Bu çalışma, Doğu Polonya Operasyonel Programı Geliştirme 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-09-00) kapsamında Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu'ndan Avrupa Birliği tarafından, Lublin John Paul II Katolik Üniversitesi Biyoteknoloji ve Çevre Bilimleri Fakültesi (Ilona Sadok için Genç Bilim adamları hibesi), Polonya Ulusal Bilim Merkezi tarafından desteklendi. OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 Magdalena Staniszewska, İlke Araştırmacısı).  Yazarlar, hücre kültleme ve protein nicelleştirme ekipmanlarını paylaştığı için Oksidatif Stres Laboratuvarı, Disiplinlerarası Araştırma Merkezi, JPII CUL'dan Prof. Agnieszka Ścibior'a teşekkür ediyor.

1. Standart 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standart stok çözümlerinin hazırlanması
<ol><li>Reaktifleri bir şişede en yüksek doğrulukta (her biri 0,3 mg) tartın. Daha iyi doğruluk için, çözücünün hacmini adım 1.2'ye göre ayarlayarak reaktifleri ölçeklendirin.</li>
	<li>1 g/L stok çözeltisi elde etmek için çözücünün 300 μL'sinde reaktifleri çözün. Dimetil sülfitte (DMSO) Kyn, 3HAA ve XA; Hidroklorik asit (HCl) ile pH 2.5'e asitlenmiş suda 3HKyn. DİkKAT: 3HAA gözleri, burnu, boğazı ve akciğerleri tahriş eder. Solunduğunda, ciltle temas ettiğinde ve yutulduğunda zararlıdır. Eldiven ve maske gibi uygun korumayı takın.</li>
	<li>Şişeyi sıkıca kapatın ve çözünmeyi hızlandırmak için 1 dakika boyunca ultrasonik bir banyoya yerleştirin. NOT: Stok çözeltilerini -20 °C'de saklayın ve stok çözeltilerinin kararsızlığı nedeniyle donma/çözülmeyi (maksimum 3 döngü) en aza indirin.</li>
</ol>2. Kömürle işlenmiş kültür ortamının hazırlanması
<ol><li>Bir tüpte, 280 mg aktif kömür ağırlığında ve ilgi çekici hücreleri kültleme için hazırlanan sıvı ortamın 5 mL'sini ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında (hızı 50 salınım / dk'ya ayarlayın) 2 saat boyunca bir testere sallayıcı üzerinde orta ve kömür ile tüpü sallayın. Ardından, tüpleri 15 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Tüpü santrifüjden çıkarın ve tortuyu bozmadan süpernatantı dikkatlice toplayın. Tüm kömür kalıntılarını gidermek için gerekirse santrifüjü tekrarlamayı tekrarlayın.</li>
	<li>Süpernatantı 0,45 μm şırınna filtresi kullanarak filtreleyin.</li>
	<li>Adım 6.3.2'de açıklandığı gibi LC-MS'te bir pilot örnek çalıştırarak kömür önceden işlenmiş kültür ortamının kynurenines izlerinden yoksun olduğundan emin olun. Aksi takdirde, 2.1-2.4 adımlarını yineleyin. NOT: Tam kültür ortamı başlangıçta kynurenines içermiyorsa, kömür kullanarak arınma adımı atlanabilir. Bu durumda, genellikle hücre kültleme için hazırlanan komple ortamı kullanarak kalibrasyon standartlarını ve kalite kontrol örneklerini hazırlayın.</li>
	<li>Hazırlanan ortamı analize kadar 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>3. Kalibrasyon çözümlerinin ve kalibrasyon eğrilerinin yapılması
<ol><li>Kömür ön işlemli kültür ortamını 0,75 μL 0,1 g/L 3NT çözelti ile yükseltin ve kalibrasyon aralıklarını kapsayacak şekilde en az altı farklı konsantrasyonda dört standart (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) ekleyin. Her numunenin son hacmini 150 μL'de tutun. Numune hazırlama için 1,5 mL santrifüj tüpleri kullanın. NOT: 3HKyn için önerilen kalibrasyon noktaları: 0.018, 0.045, 0.22, 1.12, 2.23, 4.46 μmol/L; Kyn için: 0.0096, 0.048, 0.24, 1.20, 2.40, 3.84 μmol / L; 3HAA için: 0.033, 0.16, 0.65, 3.27, 6.53, 13.06 μmol / L; XA için: 0.019, 0.13, 0.49, 1.22, 3.65, 4.87 μmol / L.</li>
	<li>Numune deproteinizasyonu için her tüpe %1 (v/v) formik asit içeren 150 μL soğuk metanol (-20 °C'de tutulur) ekleyin. Tüpleri ve girdabı sıkıca kapatın.</li>
	<li>Numuneleri 40 dakika boyunca -20 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Numuneleri 14.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüj edin. Tüpleri santrifüjden çıkarın. Yeni tüplere süpernatants toplayın. Tortuyu bozmayın.</li>
	<li>Otomatik pipet kullanarak 270 μL'lik süpernatant'ı cam şişeye aktarın. Şişeleri evaporatöre koyun ve kuruyana kadar hafifçe buharlaşın. Uçucu bileşenleri buharlaşmak için su/metanol fraksiyonları için uygun programı kullanın. 40 °C'den yüksek sıcaklık uygulamayın ve aşırı kurumaya karşı kaçının. NOT: Düz alt cam şişeler, yani kromatografik şişeler, plastik konik tüplere kıyasla daha hızlı buharlaşmayı ve daha yüksek geri kazanımları kolaylaştırır.</li>
	<li>30 dakika sonra buharlaşma durumunu kontrol edin. Gerekirse buharlaşmaya devam edin (örneğin, ekstra 10 dakika ekleyin). Aşırı kurumaktan kaçının.</li>
	<li>Şişeleri evaporatörden çıkarın. Her numuneyi sudaki %0,1 (v/v) formik asitin 60 μL'sinde yeniden inşa edin. Çözücüyü artık malzemeyi içeren şişeye ekleyin. Şişeleri ve girdabı sıkıca kapatın.</li>
	<li>Numuneyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve çökemiş proteini ayırmak için 4 °C'de 15 dakika boyunca 14.000 x g'da döndürün.</li>
	<li>Protein peletini bozmadan, süpernatantları otomatik pipetli konik cam uçlu kromatografik şişelere aktarın. Şişeleri sıkıca kapatın.</li>
	<li>Kesici uç şişesinde hava kabarcıklarının olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse çıkarın (örneğin, girdapla).</li>
	<li>Örnekleri içeren kromatografik şişeleri LC otomatik örnekleyiciye aktarın. Otomatik örnekleme tepsisine yerleştirilen örneklerin konumunu kaydedin.</li>
</ol>4. Kalite kontrol (QC) örneklerinin hazırlanması
<ol><li>Kömür ön işlemli kültür ortamını (1,5 ml santrifüj tüpte hazırlanmış) 0,75 μL 0,1 g/L 3NT çözeltisi ve dört kynurenin (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) standartları ile kalibrasyon eğrilerinin doğrusal aralığından seçilen bir konsantrasyonda başaklandırın. Numunenin son hacmini 150 μL'de tutun. NOT: Varsa, kalibrasyon eğrisinin doğrusal aralığının altına düşen farklı konsantrasyonlarda birkaç QC numunesi hazırlayın.</li>
	<li>Bölüm 3'te açıklanan protokolü izleyin (adım 3.2-3.11).</li>
</ol>5. LC-MS sisteminin kurulması
<ol><li>Mobil faz çözücüleri hazırlayın: Solvent A: Ultra saf suda 20 mmol / L amonyum formatında (formik asitle ayarlanmış pH 4.3); Solvent B: %100 asetonitril. NOT: Sadece borosilikat cam şişeler kullanın. Şişeleri doldurmadan önce ultra saf suyla durulayın. Deterjanlarla temizlenmiş şişeler kullanmayın. DİkKAT: Asetonitril ciddi sağlık etkilerine veya ölüme neden olur. Isı ile kolayca tutuşur. Asetonitril sıvı ve buhar gözleri, burnu, boğazı ve akciğerleri tahriş edebilir.<ol>
<li>Bir cam şişede 50 mL ultra saf suda kristal reaktifi (15,77 g) eriterek 5 mol/L stok amonyum formatlı çözelti hazırlayın. Tüm artıklar çözülene kadar karıştırın. Kalan kalıntıları gidermek için 0,45 μm membran boyunca filtreleyin (örneğin, naylon şırıng filtresi kullanarak). Stok çözeltisini 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>Bir kehribar cam şişede 980 mL ultra saf suya suya 4 mL 5 mol/L amonyum format ekleyerek Solvent A'yı hazırlayın ve iyice karıştırın. Bir karıştırma çubuğunu batırın ve çözücü ile şişeyi manyetik bir karıştırıcıya koyun. Çözeltiye bir pH elektrot batırın ve karıştırma altında pH'ı kontrol edin. Formik asit stok çözeltisi ekleyin (%98-%100) pH 4.3 elde etmek için 0.2 mL uçlu otomatik pipet kullanarak damla yönünde, ultra saf su ile sesi 1 L'ye kadar ayarlayın ve iyice karıştırın. NOT: Herhangi bir mikrobiyal büyümeyi önlemek için çözücüleri haftada en az bir kez hazırlayın. DİkKAT: Formik asit (FA) solunduğunda toksiktir, cilt yanıklara ve göz hasarına neden olur. Duman kaputunun altında çalışın; koruyucu eldiven ve ceket giyin.</li>
		<li>Kalan kalıntıları gidermek için tüm çözeltileri 0,22 μm membrandan (örneğin naylon şırınna filtresi) filtreleyin. İsteğe bağlı olarak, sistemi gelen parçacıklardan korumak için LC çözücü rezervuarları için ayrılmış çözücü giriş filtrelerini kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>LC-MS kontrol ve veri toplama yazılımını başlatın.</li>
	<li>Kabarcıkları gidermek ve tüm solvent kanallarını astarlamak için LC sistemini mobil fazla temizle.</li>
	<li>Analitik sütunun tıkanmasını korumak için bir koruma sütunu topluluk haline getirmek.</li>
	<li>Koruma ve analitik sütunu (C18, 2.1 x 100 mm, 1.8 μm) yaklaşık 30 dakika boyunca% 100 asetonitril ile yıkayın ve ardından sütunda kararlı bir basınç gözlenene kadar% 100 çözücü A ile yıkayın. Kontrol yazılımını kullanarak sistem performansını kontrol edin.</li>
	<li>Veri toplama yazılımında uygun LC parametrelerini ayarlayın.<ol>
<li>Degrade programını kurun: 0-8 dk çözücü B% 0; 8-17 dk çözücü B 0-2%; 17-20 dk çözücü B% 2; 20-32 dk çözücü B 10-30%; 32-45 dk çözücü B% 0.</li>
		<li>Mobil faz akış hızını 0,15 mL/dak, toplam analiz çalışma süresini 45 dk, kolon sıcaklığını +40 °C ve enjeksiyon hacmini 10 μL olarak ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kütle spektrometresi dedektörünün alım parametrelerini ayarlayın.<ol>
<li>İyonizasyon parametrelerini uygulayın: tek iyon izleme (SIM), pozitif iyonlaşma, 50 psi'lik nebülizör basıncı, +350 °C kurutma gazı sıcaklığı, 12 L/dk kurutma gazı akışı ve 5500 V kılcal gerilim.</li>
		<li>Analit izleme iyonlarını seçin: 3HKyn m/z 225.0 için (tarama süresi: 2-6 dk, parçalayıcı voltajı: 100 V); Kyn m/z 209.0 için (tarama süresi: 6-12 dk, parçalayıcı voltaj: 80 V); 3HAA m/z 154.0 için (tarama süresi: 12-18 dk, parçalayıcı voltaj: 80 V); 3NT m/z 227.0 için (tarama süresi: 18-23 dk, parçalayıcı voltaj: 100 V); XA m/z 206.0 için (tarama süresi: 23-45 dk, parçalayıcı voltaj: 100 V).</li>
	</ol></li>
	<li>Bir çalışma listesi oluşturun ve örnekleri LC sisteminde çalıştırın.</li>
	<li>İlk başta, deneysel örneklerin analizinden önce, en azından üç taraflı olarak boş bir örnek (Solvent A) ve ardından bir QC örneği çalıştırın.</li>
	<li>Veri analizi yazılımını açın ve QC örneği için elde edilen sonuçları yükleyin.</li>
	<li>Analit tepelerinin kromatogramdaki konumunu kontrol edin. Sinyaller beklenen konumun ötesine geçtiğinde, uygun analit sinyallerinin toplanması için zaman kapılarını ayarlayın. Sinyal entegrasyonu hakkında talimat için yazılım kılavuzuna bakın.</li>
</ol>6. Kalibrasyon eğrisinin inşası
<ol><li>Veri toplama yazılımında, kalibrasyon standartlarını çalışma listesine ekleyin ve standartları üç taraflı olarak çalıştırın.</li>
	<li>Sırasıyla yaklaşık 4,4 dk, 10 dk, 16 dk, 21 dk ve 30 dk tutma süresinde 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT ve XA'ya karşılık gelen tepe alanını entegre edin ve ölçün.</li>
	<li>Bir elektronik tablo programı kullanarak her metabolit için ayrı kalibrasyon eğrileri oluşturun.<ol>
<li>Kalibrasyon grafiğini oluşturmak için, analit tepe alanının 3NT tepe alanı üzerindeki bir oranının değerini analit konsantrasyonuna göre çizin.</li>
		<li>Orta alanda çalışılan analizlerin iz kalmadığından emin olmak için boş numuneyi (kömür önceden işlem görmüş kültür ortamı sadece 3NT ile çivilenmiş) analiz edin. Aksi takdirde, elde edilen değeri her kalibrasyon noktasından çıkarın.</li>
		<li>Her kalibrasyon eğrisinin doğrusallığını kontrol edin.<ol>
<li>Ayrı ayrı, her analit için, bir eğim kesişim doğrusal denklemi (y = ax +b) oluşturun, burada y, analit tepe alanının 3NT tepe alanına karşı oranına karşılık gelir, a eğimdir, x analit konsantrasyonudur (μmol / L) ve b eğri kesişimini ifade eder. 'y' grafiğinin 'x'e karşı çizilmeleri kalibrasyon eğrisini oluşturur.</li>
			<li>Grafiğe doğrusal bir eğilim çizgisi ekleyin, kalibrasyon eğrisi denklemini ve regresyon katsayısını grafikte görüntüleyin. Regresyon katsayısının > 0,990 olduğundan emin olun. Eşleşmeyen kalibrasyon standartları durumunda bunları bir kez daha hazırlayın ve/veya analiz edin. İsteğe bağlı olarak, kalibrasyon eğrisinin konsantrasyon aralığını değiştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Deneysel örnekleri analiz etmeden önce sistem performansını kontrol etmek için QC örneklerini analiz edin. Uyumsuzluk durumunda (referans değerden %20 sapma ±), yeni kalibrasyon eğrilerini hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. In vitro hücre kültürü ve analiz için örnek toplama
<ol><li>Çalışılan kanser hücrelerini (MDA-MB-231 veya SK-OV-3) DMEM'de (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası) 4,5 g/L ᴅ-glikoz içeren plaka, %10 (v/v) fetal sığır serumu (FBS), 2 mmol/L ʟ glutamin ve 1 U penisilin/streptomisinin ve kültürünün 37 °C'de nemlendirilmiş bir atmosferde %5 CO2 deney için genişletilmesi. Hücreleri konfluenslerin %80'inden geç.</li>
	<li>Hücreleri tripin kullanarak kültür çanaktan ayırın, kuyu başına 0,3 × 106 hücre yoğunluğunda 12 kuyu plakası üzerinde deney için tohum ve bir gecede bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Ertesi gün, kültür ortamını aspire edin ve deneysel tasarıma bağlı olarak, çalışılan bileşiklerin eklenmesiyle veya eklenmeden taze DMEM ekleyin.</li>
	<li>48 saat sonra, ortamı hücrelerin üstünden (yaklaşık 500 μL) 1,5 mL'lik bir tüpe toplayın. Herhangi bir hücre kalıntılarını gidermek için 5 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj. Süpernatant toplayın ve analize kadar -80 °C'de saklayın.</li>
	<li>Hücresel peletin protein tahmini için adım 7.4'ten sakla. Numuneleri -20 °C'de dondurun. NOT: Farklı kuyulardan bir ortam için elde edilen sonuçlar, bireysel kuyulardaki hücre sayısındaki değişkenliği hesaba katmak için toplam protein içeriğine normalleştirilmelidir. Protein konsantrasyonu 9.</li>
</ol>8. LC-MS analizi için numuneler hazırlayın
<ol><li>Donmuş numuneyi oda sıcaklığında çözün ve iyice karıştırın. Kültür ortamının 149,25 μL'lik kısmını santrifüj tüpüne (1,5 mL) aktarın.</li>
	<li>0,75 μL 0,1 g/L 3NT çözelti (dahili standart) ekleyin. Tüpleri ve girdabı iyi kapatın.</li>
	<li>Numune deproteinizasyonu için %1 (v/v) FA içeren -20 °C metanolde 150 μL soğutulmuş ekleyin. Tüpleri ve girdabı iyi kapatın.</li>
	<li>Bölüm 3'te açıklandığı gibi örnek hazırlamaya devam edin (adım 3.3-3.11). NOT: SK-OV-3 gibi bazı kanser hücreleri büyük miktarlarda Kyn'i bir kültür ortamına salgılar. Verileri kalibrasyon eğrisinin doğrusal bir aralığına sığdırmak için numunenin yaklaşık 100 kat seyreltilmesi gerekir. Bu durumda, numunenin bir kısmını suda% 0,1 (v/v) FA ile seyreltin ve seyreltilmemiş numuneye ek olarak analiz edin. Kalibrasyon eğrisi için standartların referans örnekleri 100 kat seyreltilmiş tam kültür ortamında hazırlanmalıdır. Alternatif olarak, deneysel numunedeki Kyn konsantrasyon seviyesine ayarlamak için kalibrasyon eğrisine daha fazla nokta ekleyin (uygun çözünürlük ve doğrusallık elde edilirse).</li>
	<li>Örnekleri bölüm 5'te açıklandığı gibi LC-MS ile analiz edin. Bir çalışma listesi oluşturun ve her örneği üç taraflı olarak çalıştırın.</li>
	<li>Çalışma listesi tamamlandıktan sonra, analit tepe alanını ölçün.</li>
	<li>Kullanılabilir yazılımı ve elde edilen sayısal verileri kullanarak bir elektronik tablo oluşturun.</li>
	<li>Bir elektronik tablo sütununda, analit tepe alanının 3NT tepe alanı üzerindeki oranını hesaplayın.</li>
	<li>Deneysel örneklerde bulunan analiz konsantrasyonlarını hesaplamak için her bir analit için ayrılmış ayrı bir doğrusal kalibrasyon denklemi kullanın (adım 6.3.'den itibaren).</li>
</ol>9. Protein içeriğinin ve veri normalleşmesini değerlendirme
<ol><li>Hücresel peleti 1,5 mL tüpte 100 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 7,5 adımından yeniden tanımlayın. NOT: 950 mL ultra saf suda 8 g sodyum klorür, 0,2 g potasyum klorür, 1,44 g sodyum fosfat dibasik, potasyum dihidrojen fosfat eriterek PBS çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın. Hidroklorik asit (damla yönünde) ile pH'ı 7,4'e ayarlayın. Ultra saf su ile hacmi 1 L'ye kadar ayarlayın. Homojen olana kadar iyice karıştırın. DİkKAT: Hidroklorik asit oldukça aşındırıcıdır ve uygun güvenlik önlemleri ile ele alınmalıdır. İnsan derisi ile temas kızarıklığa, ağrıya, cilt yanıklığına neden olabilir. Duman kaputunun altında çalışın; koruyucu eldiven ve ceket giyin.</li>
	<li>Numuneleri -20 °C'de dondurun ve buz üzerinde çözün. Bu adımı 3x tekrarlayın.</li>
	<li>Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj edin. Süpernatantları yeni tüplere toplayın. Peletin rahatsız etmeyin.</li>
	<li>Pbs ile süpernatantları 10x seyreltin.</li>
	<li>Kuyu aralığı başına proteinin 0 ila 2 μg arasında bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.<ol>
<li>Kalibrasyon için sığır serum albümini (BSA) standart soluyu hazırlayın. 1,23 μg BSA'yı 1 mL ultra saf su ve girdap kuyusunda çözün.</li>
		<li>96 kuyulu bir plakada, farklı miktarlarda BSA standart çözeltisi (1,23 μg/mL) yükleyin: 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.</li>
		<li>Kuyuyu PBS ile 50 μL'lik son hacme kadar doldurun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aynı 96 kuyu plakasına 9.4 adımından 10 - 15 μL hücre likatı yükleyin. 50 μL'lik son hacme ulaşmak için kuyuları PBS ile doldurun. NOT: Gerekirse, kalibrasyon eğrisinin doğrusal aralığına uyacak şekilde her kuyudaki hücre likır aliquotunun hacmini ayarlayın. Son hacmi kuyu başına numunenin 50 μL'sine kadar tutun.</li>
	<li>Her kuyuya 200 μL Bradford reaktifi (ultra saf su ile 5 kez seyreltilmiş) ekleyin.</li>
	<li>96 kuyulu pate'yi oda sıcaklığında en az 5 dakika kuluçkaya yatırın. Plakayı bir mikro plaka okuyucusuna yerleştirin. Absorbansı φ = 595 nm'de ölçün.</li>
	<li>Elektronik tablo programı kullanarak kalibrasyon eğrisi oluşturun. Emiciliğe karşı BSA miktarını (μg) çizin. Doğrusal bir eğilim çizgisi ekleyin, kalibrasyon eğrisi denklemini ve regresyon katsayısını grafikte görüntüleyin.</li>
	<li>Örnekteki protein miktarını hesaplamak için doğrusal denklemi (y = balta +b, burada y φ = 595 nm'deki absorbansa karşılık gelir, a eğimdir, x bir protein içeriğidir (μg) ve b eğri kesişimini ifade eder) kullanın. NOT: Hesaplamalarda örnek bir seyreltme faktörü düşünün.</li>
	<li>Numunedeki kynurenine miktarını 1 mg protein başına normalleştirmek için tahmini protein içeriğini kullanın. Bunu yapmak için, adım 8.9'da belirlenen kynurenin konsantrasyonu ile toplam protein içeriğini adım 9.10'dan bölün.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDO1:+an+import+ant+immunotherapy+target+in+cancer+treatment.">IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment.</a> International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).</li><li>Heng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+role+of+the+kynurenine+pathway+in+human+breast+cancer+immunobiology.">Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology.</a> Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).</li><li>Badawy, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kynurenine+pathway+and+human+systems.">Kynurenine pathway and human systems.</a> Experimental Gerontology. 129, (2020).</li><li>Chen, Y., Guillemin, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kynurenine+pathway+metabolites+in+humans:+Disease+and+healthy+states.">Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states.</a> International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).</li><li>Sathyasaikumar, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthurenic+Acid+Formation+from+3-Hydroxykynurenine+in+the+Mammalian+Brain:+Neurochemical+Characterization+and+Physiological+Effects.">Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects.</a> Neuroscience. 367, 85-97 (2017).</li><li>Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+epithelial+cell+apoptosis+and+intracellular+Ca2++increasein+the+presence+of+xanthurenic+acid.">Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid.</a> BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).</li><li>Col&#237;n-Gonz&#225;lez, A. L., Maldonado, P. D., Santamar&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Hydroxykynurenine:+an+intriguing+molecule+exerting+dual+actions+in+the+central+nervous+system.">3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system.</a> Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).</li><li>Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aryl+hydrocarbon+receptor+and+tumor+immunity.">The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).</li><li>Tan, V. X., Guillemin, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kynurenine+pathway+metabolites+as+biomarkers+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).</li><li>Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interferon-gamma+action.+Characterization+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+in+cultured+human+cells+induced+by+interferon-gamma+and+evaluation+of+the+enzyme-mediated+tryptophan+degradation+in+its+anticellular+activity.">Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).</li><li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoleamine-2,3-dioxygenase+in+thyroid+cancer+cells+suppresses+natural+killer+cell+function+by+inhibiting+NKG2D+and+NKp46+expression+via+STAT+signaling+pathways.">Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).</li><li>Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+analysis+of+tryptophan+metabolites.">Chromatographic analysis of tryptophan metabolites.</a> Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).</li><li>Fuertig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS-based+quantification+of+kynurenine+metabolites,+tryptophan,+monoamines+and+neopterin+in+plasma,+cerebrospinal+fluid+and+brain.">LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain.</a> Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).</li><li>Marcos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tryptophan+and+tyrosine+metabolism+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).</li><li>M&#246;ller, M., Du Preez, J., Harvey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+single+analytical+method+for+the+determination+of+tryptophan,+and+its+kynurenine+metabolites+in+rat+plasma.">Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).</li><li>Lesniak, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+quantification+of+tryptophan+and+its+major+metabolites.">Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites.</a> Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).</li><li>Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isocratic+liquid+chromatographic+separation+and+quantification+of+tryptophan+and+six+kynurenine+metabolites+in+biological+samples+with+ultraviolet+and+fluorimetric+detection.">Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection.</a> International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).</li><li>Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+tryptophan+and+kynurenine+in+serum+by+HPLC+with+UV+and+fluorescence+detection.">Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection.</a> Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).</li><li>Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometric+method+for+quantification+of+tryptophan-derived+uremic+solutes+in+human+serum.">A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum.</a> Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).</li><li>Arnhard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validated+liquid+chromatography-high+resolution-tandem+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+quantitation+of+tryptophan,+kynurenine,+kynurenic+acid,+and+quinolinic+acid+in+human+plasma.">A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma.</a> Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).</li><li>Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+profiling+of+tryptophan+and+its+related+metabolites+in+patients+with+metabolic+syndrome+by+liquid+chromatography-electrospray+ionization/mass+spectrometry.">Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+LC-MS/MS+method+for+determination+of+kynurenine+and+tryptophan+concentrations+in+human+plasma+from+HIV-infected+patients.">A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients.</a> Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).</li><li>Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+tryptophan+and+related+compounds+by+liquid+chromatography/electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+tryptophan+metabolites+in+serum,+urine,+and+cell+culture+supernatants+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry.">Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).</li><li>Hashioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+analysis+implies+noninvolvement+of+the+kynurenine+pathway+neurotoxins+in+the+interferon-gamma-+induced+neurotoxicity+of+adult+human+astrocytes.">Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes.</a> Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).</li><li>Sadok, I., Rachwa&#322;, K., Staniszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+optimized+and+validated+LC-MS+method+for+simultaneous+quantification+of+tryptophan+metabolites+in+culture+medium+from+cancer+cells.">Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).</li><li>Annesley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+suppression+in+mass+spectrometry.">Ion suppression in mass spectrometry.</a> Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).</li><li>Hou&#233;e-L&#233;vin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+oxidative+modifications+of+tyrosine:+An+update+on+mechanisms+of+formation,+advances+in+analysis+and+biological+consequences.">Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences.</a> Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Expression+of+Indoleamine+2,+3-Dioxygenase+in+Human+Recurrent+Miscarriage.">Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage.</a> Reproductive Sciences. , (2019).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+in+nasopharyngeal+carcinoma+impairs+the+cytolytic+function+of+peripheral+blood+lymphocytes.">Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes.</a> BMC Cancer. 9, 416 (2009).</li><li>Mailankot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoleamine+2,3-dioxygenase+overexpression+causes+kynurenine-modification+of+proteins,+fiber+cell+apoptosis+and+cataract+formation+in+the+mouse+lens.">Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makale, in vitro kültürlü insan kanser hücrelerinden bir ortamda ölçülen dört ana Trp metabolitinin (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) eşzamanlı nicelemesi için ayrıntılı bir LC-SQ protokolü sunun. Analizdeki en önemli noktalar olan numune hazırlama, kromatografik/kütle spektrometresi prosedürü ve veri yorumlamaya özel önem verilir.
Genel olarak, LC-MS analizi, yüksek hassasiyet nedeniyle, kullanılan malzemelerin protokol katılığı ve saflığının en yüksek standa...

Kynurenine pathway (KP), insan hücrelerinde triptofan (Trp) katabolizmanın ana yoludur. Ekstrahepatik hücrelerde indoleamin-2,3-dioksijenaz (IDO-1) KP'nin ilk ve sınırlayıcı enzimidir ve Trp'yi N-formilkynurenine1'edönüştürür. KP içindeki diğer adımlar, diğer ikincil metabolitleri, yani çeşitli biyolojik özellikler gösteren kynureninleri oluşturur. Kynurenine (Kyn), aryl hidrokarbon reseptörüne (AhR) bağlandıktan sonra toksik özellikleri gösteren ve hücresel olayları düzenleyen ilk kararlı Trp katabolitidir2. Daha sonra, Kyn kendiliğinden veya enzim aracılı süreçlerde çeşitli moleküllere dönüştürülür ve 3-hidroksiynurenine (3HKyn), antranilik asit (AA), 3-hidroksiranilik asit (3-HAA), kynurenic asit (Kyna) ve ksantürenik asit (XA) gibi metabolitler üretir. Başka bir downstream metabolit, 2-amino-3-karboksimonik asit-6-semialdehit (ACMS), kinolinik asit (QA) veya pikolinik asit (PA)1için enzimatik olmayan siklizyon geçirir. Son olarak, QA ayrıca nikotinamid-adenin dinükleotid (NAD+)3, önemli bir enzim kofaktörü olan KP uç nokta metabolitine dönüştürülür. Bazı kynureninler Kyna ve PA gibi nöroprotektif özelliklere sahipken, diğerleri, yani 3HAA ve 3HKyn,toksiktir 4. 3HKyn'den oluşan ksanturenik asit antioksidan ve vasorelaksasyon özellikleri sunar5. XA yaşlanma lenslerinde birikir ve epitel hücrelerinin apoptozlanmasına yol açar6. 20. yüzyılın ortalarında tanımlanan KP, çeşitli bozukluklara katılımı gösterildiğinde daha fazla ilgi gördü. Bu metabolik rotanın artan aktivitesi ve bazı kynureninlerin birikmesi immün yanıtı modüle eder ve depresyon, şizofreni, ensefalopati, HIV, demans, amyotrofik lateral skleroz, sıtma, Alzheimer, Huntington hastalığı ve kanser4,7gibi farklı patolojik durumlarla ilişkilidir. Trp metabolizmasında bazı değişiklikler tümör mikroçevronmentlerinde ve kanser hücrelerinde gözlenir2,8. Ayrıca, kynurenines umut verici hastalık belirteçleri olarak kabul edilir9. Kanser araştırmalarında, in vitro hücre kültürü modelleri iyi kurulmuş ve antikanser ilaçlara verilen yanıtların klinik öncesi değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır10. Trp metabolitleri hücreler tarafından kültür ortamına salgılanır ve kynurenine yolunun durumunu değerlendirmek için ölçülebilir. Bu nedenle, kolay, esnek ve güvenilir bir protokole sahip çeşitli biyolojik örneklerde mümkün olduğunca çok sayıda KP metabolitinin aynı anda tespiti için uygun yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır.
Bu yazıda, kanser hücrelerinden toplanan kültür sonrası bir ortamda LC-SQ tarafından Kyn, 3HKyn, 3HAA ve XA olmak üzere dört kynurenine yolu metabolitinin aynı anda belirlenmesi için bir protokol açıklıyoruz. Modern biranalitik yaklaşımda, Ehrlich reaktifi11,12kullanan biyokimyasal spesifik olmayan testlerin aksine, bireysel triptofan katabolitlerinin eşzamanlı tespiti ve niceliği için sıvı kromatografisi 13 , 14 , 15,16tercih edilir. Şu anda, insan örneklerinde kynurenines tayini için birçok yöntem mevcuttur, esas olarak ultraviyole veya floresan dedektörleri ile sıvı kromatografisine dayanmaktadır13,17,18,19. Sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi dedektörü (LC-MS) ile birleştiğinde, daha yüksek hassasiyetleri (daha düşük algılama sınırları), seçicilikleri ve tekrarlanabilirlikleri nedeniyle bu tür analizler için daha uygun görünmektedir.
Trp metabolitleri insan serumu, plazma ve idrar13,20,21,22,23'te zaten belirlenmiştir, ancak hücre kültürü ortamı gibi diğer biyolojik örnekler için yöntemler de istenmemektedir. Daha önce, LC-MS, interferon gama (IFN-γ) 24 ,25,26ile tedavi edilen insan glioma hücrelerinin, monositlerin, dendritik hücrelerin veya astrositlerin kültleştirilmesinden sonra toplanan bir ortamda Trp türevi bileşikler için kullanılmıştır. Şu anda, farklı kültür ortamlarında, hücrelerde ve kanser modellerinde kullanılan tedavilerde çeşitli metabolitlerin değerlendirilmesine izin verebilen yeni onaylanmış protokollere ihtiyaç vardır.
Geliştirilen yöntemin amacı, KP'deki anormallikleri gösterebilen dört ana kynurenines'i (bir analitik çalışma içinde) ölçmektir. Burada sunulan, in vitro kültürlü insan kanser hücrelerinden toplanan ortamda bir iç standart (3-nitrotirozin, 3NT) kullanılarak seçilen anlamlı kynureninlerin nicel LC-SQ analizi için yakın zamanda yayınlanan protokolümüzün kritik adımları27. En iyi bilgimize göre, in vitro yetiştirilen hücrelerden elde edilen bir kültür ortamında 3HKyn, 3HAA, Kyn ve XA'nın eşzamanlı olarak ölçülmesi için ilk LC-SQ protokolüdür. Bazı değişikliklerde, yöntem trp metabolizmasındaki değişiklikleri daha geniş bir hücre kültürü model yelpazesinde incelemek için daha fazla uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1360px;" width="1359">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">3-hydroksy-DL-kynurenina</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">H1771</td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-hydroxyanthranilic acid</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">148776</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">3-nitro-L-tyrosine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">N7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td>1.00029</td>
			<td>hypergrade for LC-MS LiChrosolv</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td>05105</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:175px;">Ohaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:411px;">Analytical column</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>959764-902</td>
			<td>Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium formate</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">7022</td>
			<td>eluent additive for LC-MS, LiChropur, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>1001887398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caps for chromatographic vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>blue screw caps,PTFE/red sil sepa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:175px;">Nest</td>
			<td>704004</td>
			<td>polystyrene, non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td style="width:175px;">Biologix</td>
			<td>07-6012</td>
			<td>12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>HERAcell 150i Cu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model 5415R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model 5428</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>B-2278</td>
			<td>Eppendorf type, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>B-3693</td>
			<td>Falcon type, 50 mL, PP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic data acqusition and analysis software</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic insert vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-1387</td>
			<td>100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5182-0714</td>
			<td>2 mL, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">1.02950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dubelcco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:175px;">PAN Biotech</td>
			<td>P04-41450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dual meter pH/conductivity</td>
			<td style="width:175px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>SevenMulti</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Evaporator</td>
			<td style="width:175px;">Genevac</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model EZ-2.3 Elite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Formic acid</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">5.33002</td>
			<td>for LC-MS LiChropur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Glass bottle for reagents storage</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>S-2070</td>
			<td>50 mL, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Guard column</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:261px;">959757-902</td>
			<td>Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">L-kynurenine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">K8625</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:175px;">Wigo</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>ES 21 H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microbalance</td>
			<td style="width:175px;">Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td>model XP6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Milli-Q system</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td>ZRQSVPO30</td>
			<td>Direct-Q 3 UV with Pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quadrupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G1948B</td>
			<td>model 6120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Adrich</td>
			<td>048M4874V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:175px;">Bio Tek</td>
			<td></td>
			<td>Synergy 2 operated by Gen5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.05108.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td style="width:175px;">BioRad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">See-saw rocker</td>
			<td style="width:175px;">Stuart</td>
			<td>SSL4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipette</td>
			<td style="width:175px;">Nest</td>
			<td>326001</td>
			<td>5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.06346.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent inlet filter</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5041-2168</td>
			<td>glass filter, 20 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent reservoir (for LC-MS)</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-6524</td>
			<td>1 L, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent reservoir (for LC-MS)</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-6526</td>
			<td>1 L, amber glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spreadsheet program</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stir bar</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>6-2003</td>
			<td>teflon coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters for culture medium filtration</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>7-8803</td>
			<td>regenerated cellulose, &#216; 30 mm, 0,45 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters for mobile phase components filtration</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>6-0018</td>
			<td>nylon, &#216; 30 mm, 0,22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>96-wells, sterille</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrih</td>
			<td>T4049-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:411px;">Ultra-High Performance Liquid Chromatography system</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:261px;">G1367D, G1379B, G1312B, G1316C</td>
			<td style="width:513px;">1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasound bath</td>
			<td>Polsonic</td>
			<td>104533</td>
			<td>model 6D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex</td>
			<td>Biosan</td>
			<td></td>
			<td>model V-1 plus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Xanthurenic acid</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">D120804</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous quantification of selected kynurenines analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry in medium collected from cancer cell cultures

Kynurenine yolu ve kynurenines adı verilen triptofan katabolitleri, bağışıklık düzenlemesi ve kanser biyolojisinde rol almaları nedeniyle daha fazla ilgi gördü. Bir in vitro hücre kültürü testi genellikle farklı triptofan katabolitlerinin bir hastalık mekanizmasına katkısı hakkında bilgi edinmek ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılır. Salgılanan metabolitler ve sinyal molekülleri bakımından zengin olan hücre kültürü ortamı triptofan metabolizmasının ve diğer hücresel olayların durumunu yansıtır. Karmaşık hücre kültürü ortamında birden fazla kynureninin güvenilir bir şekilde ölçülmesi için yeni protokoller, birden fazla numunenin güvenilir ve hızlı bir şekilde analiz edilmesine izin vermek için arzu edilir. Bu, kütle spektrometresi ile birleştiğinde sıvı kromatografisi ile gerçekleştirilebilir. Bu güçlü teknik metabolitlerin nicelleştirilmesi için birçok klinik ve araştırma laboratuvarında kullanılır ve kynurenines ölçümü için kullanılabilir.
Burada sunulan, in vitro kültürlü kanser hücrelerinden toplanan ortamda dört kynureninin, yani kynurenine, 3-hidroksisinurenin, 3-hidroksiranilik ve ksantrinik asidin eşzamanlı belirlenmesi için tek dörtlü kütle spektrometresi (LC-SQ) ile birleştirilmiş sıvı kromatografinin kullanımıdır. SQ dedektörünün kullanımı kolaydır ve diğer kütle spektrometrelerine kıyasla daha ucuzdur. SQ-MS analizinde, numuneden birden fazla iyon oluşturulur ve belirli kütle-şarj oranlarına(m/z)göre ayrılır ve ardından Tek İyon İzleme (SIM) modu kullanılarak tespit edilir.
Bu makale, bildirilen yöntemin avantajlarına dikkat çeker ve bazı zayıf noktaları gösterir. Kromatografi ve kütle spektrometresi analizi ile birlikte numune hazırlama dahil olmak üzere LC-SQ analizinin kritik unsurlarına odaklanmıştır. Kalite kontrol, yöntem kalibrasyon koşulları ve matris etkisi konuları da tartışılmaktadır. 3-nitrotirozinin basit bir uygulamasını tüm hedef analitler için bir analog standart olarak tanımladık. İnsan yumurtalık ve meme kanseri hücreleri ile yapılan deneylerle doğrulanan LC-SQ yöntemi güvenilir sonuçlar üretir ve diğer in vitro hücresel modellere daha fazla uygulanabilir.

LC-MS, karmaşık örneklerin bazı bileşenleri matris etkilerine neden olsa ve analitlerin iyonlaşmasını tehlikeye atsa da, biyolojik olarak aktif moleküllerin ölçülmesinde tartışılmaz avantajlar sunar. İyon bastırmaya veya iyon geliştirmesine yol açar, doğruluğu güçlü bir şekilde azaltır ve yöntemin ''zayıf' bir noktası olarak kabul edilen LC-MS'in tespit / nicelifikasyon sınırını etkiler. Protokolümüzde, iyonlar, Trp metabolitleri belirleme13ile ilgili diğer çal...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures at JoVE.

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Burada, tek bir dörtlüktolü kütle spektrometresi ile birlikte sıvı kromatografisi ile analiz edilen kanser hücre kültürlerinden toplanan ortamda kynurenine pathway'de (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, ksantürenik asit, 3-hidroksiranilik asit) üretilen dört farklı triptofan metabolitinin belirlenmesi için bir protokol açıklanmıştır.

Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

simultaneous-quantification-selected-kynurenines-analyzed-liquid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3.3K Görüntüleme.  The John Paul II Catholic University of Lublin. Burada, tek bir dörtlüktolü kütle spektrometresi ile birlikte sıvı kromatografisi ile analiz edilen kanser hücre kültürlerinden toplanan ortamda kynurenine pathway'de (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, ksantürenik asit, 3-hidroksiranilik asit) üretilen dört farklı triptofan metabolitinin belirlenmesi için bir protokol açıklanmıştır.

Video: Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Biyomühendislik

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

3D Hücre Kültürü Modelleri Kütle Spektrometre Görüntüleme Hazırlık Stratejileri Numune

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

Biyolojik Sıvı Ortamda Ölçeklenebilir, Metalik Yüksek Aspect Ratio Nanokompositlerin Üretimi

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

3D Mekansal Hücre Kültürleri için hücre yapı iskeleleri olarak biyo-uyumlu sıvı kristal Elastomer Köpüklerin sentezi

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among adults. High quality, reproducible research on the consequences of electronic cigarette use is essential for understanding emerging public health concerns and crafting evidence based regulatory policy. While a growing number of papers discuss electronic cigarettes, there is little consistency in methods across groups and very little consensus on results. Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This protocol details instructions for the assembly and operation of said device, and demonstrates the use of the generated extract in two sample applications: an in vitro cell viability assay and gas-chromatography mass-spectrometry. This method provides a tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This method provides a useful tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Sıvı özleri geleneksel sigara duman ve elektronik sigara Aerosol gelen nesil için aygıt mikroişlemci işletilen

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...