Bu araştırma kısmen Clemson Üniversitesi'ne (1632881) NSF EPSCoR Araştırma Altyapısı hibesi ile desteklendi. Buna ek olarak, bu araştırma kısmen Civitan Uluslararası Araştırma Merkezi, Birmingham, AL tarafından desteklendi. Yazarlar, Birmingham Küçük Hayvan Görüntüleme Paylaşılan Tesis Hibesi'ndeki Alabama Üniversitesi'nin hizmet ve olanaklarının [NIH P30 CA013148] kullanıldığını minnetle kabul ediyor. Yazarlar Rajiv Chopra'yı desteği ve rehberliği için kabul ediyor.

Tüm deneysel işlemler UAB Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak yapılmıştır.
1. Odaklanmış ultrason sürüş ekipmanı kurulumu
<ol><li>(1) ultrason dönüştürücünün girişini RF amplifikatörü çıkışına ve (2) RF amplifikatörün girişini fonksiyon jeneratörünün çıkışına bağlamak için 50 Ohm koaksiyel BNC kablosu kullanın.</li>
	<li>Fonksiyon üreteci modunu %1 görev döngüsü ile saniyede bir kez sinüzoid patlamasına ayarlayın.<ol>
<li>50 dB RF amplifikatörle kullanılan 0,8 inç odak mesafesine sahip sönümlenmiş 1 MHz düşük güçlü daldırma dönüştürücüsü için başlangıç ayarlarını şu şekilde ayarlayın: 1 MHz sinüs dalgası, 1 V tepe noktası ile tepe noktası, 10k döngüsü, 1 s aralık (veya dönem).</li>
		<li>Hava destekli, 1.1 MHz yüksek güçlü dönüştürücü için, ilk ayarları şu şekilde ayarlayın: 1.1 MHz sinüs dalgası, 50 mV tepe noktası pik, 11k döngüler, 1 s aralık. NOT: Dönüştürücüleri su altında kalmadıkça çalıştırmayın. Ultrason odağına bir el veya başka bir vücut parçası yerleştirmeyin veya çalışırken dönüştürücü yüze dokunmayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Odaklanmış ultrason tezgah üstü kurulumu
<ol><li>Stereotaksik çerçeveyi ve stereotaktik çerçeve tutucuyu 3D olarak yazdırın.</li>
	<li>Dönüştürücüsünü PVC boru tutan bir kelepçe kullanarak XYZ konumlayıcıya bağlayın (Şekil 1a). Kelepçeyi X ekseni kaydırağı üzerine cıvatalayın ve bir kanat somunu ile kilitleyin.<ol>
<li>Yüksek güçlü ultrason dönüştürücü kullanıyorsanız, eşleşen bir çift mıknatıs kullanarak PVC boruya takın. Bir mıknatısın bir deliği olduğundan ve diğerinin eşleşen bir çıkıntıya sahip olduğundan emin olun. PVC borunun altını kapın ve mıknatıslardan birini epoksi kullanarak takın (bkz. Şekil 1b).</li>
		<li>İkinci mıknatısı epoksi kullanarak yüksek güçlü ultrason dönüştürücünün üst merkezine takın. Dönüştürücünün tam merkezinde olduğundan emin olun (Şekil 1c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yüksek güçlü ultrason dönüştürücü kullanıyorsanız, XYZ konumlandırıcıyı boş hale getirmek için bir işaretçi yapın. Bu işaretçinin ucu, ultrason dönüştürücü XYZ konumlayıcıya bağlandığında dönüştürücü odağının merkezinin boşluğundaki konumu gösterir. Dönüştürücünün odak mesafesinin uzunluğu artı dönüştürücünün kalınlığı olacak şekilde 18 G iğneden bir işaretçi yapın (Şekil 1d).<ol>
<li>Epoksiyi üçüncü bir mıknatısa uygulayın (bu mıknatıs pvc kapak mıknatısı ile de eşleşmektedir) ve işaretçinin üstüne takın. İşaretçi daha sonra XYZ nulling için PVC boru üzerindeki mıknatısa takabilecektir (Şekil 1d).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Düşük güçlü daldırma dönüştürücüsü kullanıyorsanız, işaretçi ve montaj klibi için dosyayı 3D yazdırın.<ol>
<li>Montaj klipsini PVC boruya kırparak düşük güçlü daldırma dönüştürücüsünü PVC boruya takın ve dönüştürücüyü halkaya takın (Şekil 1f).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akrilik tabakadan kesilmiş parçaları stereotaktik çerçevenin üzerinde hayvanın başının üzerine dayanabilecek şekilde yapıştırarak bir su banyosu yapın (Şekil 1e).<ol>
<li>Banyonun dibinde hayvanın başının yaklaşık büyüklüğünde bir açıklık kesin. Su banyosundaki deliği poliimid bir bantla kapatın. NOT: Farenin kürklerini ıslatabileceği ve hipotermiye neden olabileceği için suyun poliimid bandın etrafına sızmaması için dikkatli olunmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 mm çapında ince kabuklu plastik veya cam küreyi MRI görünür sıvısı (örneğin, E Vitamini yağı) ile doldurarak bir MRI yapın ve kapatın. 3D baskılı stereotaksik çerçevenin sağ tarafındaki MRI fiducial tutucusuna yerleştirin (Şekil 2a).</li>
	<li>3D baskılı çerçeve tutucuyu XYZ konumlayıcıya hayvan konumlandırması için iyi bir konumda sıkıca sabitleyin. Çerçeve tutucunun rostral ucundaki sekmeyi Y ekseni rayında eşleşen kanala kaydırın ve ayarlanan vidalarla sabitleyin(Şekil 1h, kırmızı oklar).</li>
	<li>XYZ konumlandırıcıyı kullanmak için, üreticinin talimatlarını izleyerek USB'yi seri dönüştürücüye bir bilgisayara takın ve dönüştürücüyü takın. Çalışma zamanı ortamını ve motor denetleyicisi yazılımını bilgisayara yükleyin.<ol>
<li>Denetleyici yazılımının ön panelinde bağlantı noktası seçimi açılan denetiminde USB'den seriye dönüştürücüyü seçerek yazılımda uygun seri bağlantı noktasının seçildiğinden emin olun. USB'yi seri dönüştürücüye 9 pinli seri geçit kablosu (örneğin, RS232 boş modem kablosu) kullanarak step motor kontrol cihazı kutusuna bağlayın.</li>
		<li>Step motorlarının yazılım kontrolü altında sürülebileceğini test etmek için denetleyici yazılımını çalıştırın. Bu adım yerel BT desteğinin yardımını gerektirebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. intrakraniyal hedefleme prosedürü
NOT: Bu deneyler için 250-350 g ağırlığında erkek Sprague Dawley sıçanları kullanılmıştır. Hayvanlar su ve sıçan yemeklerine ücretsiz erişime sahipti ve 12:12 saat ışık:karanlık döngüde muhafaza edildi.
<ol><li>Hayvanı anestezi altına koyun (% 3 oksijenli izofluran) ve ayak parmağı sıkışmasına yanıt olup olmadığını kontrol edin. Ardından kateteri aşağıda açıklandığı gibi yerleştirin.<ol>
<li>Kuyruğu yapmak için bir lamba ile ısıtmak damara vurmak daha kolaydır. Hayvanı aşırı ısıtmamaya veya kuyruğu yakmamaya dikkat edin.</li>
		<li>Hayvan uyuduktan sonra (bir parmak sıkışmasına yanıt vermez), mikrobubbles, Evans mavi boya (EBD), MRI kullanıyorsanız gadobutrol MRI kontrastı ve ilgi çekici deneysel ajan sağlamak için kullanılacak 24 G kuyruk damar kateterini yerleştirin. Damar vurulduktan sonra, kan kılıfı dolduracak, kılıfı damarın içine daha fazla iterken iç iğneyi yavaşça çıkaracaktır. NOT: Fare kuyruğu damar enjeksiyonlarını ilk kez yapıyorsanız Stuart ve Schroeder33 gibi bir kılavuza bakın.</li>
		<li>Kan akışı yoksa, iğnenin damardan dürtmüş olabileceğini test etmek için kateter kılımını yavaşça damardan dışarı taşıyın. Kateter hafifçe geri çekildiğinde kan akarsa, önce damardan dürtme yapılır ve kateter yerleşiminin kuyrukta rostral olan başka bir yerde önceki konuma yeniden başlatılması gerekir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kateter fişini salinle doldurun ve kateter fişini port kanla dolmuş olur olmaz kateter bağlantı noktasının ucuna vidalayın. Laboratuvar bandını yerinde tutmak için kateter ve kuyruğun etrafına dikkatlice sarın. Üstte küçük bir parça ile başlayın ve kateter fişinin en ucunun açıkta bırakarak kaudal yönde çalışın.</li>
	<li>Anestezi hattını stereotaksik çerçevedeki anestezi konektörüne takın (Şekil 2a) ve ağzı ısırık çubuğuna yerleştirerek ve kulak çubuklarını her iki kulak kanalına yönlendirerek hayvanların kafasını çerçeveye sabitlayın, ardından ayarlanan vidaları sıkın. Hayvanların kafasının güvenli ve düz olduğundan emin olun.</li>
	<li>Hayvanı MRI yatağına taşıyın ve anestezi hattını burun konisine bağlayın. Bu protokolde 9.4 T küçük delikli hayvan MR'ı kullanıldı.</li>
	<li>Koordinat ölçümleri için tüm beynin yanı sıra MRI fiducial(Şekil 2b)yakalayan koronal ve eksenel T2 ağırlıklı görüntüleri toplayın. MRI protokolünü oluşturabilmeleri için yerel MRI fizikçisine veya teknolojisine aşağıdaki bilgileri sağlayın.<ol>
<li>Koronal görüntüler için(Şekil 2b üst), aşağıdaki parametreleri kullanın: görüntü sayısı: 27, genişlik: 62,2 mm, yükseklik: 62,2 mm, derinlik: 37,97 mm, Voxel boyutu: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.</li>
		<li>Eksenel görüntüler için (Şekil 2b alt), aşağıdaki parametreleri kullanın: görüntü sayısı: 13, Genişlik: 61,47 mm, Yükseklik: 53,81 mm, Derinlik: 16,7 mm, Voxel boyutu: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3. NOT: Düzlem çözünürlüğündeki koronal 0,25 mm'ye yakın olduğu ve görüntüler tüm beyni kapsadığı ve fidüsyal olduğu sürece bu kesin parametrelere sahip olmak gerekli değildir.</li>
	</ol></li>
	<li>FUS ile hedeflenecek MRI'dan beyin bölgesine olan mesafeyi kaydederek yukarıdaki görüntülerden koordinat ölçümleri toplayın.<ol>
<li>Tarayıcıda, adım 3.5'te toplanan koronal görüntülerde, fiducial'ın en büyük olduğu görüntüyü bulun, bu da fiducial'ın merkezini gösterir. Hem medial/lateral yönde hem de dorsal ventral yönde(Şekil 2b, üst) mm'deki ilgi çekici beyin bölgesine olan uzaklığı kaydedin (MRI yazılımı bir ölçek veya nokta ölçüm aracına sahip olacak, bunun nasıl yapılacağını yerel MRI teknolojisine veya fizikçisine danışacaktır).</li>
		<li>Tarayıcıda, adım 3.5'te toplanan eksenel görüntülerde, fidüsyonun en üstünü gösteren görüntüyü bulun ve fidüsilin merkezinden hedef beyin bölgesine olan mesafeyi hem dorsal/ventral yönde hem de medial/lateral yönde ölçün (Şekil 2b, alt).</li>
		<li>İki medial/yanal ölçümü karşılaştırın ve farklıysa ortalamayı kullanın. Bu koordinat ölçümleri, FUS odak noktasını XYZ konumlandırıcı ile hedef beyin bölgesine yönlendirmek için 4.3 adımında daha sonra kullanılacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>MRI prescan görüntülerini toplayın. Bu görüntüleri FUS BBB açılışından sonra toplanan görüntülerle karşılaştırın (Şekil 4). T1 ağırlıklı görüntüler daha sonra BBB açıklığı görselleştirmek için kullanılacaktır, T2 ağırlıklı görüntüler daha sonra FUS tedavisi sonrasında doku hasarı oluşmamasını sağlamak için kullanılacaktır34.<ol>
<li>T1 ağırlıklı eksenel görüntüler için aşağıdaki parametreleri kullanın: genişlik: 30 mm, yükseklik: 51,2 mm, derinlik: 3,0 mm, voksel boyutu: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3, görüntü sayısı: 13.</li>
		<li>T2 ağırlıklı eksenel görüntüler için aşağıdaki parametreleri kullanın: genişlik: 30 mm, yükseklik: 51,2 mm, derinlik: 2,6 mm, voksel boyutu: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3, görüntü sayısı: 13.</li>
		<li>T1 ağırlıklı koronal görüntüler için aşağıdaki parametreleri kullanın: genişlik: 30 mm, yükseklik: 30 mm, derinlik: 27 mm, voksel boyutu: 0,16 x 0,16 x 1 mm3, görüntü sayısı: 27.</li>
		<li>T2 ağırlıklı koronal görüntüler için aşağıdaki parametreleri kullanın: genişlik: 30 mm, yükseklik: 30 mm, derinlik: 27 mm, voksel boyutu: 0,12 x 0,12 x 1 mm3, görüntü sayısı: 27. NOT: Adım 3.5'te olduğu gibi, bu görüntüleme parametrelerinin listelenenlerle tam olarak aynı olması gerekmez. Bu görüntüler, adım 3.5'te toplananlardan daha küçük bir FOV'a ve daha yüksek çözünürlüğe sahiptir.</li>
	</ol></li>
	<li>Hayvanı stereotaksik çerçevede tutarak, hayvanı MRI yatağından tezgah üstü FUS kurulumuna hızlı bir şekilde taşıyın. Anestezi etkisi altında transfer için hayvanın uykuda kalmasını sağlayın.</li>
	<li>Daha uzun aktarım süreleri için, aktarım için hayvana ve çerçeveye sığacak kadar büyük bir kutu kullanın. Anestezi fişi hala takılıyken, hayvanı ve çerçeveyi kutunun içine yerleştirin ve fazla izofluranın kutuyu birkaç dakika doldurmasına izin verin. Anestezi hattının fişini çekin ve hızlı bir şekilde aktarın.</li>
</ol>4. Odaklanmış ultrason prosedürü
<ol><li>FUS tezgah kurulumuna geldikten sonra, anestezi hattını hemen burun konisine takın ve oksijenle% 1.5-3 izofluran çalıştırmaya devam edin. Hayvanın uyanmasını önlemek için bunu mümkün olduğunca çabuk yapın.</li>
	<li>Çerçeveyi çerçeve tutucusuna kaydırın ve sıkıca yerine tutturun. Hayvanın kafasını tıraş etmek için makas kullanın. Fazla saçları fırçalayın ve saç derisine saç çıkarıcı krem uygulayın. 3 dakika bekletin ve su ve gazlı bezle silin.</li>
	<li>MRI hedefleme için mevcut değilse, işaretçi ucunu bregma'ya dokunarak (bunun için bir kafa derisi kesisi gerekir) ve yazılımı geçersiz kılarak veya koordinatları kaydederek işaretçi konumunu bregma'ya boş etmek için standart (3D baskılı değil) stereotaktik bir çerçeve kullanın. Yazılımdaki yukarı 50 düğmesine tıklayarak ve işaretçiyi dönüştürücüyle değiştirerek XYZ taşıyıcısını 50 mm yukarı taşıyın. Daha önce açıklandığı gibi bir sıçan beyin atlasına dayanarak35Yazılımdaki basamak düğmelerini kullanarak istenen beyin koordinatlarına geçin. MRI yerine bu yöntemi kullanıyorsanız, bölüm 4.6'ya geçin.</li>
	<li>MRI kılavuzunu kullanıyorsanız, işaretçiyi takın ve işaretçiyi MRI fiducial konumuna taşıyın (Şekil 1d,g). İşaretçiyi MRI fiducial'ın en üstüne ve ortasına yerleştirin (işaret etmek için fiducial tutucunun üst kısmında küçük bir delik sağlanır). MRI görüntüsündeki tüm mesafelerin hesapladığı nokta olan boş konum düğmesini tıklatın.</li>
	<li>İşaretçiyi kaldırın ve konumlandırıcıyı orta/yan koordinatlara ve rostral/kaudal koordinatlara taşıyın. Su banyosu ve ultrason jelinin yerleştirilmesine izin vermek için yukarı 50 düğmesine basarak pozisyoneri yükseltin. Z ekseni yolculuğunun en üstüne ulaşılırsa, nulllama konumu geçersiz kılınır. Dorsal/ventral koordinat dönüştürücü eklendikten sonra ayarlanır.</li>
	<li>Hayvanın kafa derisine ultrason jeli uygulayın ve su banyoyu jel üzerine bastırılmış poliimid bant penceresi ile hayvanın üzerine yerleştirin. Ultrason jelinde hava kabarcıkları olmadığından emin olun.</li>
	<li>Su banyosunu gazlı suyla doldurun.</li>
	<li>Yüksek güçlü dönüştürücü kullanıyorsanız, konumlayıcıyı mıknatıs suyun hemen üzerinde olacak şekilde dirayeti haline getirin. Hava kabarcıklarının yüzün altına sıkışmasını önlemek ve mıknatısları bağlamak için dönüştürücüyu bir açıyla suya dikkatlice indirerek konumlandırıcıya takın.</li>
	<li>Düşük güçlü daldırma dönüştürücüsü kullanıyorsanız, konumlayıcıyı dönüştürücü klipsinin hemen üstündeki suya haline getirin. Daha sonra hava kabarcıklarının yüzün altına sıkışmasını önlemek için dönüştürücünün yavaşça suya bir açıyla indirilerek yerine kırpın. NOT: Şeffaf bir banyo, kabarcıklar için dönüştürücü yüzünün altına bakarken faydalıdır.</li>
	<li>Konumlayıcıyı sırt/ventral koordinata 2007'den aşağı 2007'den buyur.</li>
	<li>RF güç amplifiktörü açın.</li>
	<li>İğne ucunu kateter fişine sokup enjekte ederek %3 Evans mavi boyasının (EBD) 1 mL/kg'ını enjekte edin. 5 dakika boyunca dolaşmasına izin verin.</li>
	<li>Mikrobubbles kabarcık çalkalayıcı ile şiddetli bir şekilde sallayarak aktive.<ol>
<li>2 FUS tedavisini ve 18 G kanatlı infüzyon setinin borularını hesaba katmak için0,2mL salin içinde 30 μL / kg mikrobubbles (kabarcık conc. 1.2 x 10 10 / mL) dozunun 5 katını hazırlayın. Örneğin, sıçan 200 g ağırlığındaysa, 18 G iğne ucu içeren şırıngayı 1 mL salin içinde 30 μL mikrobubbles ile doldurun. NOT: Kanatlı infüzyon setini hem almak hem de enjekte etmek için 18 G iğne ucu kullandığınızdan emin olun.</li>
		<li>Mikrobubblelerin düzgün bir dağılımını elde etmek için şırıngayı birkaç kez ters çevirin. Daha sonra kanatlı infüzyon setini takın ve doldurun. Şırınnayı infüzyon pompasına yerleştirin ve infüzyon pompasını 6 mL/s hızında 0,2 mL'ye ayarlayın. Bu, 2 dakikalık FUS maruziyeti üzerinde mikrobubbles yavaş infüzyonu sağlayacaktır.</li>
		<li>Kanatlı iğneyi kateter fişine yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>İlk olarak, infüzyon pompasını çalıştırın, 3 s bekleyin ve fonksiyon üretecindeki çıkış etkinleştir düğmesine basarak FUS tedavisine başlayın (Etiketli"üzerinde" malzeme tablosundaki fonksiyon üretecinde). Mikrobubbles temizlemek için arada 5 dakika ile bölge başına iki kez tekrarlayın.<ol>
<li>İnfüzyon pompası 2 dakika durduğunda FUS tedavisini durdurmak için fonksiyon jeneratöründeki açma düğmesine tekrar basın.</li>
		<li>Mikrobubbles temizlemek için 5 dakika bekleyin. Daha sonra infüzyona ve ikinci FUS tedavisine başlayın.</li>
		<li>İkinci FUS tedavisinden hemen sonra, gadobutrol kontrastını (MRI kullanıyorsanız) ve örneğin viral parçacıklar gibi ilgi çekici maddeyi enjekte edin. Tüm ajanların toplam teslim hacmi 5 mL/kg'ı geçmemelidir. NOT: İlgi çekicinin teslimat zamanlaması (örneğin, FUS BBB açılışından önce veya sonra) kullanılan temsilciye bağlı olarak farklılık gösterebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>RF güç amplifikatörunu kapatın ve hayvanı hemen MRI'a geri taşıyın.</li>
</ol>5. BBB açılışının MRI onayı
<ol><li>MRI kullanılamıyorsa, bölüm 6'ya atlayın ve BBB açılışını onaylamak için EBD ifadesini kullanın.</li>
	<li>Hayvanı 3.7.</li>
	<li>BBB açılış bölgesinde gadobutrol MRI geliştirmesini görselleştirmek için adım 3.7'de kullanılan görüntüleme parametreleriyle MRI sonrası taramaları toplayın (Şekil 3b,e).</li>
</ol>6. Perfüzyon ve doku toplama
<ol><li>Kan tamamen temizlenine kadar hayvanı soğuk% 4 formalin ile perfuse edin.</li>
	<li>Beyni çıkarın ve bir gecede 4 °C'de% 4 formalin veya PFA'ya yerleştirin. Daha sonra, beyin batana kadar (yaklaşık 2-3 gün) beyni% 30 sakkaroz çözeltisine yerleştirin. Son olarak, sıvı nitrojende veya kuru buzda flaş dondurun ve kriyoseksiyona kadar -80 °C'de saklayın.</li>
	<li>OCT'de beyni dondurun ve kriyoseksiyon alın.</li>
	<li>Floresan mikroskopi için bölümleri düzeltin ve örtün. EBD ekscitasyon 470 ve 540 nm'de zirveler ve emisyon 680 nm'de zirveler. Genel hücresel morfolojiyi görselleştirmek için DAPI montaj ortamına sahip coverlip.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, MRI rehberliği ile ve MRI rehberliği olmadan intrakraniyal hedefleme için iki farklı dönüştürücü ve yöntem de dahil olmak üzere alternatif yaklaşımlarla mikrobubble destekli FUS BBB açılışına bir tezgah üstü yaklaşım tanımladık. Şu anda, laboratuvarda MRI destekli FUS BBB açıklığı oluşturmak için, kullanıcı dostu arayüzlerle son derece standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayan mükemmel kullanıma hazır cihazlar satın alma seçeneği vardır. Ancak, bir?...

Temel nörobilimdeki birçok keşfet rağmen, nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozukluklar için ortaya çıkan tedavilerin sayısı nispeten sınırlı kalır1,2. Nörolojik bozukluklarda yer alan genlerin, moleküllerin ve hücresel devrelerin daha derin bir şekilde anlaşılması, mevcut tekniklerle insanlarda gerçekleşmez umut verici tedaviler önermektedir3. Etkili tedaviler genellikle beyin penetrable ve4,5 ,6,7,8olma ihtiyacı ile sınırlıdır. Bununla birlikte, belirli beyin bölgelerine lokalize ilaç teslimatının mevcut yöntemleri (örneğin, enjeksiyon veya kavun yoluyla doğum) invazivdir ve kafatasında bir açıklık yapılmasını gerektirir9. Bu ameliyatın invazivliği, insan beynine lokalize doğumun rutin kullanımını önler. Ek olarak, doku hasarı ve ortaya çıkan enflamatuar yanıtlar, intraserebral enjeksiyona dayanan temel ve preklinik çalışmalar için her yerde bulunan kafa karıştırıcıdır10. Ajanları kan beyin bariyeri (BBB) boyunca invaziv olarak teslim etme ve belirli beyin bölgelerine hedefleme yeteneği, nörolojik bozuklukların tedavileri üzerinde muazzam bir etkiye sahip olabilirken, aynı zamanda klinik öncesi araştırmalar için güçlü bir araştırma aracı sağlayabilir.
BBB genelinde minimum doku hasarı ile hedeflenen bir taşıma yöntemi, BBB 11, 12 , 13 , 14,15,16'yıodaklamak ve geçici olarak açmak için mikrobubbles ile birlikte transkraniyal odaklı ultrasondur (FUS). FUS BBB açılımı nörodejeneratif bozuklukların tedavisinde son zamanlarda ilgi gördü, nörotrofik faktörler 17 , 18 , 19 , gen tedavileri 20,21,22,antikorlar23,nörotransmitterler24ve nanopartiküller25 , 26,27,28,29 gibi beyin bölgelerini hedeflemek için terapötikleri lokalize ederek inme ve glioma . Geniş uygulama yelpazesi ve noninvaziv yapısıile 30,31, FUS BBB açıklığı rutin stereotaksik intrakraniyal enjeksiyonlara ideal bir alternatiftir. Ayrıca, insanlarda mevcut kullanımı nedeniyle30,32, bu tekniği kullanan preklinik araştırmalar son derece çevirisel olarak kabul edilebilir. Bununla birlikte, FUS BBB açılışı, erişilebilirlik eksikliği nedeniyle temel bilim ve preklinik araştırmalarda henüz yaygın bir teknik olmamıştır. Bu nedenle, bu tekniği kurmak isteyen laboratuvarlar için bir başlangıç noktası olarak FUS BBB açılışına tezgah üstü bir yaklaşım için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Bu çalışmalar ya yüksek güçlü hava destekli FUS spesifik ultrason dönüştürücü ya da düşük güçlü sönümlenmiş odaklanmış ultrasonik daldırma dönüştürücü ile yürütüldü. Dönüştürücüler, reaktif yükler için tasarlanmış bir RF güç amplifikatörü ve standart bir tezgah üstü fonksiyon jeneratörü tarafından tahrik edildi. Bu öğelerin ayrıntıları Malzeme Tablosu'nda bulunabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1437px;" width="1437">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Bubble shaker</td>
			<td style="width:240px;">Lantheus Medical Imaging</td>
			<td style="width:197px;">VMIX</td>
			<td style="width:729px;">VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Catheter plug/ Injection cap</td>
			<td>SAI infusion technologies</td>
			<td>Part Number: IC</td>
			<td style="width:729px;">Catheter plug/ Injection cap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Evans blue dye</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">E2129-10G</td>
			<td style="width:729px;">Evans blue dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Function generator</td>
			<td style="width:240px;">Tektronix</td>
			<td style="width:197px;">AFG3022B</td>
			<td>Dual channel, 250MS/s, 25MHz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FUS transducer, 1.1MHz</td>
			<td style="width:240px;">FUS Instruments</td>
			<td>TX-110</td>
			<td>1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Heating pad for Mice and Rats</td>
			<td style="width:240px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:197px;">PS-03</td>
			<td>Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Infusion pump</td>
			<td style="width:240px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:197px;">780100</td>
			<td>KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Kapton tape</td>
			<td style="width:240px;">Gizmo Dorks</td>
			<td>https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ 
			ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91</td>
			<td>Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low power immersion transducer, 1MHz</td>
			<td style="width:240px;">Olympus</td>
			<td>V303-SU</td>
			<td>Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Magnet sets</td>
			<td style="width:240px;">WINOMO</td>
			<td>https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ 
			ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC</td>
			<td>WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RF amplifier</td>
			<td style="width:240px;">E&#38;I</td>
			<td style="width:197px;">A075</td>
			<td>75W</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Tail vein catheter</td>
			<td style="width:240px;">BD</td>
			<td>382512/ Fisher Item: NC1228513</td>
			<td>24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ultrasound contrast microbubbles</td>
			<td>Lantheus Medical Imaging</td>
			<td style="width:197px;">DE4, DE16</td>
			<td>DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:240px;">Aquasonic</td>
			<td>https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ 
			ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P</td>
			<td>Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Winged infusion sets, 22ga.</td>
			<td style="width:240px;">Fisher Healthcare</td>
			<td>22-258087</td>
			<td>Terumo Surflo Winged Infusion Sets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">motor controller software</td>
			<td style="width:240px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:729px;">custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">runtime environment for the motor controller software</td>
			<td style="width:240px;">National Instruments</td>
			<td>LabView runtime engine version 2017 or better</td>
			<td>https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner)</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bolts</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MB-1</td>
			<td>BiSlide Bolt 1/4-20x3/4&#34; Socket cap screw (10 pack), Qty:3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">motor controller</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>VXM-3</td>
			<td style="width:729px;">Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mounting cleats</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MC-2</td>
			<td>Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mounting cleats</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MC-2</td>
			<td style="width:729px;">Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">usb to serial converter</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>VXM-USB-RS232</td>
			<td style="width:729px;">USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">x-axis linear stage</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MN10-0100-M02-21</td>
			<td style="width:729px;">BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">x-axis stepper motor</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>PK266-03A-P1</td>
			<td>Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">y-axis linear stage</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MN10-0100-M02-21</td>
			<td>BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">y-axis stepper motor</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>PK266-03A-P1</td>
			<td style="width:729px;">Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">z-axis damper</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>D6CL-6.3F</td>
			<td style="width:729px;">D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">z-axis linear stage</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MN10-0100-M02-21</td>
			<td style="width:729px;">BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">z-axis stepper motor</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>PK266-03B-P2</td>
			<td style="width:729px;">Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">3D printable files</td>
			<td style="width:240px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Immersion transducer mount and pointer</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stereotaxic frame</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stereotaxic frame holder</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">9.4T small bore animal MRI</td>
			<td style="width:240px;">Bruker</td>
			<td style="width:197px;">Bruker BioSpec 94/20</td>
			<td>ParaVision version 5.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">AAV9-hsyn-GFP</td>
			<td style="width:240px;">Addgene</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Cream hair remover</td>
			<td style="width:240px;">Church &#38; Dwight</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>Nair cream</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">gadobutrol MRI contrast agent</td>
			<td style="width:240px;">Bayer</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stereotactic frame</td>
			<td style="width:240px;">Stoelting</td>
			<td style="width:197px;">#51500</td>
			<td>not MRI compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">turnkey FUS delivery device</td>
			<td style="width:240px;">FUS Instruments</td>
			<td style="width:197px;">RK-300</td>
			<td style="width:729px;">ready to use MRI compatible FUS for rodents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a benchtop approach to the location specific blood brain barrier opening using focused ultrasound in a rat model

Stereotaksik cerrahi, kemirgen beynine lokalize ilaç ve gen iletimi için altın standarttır. Bu teknik, bir hedef beyin bölgesine hassas lokalizasyon ve hedef yan etkilerin azaltılması da dahil olmak üzere sistemik teslimata göre birçok avantaja sahiptir. Bununla birlikte, stereotaksik cerrahi, çevirisel etkinliğini sınırlayan, uzun iyileşme süreleri gerektiren ve birden fazla beyin bölgesini hedeflerken zorluklar sağlayan son derece invazivdir. Odaklanmış ultrason (FUS), milimetre büyüklüğündeki bölgelerde kan beyin bariyerini (BBB) geçici olarak açmak için dolaşımdaki mikrobubbles ile birlikte kullanılabilir. Bu, normalde BBB'den geçemeyen sistemik olarak teslim edilen ajanların intrakraniyal lokalizasyonuna izin verir. Bu teknik stereotaksik cerrahiye noninvaziv bir alternatif sağlar. Bununla birlikte, bugüne kadar bu teknik, ekipmana ve standart yöntemlere sınırlı erişim nedeniyle nörobilim laboratuvarlarında henüz yaygın olarak benimsenmemiştir. Bu protokolün genel amacı, FUS BBB açılışına (BBBO) uygun fiyatlı ve tekrarlanabilir ve bu nedenle herhangi bir laboratuvar tarafından kolayca benimsenebilecek bir tezgah üstü yaklaşım sağlamaktır.

Burada, mikrobubbles ile odaklanmış ultrasonun hem düşük güçlü daldırma dönüştürücüsü (Şekil 3) hem de FUS dönüştürücüsü ( Şekil4) ile yukarıda belirtilen parametreleri kullanarak lokalize BBB açıklığını teşvik edebileceğini gösteriyoruz. İlk olarak, erken deneylerde, düşük güçlü daldırma dönüştürücüsü bir beyin yarımküresine veya ön (Şekil 3b) veya medial(Ş...

Watch this Scientific Journal Video about A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model at JoVE.com

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Mikrobubble ajanları ile odaklanmış ultrason odaklama odak ve geçici kan beyin bariyeri açabilirsiniz. Bu teknik, kan beyin bariyeri boyunca çok çeşitli ajanlar sunmak için kullanılmıştır. Bu makale, MRI kılavuzu olsun veya olmadan kemirgen beynine lokalize teslimat için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Bir Sıçan Modelinde Odaklanmış Ultrason Kullanarak Konuma Özgü Kan Beyin Bariyeri Açılışına Tezgah Üstü Yaklaşım

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

a-benchtop-approach-to-location-specific-blood-brain-barrier-opening

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.5K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham. Mikrobubble ajanları ile odaklanmış ultrason odaklama odak ve geçici kan beyin bariyeri açabilirsiniz. Bu teknik, kan beyin bariyeri boyunca çok çeşitli ajanlar sunmak için kullanılmıştır. Bu makale, MRI kılavuzu olsun veya olmadan kemirgen beynine lokalize teslimat için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Video: A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Nörobilim

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

Yetişkin Rat spesifik Beyin Alanlarının eksitotoksik Lezyon için Stereotaksik Cerrahi

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Kan - beyin bariyerini bozulma iskemik inme, bir fare modeli Vivo içinde değerlendirilmesi

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Ateş Ex Vivo sıçan beyin dilimleri kullanarak birincil olayları incelemek için alternatif bir yaklaşım

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

Bariyer geçişleri patojenler veya ilaçlar ve onların etkileşim beyin ile çalışmak için bir insan kan-beyin arabirim modeli

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

Kemirgenlerde Kan-Beyin Bariyeri Açıklığı için Yüksek Verimli Görüntü Destekli Stereotaktik Nöronavigasyon ve Odaklanmış Ultrason Sistemi

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Beyin Yapılarını Hedeflemek ve Kemogenetik Nöromodülasyonu Değerlendirmek için Odaklanmış Ultrason Kaynaklı Kan-Beyin Bariyeri Açılması

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase uptake of antibodies and engagement through transient opening of the blood-brain barrier (BBB). In our laboratory, we are developing therapeutic approaches for neurodegenerative diseases in which an antibody in various formats is delivered across the BBB using microbubbles, concomitant with focused ultrasound application through the skull targeting multiple spots, an approach we refer to as scanning ultrasound (SUS). The mechanical effects of microbubbles and ultrasound on blood vessels increases paracellular transport across the BBB by transiently separating tight junctions and enhances vesicle- mediated transcytosis, allowing antibodies and therapeutic agents to effectively cross. Moreover, ultrasound also facilitates the uptake of antibodies from the interstitial brain into brain cells such as neurons where the antibody distributes throughout the cell body and even into neuritic processes. In our studies, fluorescently labeled antibodies are prepared, mixed with in-house prepared lipid-based microbubbles and injected into mice immediately before SUS is applied to the brain. The increased antibody concentration in the brain is then quantified. To account for alterations in normal brain homeostasis, microglial phagocytosis can be used as a cellular marker. The generated data suggest that ultrasound delivery of antibodies is an attractive approach to treat neurodegenerative diseases.

Presented here is a protocol to transiently open the blood-brain barrier (BBB) either focally or throughout a mouse brain to deliver fluorescently-labeled antibodies and activate microglia. Also presented is a method to detect the delivery of antibodies and microglia activation by histology.

Odaklanmış Taramalı Ultrason Kullanarak Antikorların Beyne Verilmesi

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. Establishment of the EcoHIV infected rat model for studies of drug abuse and neurocognitive disorders, would be beneficial in the study of neuroHIV and HIV-1 associated neurocognitive disorders (HAND). In the present study, we demonstrate the successful creation of a rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV). First, the lentiviral construct of EcoHIV was packaged in cultured 293 FT cells for 48 hours. Then, the conditional medium was concentrated and titered. Next, we performed bilateral stereotaxic injections of the EcoHIV-EGFP into F344/N rat brain tissue. One week after infection, EGFP fluorescence signals were detected in the infected brain tissue, indicating that EcoHIV successfully induces an active HIV infection in rats. In addition, immunostaining for the microglial cell marker, Iba1, was performed. The results indicated that microglia were the predominant cell type harboring EcoHIV. Furthermore, EcoHIV rats exhibited alterations in temporal processing, a potential underlying neurobehavioral mechanism of HAND as well as synaptic dysfunction eight weeks after infection. Collectively, the present study extends the EcoHIV model of HIV-1 infection to the rat offering a valuable biological system to study HIV-1 viral reservoirs in the brain as well as HAND and associated comorbidities such as drug abuse.

Here, we present a protocol to establish a new rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV), which is critical for enhancing our understanding of HIV-1 viral reservoirs in the brain and offering a system to study HIV-associated neurocognitive disorders and associated comorbidities (i.e., drug abuse).

EcoHIV Beyin Enfeksiyonunun Bir Sıçan Modeli

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Türetilen Bir 3D Kan-Beyin Bariyeri Modeli

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

Yazar Spotlight: In Vitro Kan-Beyin Bariyeri Modeli Kullanarak Alzheimer Hastalığını Araştırmaya Yönelik Kişiselleştirilmiş Bir Yaklaşım 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...