Notre flux de travail de dépistage des médicaments contre la xénogreffe du poisson zèbre permet l’imagerie automatisée et la quantification des cellules cancéreuses humaines et leur réponse au traitement médicamenteux. Il peut être utilisé pour tester rapidement la réponse des cellules cancéreuses d’une patience à des médicaments connus ou pour identifier de nouveaux composés anticancéreux. L’utilisation de modèles xénographiques de poisson zèbre et de dépistage des médicaments permet d’obtenir des nombres réplicateurs Inviva qui n’étaient auparavant disponibles qu’avec des systèmes in vitro.
Il est également beaucoup plus rentable que les modèles de souris lors du criblage à travers de grandes bibliothèques de composés. Ce flux de travail a plusieurs étapes de l’interjection des cellules cancéreuses chez le poisson zèbre à l’imagerie de la réponse médicamenteuses qui sont mieux apprises par la démonstration visuelle. Pour commencer, centrifugeuse un minimum de deux fois 10 à la sixième cellule en cinq millimètres de PBS à 200 fois g pendant cinq minutes, et aspirer le supernatant.
Resuspendez la palette cellulaire en cinq millimètres de solution de coloration dii. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius à l’abri de la lumière pendant 20 minutes. Puis vortex doucement et incuber les cellules sur la glace pendant 15 minutes à l’abri de la lumière.
Puis centrifuger les cellules à 200 fois g pendant cinq minutes et aspirer le supernatant. Lavez les cellules en ajoutant cinq millilitres de PBS, en centrifugant à 200 fois g pendant cinq minutes et en aspirant le surnatant. Répétez le lavage une fois de plus.
Resuspendez les cellules dans un microlitre de PBS pour 250 000 cellules vivantes et transférez-les dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millimètre. Gardez les cellules résuspendées sur la glace dans l’obscurité. Avant de tacher les cellules et de s’injecter, faire des plaques d’agarose pour l’injection en versant 25 millileiers de trois pour cent d’agarose en 1X TBE dans une boîte de Pétri et lui permettre de se solidifier.
Conserver les assiettes à quatre degrés Celsius jusqu’à deux semaines. Aussi avant de tacher les cellules et de s’injecter, déchlorer deux jours après la fécondation des poissons zèbres à l’aide de forceps sous un microscope dissection. Tirez des extrémités opposées de la chorion protectrice du poisson zèbre avec des forceps jusqu’à ce que les larmes de chorion et le poisson zèbre devient unnveloped.
Pour éviter l’agglutination des cellules pendant la microinjection, pré-refroidir les aiguilles en verre borosilicate non filamenteux à quatre degrés Celsius ou sur la glace. Immédiatement après la coloration des cellules, utilisez une pointe de pipette de microchargeur pour charger cinq microlitres de cellules tachées dans l’aiguille réfrigérée. Chargez l’aiguille dans le bras du microinjecteur.
Niveler la pointe de l’aiguille à l’aide d’une lame de rasoir stérile. À l’aide d’un micromètre de stade, mesurer la taille des gouttelettes dans l’huile minérale. Gardez le volume de gouttelettes uniformément à deux nanolitres, qui est d’environ 1,5 millimètres de diamètre.
Une minute après l’anesthésie, transférez les larves anesthésiées dans une plaque d’injection de surface plate préparée avec 3 % d’agarose et injectez aux larves une pompe de cellules tachées au site d’injection désiré. Toutes les injections doivent être effectuées dans un délai d’une à trois heures après la coloration des cellules pour éviter l’agglutination de l’aiguille. Lavez les larves de la plaque d’injection dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant des supports E3 sans bleu méthylène et incubez à 28 degrés Celsius pendant une période de récupération d’une heure.
Déplacez le plat des larves injectées dans un incubateur de 34 degrés Celsius. Avec une boîte de Pétri vide placée entre l’étagère et la boîte de Pétri des larves pour agir comme un tampon. À 48 heures après injection, filtrez les larves de poissons zèbres pour l’engraftment fluorescent de cellules de tumeur et la santé.
Enlevez tout poisson zèbre mort ou malformé et sélectionnez les poissons zèbres avec un engraftment similaire. Retirer les poissons zèbres non greffés. Pour les poissons injectés par le jaune, retirez les poissons là où les bordures du joug ne peuvent pas être vues autour de la masse cellulaire greffée.
Pour les poissons injectés au péricarde, retirer les poissons où la masse cellulaire injectée empiète dans le sac à jaunes. Pour transférer le poisson sélectionné dans une assiette de 96 puits, coupez d’abord la pointe d’une pointe de pipette de 200 microlitres, juste assez grande pour qu’un poisson zèbre de quatre jours après la fécondation s’adapte à travers. Aspirer 150 microlitres de médias E3 avec un poisson zèbre de l’assiette à l’aide de la pipette P200 et l’ajouter à un puits vide d’une plaque à fond plat de 96 puits.
Ajouter 150 microlitres de solution médicamenteuses diluée 2X à chaque puits contenant des larves de poissons zèbres pour atteindre un volume final de 300 microlitres avec 1X solution médicamenteuses par puits. Incuber la plaque à 34 degrés Celsius. Vérifiez tous les jours la mort des poissons zèbres.
Après deux jours, si désiré, rafraîchissez le médicament en remplaçant 200 microlitres de liquide de chaque puits par une solution médicamenteuses 1X ou DMSO dans les médias E3. Dans le logiciel Zen blue, supprimez tous les canaux fluorescents indésirables dans le logiciel d’imagerie et ajoutez le canal Dii. Vérifiez le canal fluorescent désiré.
Dans la même fenêtre, sélectionnez la façon dont les images seront prises, les piles Z, l’automatisation, les boucles et les séries, et cetera. Image le poisson de contrôle de DMSO avant que le poisson traité de drogue. Et définissez le temps d’exposition approprié dans le logiciel d’imagerie.
Pour quantifier la fluorescence, ouvrez le logiciel imagej. Allez déposer, ouvrez et sélectionnez le fichier CZI désiré. Le logiciel apporte une fenêtre d’options d’importation.
Pour la visualisation de pile, sélectionnez hyperstacks, vérifiez les fichiers ouverts individuellement, vérifiez l’échelle automatique, et vérifiez les canaux divisés. Pour l’option couleur, sélectionnez colorisé. Cliquez ensuite sur plugins, macros, enregistrer.
Cliquez sur l’image, ajustez, seuilz. Sélectionnez le type d’image comme rouge dans le menu drop down sur le côté droit de la fenêtre seuil. Ajustez le seuil minimum jusqu’à ce que le logiciel ne met en évidence que les zones de fluorescence, puis cliquez sur appliquer.
Le logiciel convertit la photo en noir et blanc avec la zone sélectionnée en noir. Cliquez sur analyser et mesurer. Le logiciel tire vers le haut d’une fenêtre de résultats contenant la zone fluorescente pour cette image.
Cliquez sur créer sur la fenêtre de l’enregistreur macro. Cela ouvre une nouvelle fenêtre avec le code pour la macro. Mettez en surbrillance toutes les images désirées pour analyse et ouvrez en fonction de l’empilage de visualisation ou de l’option couleur.
Sélectionnez exécuter sur la fenêtre avec la macro. La fenêtre de résultats contient maintenant la zone pour chaque image. Dans ce protocole, à 48 heures après injection, les poissons xénogreffe ont été examinés pour les cellules fluorescentes de tumeur étiquetées et traités avec la chimiothérapie ou le DMSO.
Dans l’ensemble, les poissons xénogreffes traités avec de la vincristine ont montré la diminution la plus importante et la plus constante de la masse cellulaire xénogreffe par rapport aux poissons traités par le DMSO. Dexaméthasone poissons traités ont montré environ la moitié de la réduction de la zone tumorale par rapport à vincristine. Mais toujours montré une réduction de la zone tumorale par rapport à DMSO.
Cette procédure peut être utilisée pour dépister n’importe quelle lignée de cellules cancéreuses ou échantillon de patient pour la réponse à différents médicaments ou thérapies ciblées spécifiques donnant un aperçu de la tumeur de chaque patient.
