Protokolümüz, mikrobiyal kemotaksileri doğrudan kendi yaşam alanlarında sağlam bir şekilde ölçmemizi sağlar. Ve bu şekilde mikroorganizmaları izole edebilir ve metabolik potansiyeli daha iyi ölçebilir ve anlayabiliriz. In situ chemotaxis tsay, ya da kısaca ISCA, mikrobiyal davranışlar ve bu nedenle rol ve sıvı faz olan herhangi bir ortamda mikroorganizmaların işlevi içine yeni bir fikir sağlayan esnek, kullanıcı dostu ve basit bir cihazdır.
Hem laboratuvarda hem de sahada konuşlandırma prosedürünü gösteren estelle Clerc, şu anda araştırma grubumda doktora öğrencisi. Kemoattractant'ı hazırlamadan önce ortamı 0,2 mikrometre filtreile filtreleyin ve filtrelenmiş çözeltiyi otomatik olarak tökezleyin. Daha sonra, steril ortamın 1 mililitresinde 10 milimolar kemolar çözelti hazırlayın ve herhangi bir partikül ve potansiyel kirletici maddeyi çıkarmak için kemoattractant çözeltisini 0,2 mikrometreşırık filtresiile filtreleyin.
Daha sonra, deneysel protokole göre, seri olarak filtrelenmiş kemoattractant stok çözeltisi seyreltin. Bir ISCA'yı doldurmak için, 1 mililitrelik şırıngaya 27 kalibrelik bir iğne takın ve filtrelenmiş kemotomisin her konsantrasyonu için bir şırınga yükleyin. Cihazı bağlantı noktası yukarı bakacak şekilde tutarak, her bağlantı noktasının üstünde küçük bir damlacık belirene kadar maddenin her bir konsantrasyonuna cihazın bir sırasının beş kuyusu içine yavaşça enjekte edin.
Tüm kuyular dolduğunda, uygun bakteri kültürü ortamının 150 mililitre ilgi deniz veya tatlı su bakteri kültürünün 1.5 mililitre aktarın. Ardından, 200 mililitrelik kapasite tepsisinin düz yüzeyine iki küçük çift taraflı yapışkan bant yerleştirin. Ve her bant parçasına bir ISCA yapıştırın.
50 mililitrelik serolojik pipet kullanarak, dağıtım tepsisini yavaşça bakteriyel solüsyonla doldurun. Ve bakterilerin bir saat liğine kemoattractant'a tepki vermesine izin verin. Analizi sonlamak için, orta yı ISCA tepsisinden yavaşça çıkarmak için 50 mililitrelik yeni bir pipet kullanın.
Örnekleri almak için önce ISCA'yı bağlantı noktasının aşağı bakacak şekilde konumlandırın. Daha sonra, her kuyudan çözelti çekmek için 27 gauge iğne ile donatılmış steril 1 mililitrelik şırınga kullanın. Aynı konsantrasyondaki her satırdaki örnekleri tek bir tüpe çekmek.
Daha sonra, her kemoattractant konsantrasyonu çeken bakteri sayısını belirlemek için akış sitometri ile örnekleri analiz. Saha dağıtımı için bir ISCA hazırlamak için, ilk olarak, saha kenarından ISCA başına 5 mililitre su toplayın ve suyu 0,2 mikrometreşon filtreden 50 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin. Şırınga filtrelenmiş suyu hidrofilik GP filtre kartuşuyla iki kez geçirin, her durulamadan sonra 50 mililitrelik konik santrifüj tüpündeki filtratı toplayın.
Daha sonra suyu 0,02 mikrometrelik şırınga filtresinden 50 mililitrelik yeni bir tüpe süzün. Bireysel 15 mililitrekonik tüpler istenilen konsantrasyonlarda ilgi tüm chemoattractants resuspend için filtrat aliquots kullanın. Sonra steril içine steril 15 mililitre konik santrifüj tüpler içine bireysel 0,2 mikrometre şırınga filtreleri ile resuspended kemoattractants filtre lemek için 10 mililitreşögapur kullanın herhangi bir istenmeyen parçacıklar veya suda çözünmez bileşikleri kaldırmak için.
ISCA alan dağıtımı için, her ISCA'yı cihaz kasasının 9. Muhafazayı yapışkan bantla kapatın ve bungee kablolarını kullanarak muhafazayı dağıtım koluna ve insan yapımı yapıya sabitleyin. Alternatif olarak, muhafaza sığ bir substrat üzerinde küçük bir ağırlık ile güvenli veya Pelajik okyanusta bir ağa bağlı olabilir.
İçi aşırı su hareketini önlemek için muhafazayı sıkıca tutarak dolguyu başlatmak için muhafazayı tamamen batırın. Su seviyesi kasanın tepesine ulaştıktan sonra, içeride hava nın sıkışmadığından emin olun. Kasa tamamen dolduğunda, alt ve üst delikleri iki fiş ile kapatın.
Daha sonra ISCA'yı 1 ila 3 saat bekletin. Örnekleme süresinin sonunda, muhafazayı sudan çıkarın. Suyu boşaltmak için muhafazayı bir kap üzerine yerleştirin ve yapışkan bandın üst kısmını ön deliklerden dikkatlice çıkarın.
Su hattı ISCA'nın üst kısmı altından geçtikten sonra, alt fişi çıkarın ve suyun geri kalanını boşaltın. ISCA'lar kasaya hala bağlıyken, her ISCA'nın üzerine hapsolmuş suyu dikkatlice çıkarmak ve üst yüzeye dokunmadan ISCA'ları çıkarmak için 1 mililitrelik pipet veya 1 mililitrelik şırınga kullanın. Daha sonra yüzeyde kalan sıvıyı çıkarmak için tek kullanımlık bir silme kullanın ve laboratuvar numune alımı için gösterildiği gibi numuneleri alın.
Bu temsili in vitro analizinde, 1 milimolar, filtrelenmiş deniz suyu kontrolünden 18 kat daha yüksek olan önemli bir kemotaktik yanıta neden olarak optimal glutamin dağıtım konsantrasyonu olarak belirlenmiştir. Glutamin yüksek ve daha düşük konsantrasyonları da önemli indüklenen, ama zayıf, kemotaktik yanıt. Bu alan dağıtım analizinde, 1 milimolar glutamin dolu beş ISCA çoğaltmaları Sydney, Avustralya yakınlarındaki bir kıyı bölgesinde 1 saat boyunca konuşlandırıldı.
Ve glutamin dolu ISCA filtrelenmiş deniz suyu ile dolu kontrol kuyuları yaklaşık üç kat daha fazla bakteri çekti. ISCA'yı hem laboratuvarda hem de sahada dağıtırken hatırlanması gereken en önemli şey, kemotaksisi önleyecek güçlü sıvı akımları oluşturmamaktır. ISCA'dan elde edilen numuneler belirli organizmaları veya genleri tanımlamak, kemotaktik organizmaların genomik potansiyelini karakterize etmek ve seçici ortamlarda belirli suşların hedeflenen izolasyonu için kullanılabilir.
