyunca koruyun. Sonra girdap yavaşça ve ışıktan korunan 15 dakika boyunca buz üzerindeki hücreleri kuluçkaya yatırın.
Daha sonra hücreleri 200 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin. Hücreleri beş mililitre PBS ekleyerek, 200 kez g'de beş dakika süreyle santrifüj ederek ve süpernatantı azarlayarak yıkayın. Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.
250 bin canlı hücre de bir mikrolitre PBS hücreleri resuspend ve 1.5 milimetrelik mikro santrifüj tüpü ne aktarın. Yeniden askıya alınan hücreleri karanlıkta buzda tutun. Hücreleri boyama ve enjekte önce, bir petri kabına 1X TBE yüzde üç agarose 25 milileiers dökerek enjekte etmek için agarose plakalar yapmak ve katılaşmak için izin.
Plakaları dört santigrat derecede iki haftaya kadar saklayın. Ayrıca önce hücreleri boyama ve enjekte, bir diseksiyon mikroskop altında forceps kullanarak iki gün sonrası gübreleme zebra balık deklorinate. Chorion gözyaşları ve zebra balık unenveloped hale gelene kadar forceps ile zebra balık koruyucu chorion karşı uçlarından çekin.
Mikroenjeksiyon sırasında hücrelerin kümelenmeönlemek için, dört santigrat derece veya buz üzerinde soğuk olmayan ipliksi borosilikat cam iğneler. Hücreleri boyamaktan hemen sonra, soğutulmuş iğneiçine lekeli hücrelerin beş mikrolitre yüklemek için bir mikroloader pipet ucu kullanın. İğneyi mikroenjektör koluna yükleyin.
İğne ucunu steril bir jilet kullanarak seviyeat. Bir sahne mikrometresi kullanarak, mineral yağ damlacık boyutunu ölçmek. Damlacık hacmini, çapı yaklaşık 1,5 milimetre olan iki nanolitrede tutarlı bir şekilde tutun.
Anesteziden bir dakika sonra, anestezili larvaları %3 agarose ile hazırlanmış düz yüzey enjeksiyon plakasına aktarın ve larvalara istenilen enjeksiyon yerinde bir pompa lekeli hücre enjekte edin. İğnenin kümelanmasını önlemek için tüm enjeksiyonlar hücreleri boyandan sonra bir ila üç saat içinde tamamlanmalıdır. Enjeksiyon plakası daki larvaları metilen mavisi olmadan E3 ortam içeren 10 santimetrelik petri kabına yıkayın ve bir saatlik iyileşme süresi boyunca 28 derecede inkübasyon.
Enjekte edilen larvaların yemeğini 34 derecelik bir kuluçka makinesine taşıyın. Raf ve larva petri çanak arasına yerleştirilen boş bir petri kabı ile bir tampon olarak hareket etmek. 48 saat sonrası enjeksiyon, floresan tümör hücre engraftment ve sağlık için ekran zebra balık larvaları.
Herhangi bir ölü veya yanlış şekilli zebra balık çıkarın ve benzer engraftment ile zebra balık seçin. Aşılanmamış zebra balıklarını çıkarın. Sarısı enjekte edilen balıklar için, boyunduruğun sınırlarının engrafted hücre kütlesi etrafında görülemediği yerlerde balık ları çıkarın.
Perikard enjekte edilen balıklar için, enjekte edilen hücre kitlesinin sarısı çuvalına girdiği balıkları çıkarın. Seçilen balığı 96 kuyulu bir tabağa aktarmak için, ilk olarak 200 mikrolitrelik pipet ucunu kesin, sadece dört günlük bir gübreleme sonrası zebra balığının sığması için yeterince büyük. P200 pipetini kullanarak plakadan bir zebra balığı ile 150 mikrolitre E3 media aspire edin ve düz bir alt 96-iyi plaka boş bir kuyuya ekleyin.
Her iyi zebra balık larvaları içeren her iyi başına 1X ilaç çözeltisi ile 300 mikrolitre son bir hacme ulaşmak için 2X seyreltilmiş ilaç çözeltisi 150 mikrolitre ekleyin. Plakayı 34 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Her gün ölü zebra balıklarını kontrol edin.
İki gün sonra, istenirse, E3 medyada 1X ilaç çözeltisi veya DMSO ile her kuyudan sıvı 200 mikrolitre değiştirerek ilaç yenileyin. Zen mavisi yazılımında, görüntüleme yazılımındaki tüm istenmeyen floresan kanalları kaldırın ve Dii kanalını ekleyin. İstediğiniz floresan kanalı kontrol edin.
Aynı pencerede, görüntülerin nasıl çekilecek, Z yığınları, otomasyon, döngüler ve seriler vesaire seçin. Görüntü DMSO kontrol balık ilaç tedavi balık önce. Ve görüntüleme yazılımında uygun pozlama süresini ayarlayın.
Floresan ölçmek için, açık imagej yazılımı. Dosyaya gidin, açın ve istenen CZI dosyasını seçin. Yazılım bir alma seçenekleri penceresi getiriyor.
Yığın görüntüleme için hiper yığınlar seçin, dosyaları tek tek denetleyin, otomatik ölçeği denetleyin ve bölünmüş kanalları denetleyin. Renk seçeneği için renkli seçeneğini belirleyin. Ardından eklentileri, makroları, kayda tıklayın.
Görüntüyü tıklatın, ayarlayın, eşik. Eşik penceresinin sağ tarafındaki açılır menüde resim türünü kırmızı olarak seçin. Yazılım yalnızca floresan içeren alanları vurgulayana kadar minimum eşiği ayarlayın ve ardından uygula'yı tıklatın.
Yazılım siyah ve siyah seçilen alan ile fotoğraf dönüştürür. Analiz et ve ölç'e tıklayın. Yazılım, bu görüntü için floresan alanını içeren bir sonuç penceresi çeker.
Makro kaydedici penceresinde oluştur'u tıklatın. Bu, makronun koduyla birlikte yeni bir pencere açar. Analiz için istenen tüm görüntüleri vurgulayın ve istifleme görüntüleme veya renk seçeneğine göre açın.
Makroile pencerede çalıştır'ı seçin. Sonuç penceresi artık her görüntü için alan içerir. Bu protokolde enjeksiyon sonrası 48 saat ksenogreftli balık floresan etiketli tümör hücreleri için tarandı ve kemoterapi veya DMSO ile tedavi edildi.
Genel olarak, Vincristine ile tedavi edilen ksenogreftli balıklar, DMSO'ya göre ksenogreftli hücre kitlesinde en büyük ve en tutarlı düşüşü gösterdi. Deksametazon tedavi edilen balıklar Vincristine'e göre tümör bölgesinde azalmanın yaklaşık yarısını gösterdi. Ama yine de DMSO ile karşılaştırıldığında tümör alanında bir azalma gösterdi.
Bu prosedür farklı ilaçlar veya her hastanın tümörü içine fikir veren özel hedefli tedavileryanıt için herhangi bir kanser hücresi hattı veya hasta örnek taramak için kullanılabilir.
