Il nostro flusso di lavoro di screening dei farmaci allo xenograft zebrafish consente l'imaging automatizzato e la quantificazione delle cellule tumorali umane e la loro risposta al trattamento farmacologico. Può essere usato per testare rapidamente la risposta delle cellule tumorali di una pazienza a farmaci noti o per identificare nuovi composti anticancro. L'uso di modelli di xenografia zebrafish e lo screening farmacologico consentono numeri replicanti Inviva che in precedenza erano ottenibili solo con sistemi in vitro.
È anche molto più conveniente rispetto ai modelli di mouse allo screening attraverso grandi librerie di composti. Questo flusso di lavoro ha diversi passaggi dall'interiezione delle cellule tumorali nel pesce zebra all'imaging della risposta ai farmaci che si imparano meglio con la dimostrazione visiva. Per iniziare, centrifugare un minimo di due volte 10 alla sesta cellule in cinque millimetri di PBS a 200 volte g per cinque minuti e aspirare il supernatante.
Resuspend la tavolozza delle celle in cinque millimetri di soluzione di colorazione dii. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius protette dalla luce per 20 minuti. Quindi vortice delicatamente e incubare le cellule sul ghiaccio per 15 minuti protetti dalla luce.
Quindi centrifugare le cellule a 200 volte g per cinque minuti e aspirare il supernatante. Lavare le cellule aggiungendo cinque millilitri di PBS, centrifugando a 200 volte g per cinque minuti e aspirando il supernatante. Ripetere il lavaggio un'altra volta.
Rimescolare le cellule in un microlitro di PBS per 250 mila cellule vive e trasferirle in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millimetri. Tenere le cellule rimorsiate sul ghiaccio al buio. Prima di macchiare le cellule e iniettare, fare piastre di agarosio per l'iniezione versando 25 millileer di agarosio al tre per cento in 1X TBE in una piastra di petri e lasciare che si solidifichi.
Conservare le piastre a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane. Anche prima di macchiare le cellule e iniettare, declorazione due giorni dopo la fecondazione zebra pesce usando le forcep al microscopio di sezionazione. Tirare dalle estremità opposte del chorion protettivo del pesce zebra con le forcep fino a quando il chorion si strappa e il pesce zebra si dipana.
Per prevenire l'accumulo di cellule durante la microiniezione, pre chill aghi di vetro borosilicati non filamentosi a quattro gradi Celsius o sul ghiaccio. Immediatamente dopo la colorazione delle celle, utilizzare una punta della pipetta del microloader per caricare cinque microlitri di celle macchiate nell'ago refrigerato. Caricare l'ago nel braccio del microiniettore.
Livellare la punta dell'ago usando una lama sterile. Utilizzando un micrometro a stadio, misurare le dimensioni delle goccioline nell'olio minerale. Mantenere il volume delle goccioline in modo coerente a due nanolitri, che ha un diametro di circa 1,5 millimetri.
Un minuto dopo l'anestesia, trasferire le larve anestetizzate su una piastra di iniezione superficiale piatta preparata con il tre per cento di agarosio e iniettare alle larve una pompa di cellule macchiate nel sito di iniezione desiderato. Tutte le iniezioni devono essere completate entro una o tre ore dalla colorazione delle cellule per evitare l'accumulo dell'ago. Lavare le larve dalla piastra di iniezione in una piastra di petri di 10 centimetri contenente mezzi E3 senza blu di metilene e incubare a 28 gradi Celsius per un periodo di recupero di un'ora.
Spostare il piatto delle larve iniettate in un'incubatrice di 34 gradi Celsius. Con una piastra di petri vuota posta tra lo scaffale e la piastra di petri delle larve per fungere da tampone. A 48 ore dopo l'iniezione, scherma le larve di pesce zebra per l'innesto e la salute delle cellule tumorali fluorescenti.
Rimuovere qualsiasi pesce zebra morto o malformato e selezionare i pesci zebra con un innesto simile. Rimuovere i pesci zebra non innestati. Per i pesci iniettati al tuorlo, rimuovere i pesci dove i bordi del giogo non possono essere visti intorno alla massa cellulare intasata.
Per i pesci iniettati al pericardio, rimuovere i pesci in cui la massa cellulare iniettata invade il sacco di tuorlo. Per trasferire il pesce selezionato su una piastra da 96 pozzetti, tagliare prima la punta da una punta di pipetta da 200 microliter, abbastanza grande da far passare un pesce zebra post fertilizzazione di quattro giorni. Aspirare 150 microlitri di supporti E3 con un pesce zebrato dalla piastra utilizzando la pipetta P200 e aggiungerlo a un pozzo vuoto di una piastra piatta inferiore a 96 poggia.
Aggiungere 150 microlitri di soluzione di farmaci diluiti 2X a ciascuna larva di pesce zebra ben contenente per raggiungere un volume finale di 300 microlitri con soluzione di farmaco 1X per pozzo. Incubare la piastra a 34 gradi Celsius. Controlla ogni giorno la presenza di pesci zebra morti.
Dopo due giorni, se lo si desidera, aggiornare il farmaco sostituendo 200 microlitri di liquido da ogni pozzo con soluzione di farmaco 1X o DMSO nei supporti E3. Nel software Zen blue, rimuovere tutti i canali fluorescenti indesiderati nel software di imaging e aggiungere il canale Dii. Controllare il canale fluorescente desiderato.
Nella stessa finestra, seleziona come verranno scattate le immagini, gli stack Z, l'automazione, i loop e le serie, eccetera. Immagini il pesce di controllo DMSO prima del pesce trattato con farmaci. E impostare il tempo di esposizione appropriato nel software di imaging.
Per quantificare la fluorescenza, aprire il software imagej. Passare al file, aprire e selezionare il file CZI desiderato. Il software fa emergere una finestra delle opzioni di importazione.
Per la visualizzazione dello stack, selezionare hyperstack, controllare i file aperti singolarmente, controllare la scalabilità automatica e controllare i canali divisi. Per l'opzione colore, selezionare colorazione. Quindi fare clic su plugin, macro, registrare.
Fare clic su immagine, regolare, soglia. Selezionare il tipo di immagine come rosso nel menu a discesa sul lato destro della finestra di soglia. Regolare la soglia minima fino a quando il software evidenzia solo le aree con fluorescenza, quindi fare clic su applica.
Il software converte la foto in bianco e nero con l'area selezionata in nero. Fare clic su analizza e misura. Il software estrae una finestra dei risultati contenente l'area fluorescente per quell'immagine.
Fare clic su Crea nella finestra del registratore di macro. In questo modo viene aperta una nuova finestra con il codice per la macro. Evidenzia tutte le immagini desiderate per l'analisi e apri in base all'opzione di visualizzazione dell'impilamento o colore.
Selezionare Esegui nella finestra con la macro. La finestra dei risultati ora contiene l'area per ogni immagine. In questo protocollo, a 48 ore dalla post iniezione, i pesci xenografati sono stati vengono etichettati con etichette fluorescenti le cellule tumorali e trattati con chemioterapia o DMSO.
Nel complesso, i pesci xenografati trattati con Vincristine hanno mostrato la più grande e consistente diminuzione della massa cellulare xenografata rispetto al pesce trattato con DMSO. Il pesce trattato con desametasone ha mostrato circa la metà della riduzione dell'area tumorale rispetto alla Vincristina. Ma ha comunque mostrato una riduzione dell'area tumorale rispetto al DMSO.
Questa procedura può essere utilizzata per migliorare qualsiasi linea cellulare tumorale o campione di paziente per rispondere a diversi farmaci o terapie mirate specifiche che forniscono informazioni sul tumore di ogni paziente.
