Esta pesquisa foi apoiada em parte por uma bolsa de Infraestrutura de Pesquisa da NSF EPSCoR para a Universidade Clemson (1632881). Além disso, esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Civitan International Research Center, Birmingham, AL. Os autores reconhecem com gratidão o uso dos serviços e instalações da Universidade do Alabama em Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Os autores reconhecem Rajiv Chopra por seu apoio e orientação.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) da UAB.
1. Configuração focada do equipamento de condução de ultrassom
<ol><li>Utilize 50 cabos BNC coaxiais Ohm para conectar (1) a entrada do transdutor de ultrassom à saída do amplificador RF e (2) a entrada do amplificador RF à saída do gerador de função.</li>
	<li>Ajuste o modo gerador de função para uma rajada sinusoide uma vez por segundo com um ciclo de 1% de serviço.<ol>
<li>Para o transdutor de imersão de baixa potência de 1 MHz úmido com uma distância focal de 0,8 polegadas usada com um amplificador RF de 50 dB, defina as configurações iniciais para: onda seno de 1 MHz, pico de 1 V ao pico, ciclo de 10k, intervalo de 1 s (ou período).</li>
		<li>Para o ar apoiado, transdutor de alta potência de 1,1 MHz, defina as configurações iniciais para: onda seno de 1,1 MHz, pico de 50 mV ao pico, ciclos de 11k, intervalo de 1 s. NOTA: Não opere os transdutores a menos que estejam submersos. Não coloque uma mão ou outra parte do corpo no foco do ultrassom ou toque na face do transdutor enquanto estiver em funcionamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Configuração focada no bancada de ultrassom
<ol><li>Imprima em 3D o quadro estereotício e o porta-quadros estereotáticos.</li>
	<li>Conecte o transdutor ao posicionador XYZ usando um grampo segurando um tubo de PVC(Figura 1a). Aperte o grampo no deslizamento do eixo X e bloqueie com uma porca de asa.<ol>
<li>Se usar o transdutor de ultrassom de alta potência, conecte-o ao tubo de PVC usando um par de ímãs combinados. Certifique-se de que um ímã tem um orifício e o outro tem uma saliência correspondente. Tampe a parte inferior do tubo de PVC e conecte um dos ímãs a ele usando epóxi (ver Figura 1b).</li>
		<li>Conecte o segundo ímã ao centro superior do transdutor de ultrassom de alta potência usando epóxi. Certifique-se de que está no centro do transdutor (Figura 1c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se usar o transdutor de ultrassom de alta potência, faça um ponteiro para anular o posicionador XYZ. A ponta deste ponteiro indica a localização no espaço do centro do foco do transdutor quando o transdutor de ultrassom estiver ligado ao posicionador XYZ. Faça um ponteiro de uma agulha de 18 G cortada para ser o comprimento da distância focal do transdutor mais a espessura do transdutor(Figura 1d).<ol>
<li>Aplique epóxi em um terceiro ímã (este ímã também emparelha com o ímã da tampa de PVC) e conecte-o à parte superior do ponteiro. Em seguida, o ponteiro poderá ser anexado ao ímã no tubo de PVC para nulidade XYZ(Figura 1d).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se usar o transdutor de imersão de baixa potência, imprima em 3D o arquivo para o ponteiro e o clipe de montagem.<ol>
<li>Conecte o transdutor de imersão de baixa potência ao tubo de PVC, cortando o clipe de montagem no tubo de PVC e inserindo o transdutor no anel(Figura 1f).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faça um banho de água colando peças cortadas da folha de acrílico que poderão descansar em cima da cabeça do animal acima do quadro estereotático(Figura 1e).<ol>
<li>Corte uma abertura no fundo do banho que é do tamanho da cabeça do animal. Cubra o buraco no banho de água com uma fita de poliimida. NOTA: Deve-se tomar cuidado para garantir que a água não vaze ao redor da fita de poliimida, pois pode molhar a pele do rato e causar hipotermia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faça uma ressonância magnética fiducial preenchendo uma esfera de plástico ou vidro de 4 mm de diâmetro com um fluido visível de ressonância magnética (por exemplo, óleo de vitamina E) e selá-lo. Coloque-o no suporte fiducial de ressonância magnética no lado direito do quadro estereotítico impresso em 3D(Figura 2a).</li>
	<li>Fixar firmemente o suporte de quadro impresso em 3D ao posicionador XYZ em um bom local para posicionamento animal. Deslize a guia na extremidade rostral do suporte do quadro para o canal correspondente no trilho do eixo Y e fixando com parafusos definidos(Figura 1h, setas vermelhas).</li>
	<li>Para dirigir o posicionador XYZ, instale o conversor USB para serial em um computador seguindo as instruções do fabricante e conecte o conversor. Instale o ambiente de tempo de execução e o software do controlador do motor no PC.<ol>
<li>Certifique-se de que a porta serial adequada seja selecionada no software selecionando o CONVERSOR USB para serial no controle de dropdown de seleção da porta no painel frontal do software do controlador. Conecte o USB ao conversor serial à caixa do controlador do motor do estepe usando um cabo crossover serial de 9 pinos (por exemplo, cabo de modem nulo RS232).</li>
		<li>Execute o software do controlador para testar que os motores do stepper podem ser acionados sob controle de software. Esta etapa pode exigir a assistência do suporte local de TI.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Procedimento de segmentação intracraniana
NOTA: Ratos machos Sprague Dawley pesando 250-350 g foram usados para esses experimentos. Os animais tinham livre acesso à água e à comida de rato, e eram mantidos em um ciclo claro: escuro de 12:12 h.
<ol><li>Coloque o animal sob anestesia (3% isoflurane com oxigênio) e verifique se há falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo do dedo. Em seguida, insira o cateter conforme descrito abaixo.<ol>
<li>Aqueça a cauda com uma lâmpada para fazer é mais fácil de acertar a veia. Tenha cuidado para não superaquecer o animal ou queimar a cauda.</li>
		<li>Uma vez que o animal esteja dormindo (não responde a uma pitada de dedo do dedo do dedo), insira o cateter da veia da cauda de 24 G que será usado para entregar microbolhas, corante azul Evans (EBD), contraste de ressonância magnética gadobutrol se usar ressonância magnética, e o agente experimental de interesse. Uma vez que a veia é atingida, o sangue encherá a bainha, lentamente removerá a agulha interna enquanto empurra a bainha mais para dentro da veia. NOTA: Veja um guia como Stuart e Schroeder33 se fizerem as injeções da veia da cauda do rato pela primeira vez.</li>
		<li>Se não houver fluxo sanguíneo, mova lentamente a bainha do cateter para fora da veia para testar que a agulha pode ter cutucado através da veia. Se o sangue fluir quando o cateter é puxado para trás ligeiramente, então primeiro poke atravessou a veia e a colocação do cateter precisará ser reiniciada em outro local na cauda que é rostral para o local anterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Encha o plugue do cateter com soro fisiológico e enrosque o cateter plugue na extremidade da porta do cateter assim que a porta estiver cheia de sangue. Enrole cuidadosamente a fita de laboratório ao redor do cateter e da cauda para mantê-lo no lugar. Comece com uma pequena peça na parte superior e trabalhe na direção caudal, deixando a extremidade do plugue do cateter exposta.</li>
	<li>Conecte a linha de anestesia no conector da anestesia no quadro estereotaxico(Figura 2a)e fixe a cabeça dos animais na moldura, colocando a boca na barra de mordida e guiando as barras de ouvido em ambos os canais auditivos, em seguida, aperte os parafusos do conjunto. Certifique-se de que a cabeça dos animais está segura e nivelada.</li>
	<li>Mova o animal para o leito de ressonância magnética e conecte a linha de anestesia ao cone do nariz. Neste protocolo foi utilizada uma ressonância magnética animal de 9,4 T.</li>
	<li>Coletar imagens coronárias e axiais de peso T2 que capturam todo o cérebro, bem como o fiduciário de ressonância magnética(Figura 2b) para medições coordenadas. Forneça ao físico ou técnico de ressonância magnética local as seguintes informações para que eles possam construir o protocolo de ressonância magnética.<ol>
<li>Para imagens coronais (Figura 2b superior), utilize os seguintes parâmetros: número de imagens: 27, largura: 62,2 mm, altura: 62,2 mm, profundidade: 37,97 mm, tamanho Voxel: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.</li>
		<li>Para imagens axiais(Figura 2b inferior), utilize os seguintes parâmetros: número de imagens: 13, Largura: 61,47 mm, Altura: 53,81 mm, Profundidade: 16,7 mm, tamanho Voxel: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3. NOTA: Não é necessário ter esses parâmetros exatos, desde que o coronal em resolução do plano esteja perto de 0,25 mm e as imagens cubram todo o cérebro e fiduciário.</li>
	</ol></li>
	<li>Colete medições coordenadas das imagens acima registrando a distância do fiducial de ressonância magnética até a região cerebral que será alvo de FUS.<ol>
<li>No scanner, nas imagens coronais coletadas na etapa 3.5, encontram-se a imagem em que o fiducial é o maior, indicando o centro do fiduciário. Regisso o ponto de distância do topo do fiduciário até a região do cérebro de interesse em mm (o software de ressonância magnética terá uma ferramenta de medição de escala ou ponto, consulte a tecnologia ou físico local de ressonância magnética sobre como fazer isso) tanto na direção medial/lateral quanto na direção ventral dorsal(Figura 2b, topo).</li>
		<li>No scanner, nas imagens axiais coletadas na etapa 3.5, encontre a imagem que mostra a parte superior do fiduciário e meça a distância do centro do fiducial até a região cerebral alvo tanto na direção dorsal/ventral quanto na direção medial/lateral(Figura 2b, inferior).</li>
		<li>Compare as duas medidas medial/lateral e se forem diferentes use a média. Estas medidas coordenadas serão usadas mais tarde na etapa 4.3 para guiar o ponto focal do FUS para a região cerebral alvo com o posicionador XYZ.</li>
	</ol></li>
	<li>Colete imagens de ressonância magnética. Compare essas imagens com as imagens coletadas após a abertura do FUS BBB (Figura 4). Imagens ponderadas com T1 serão usadas posteriormente para visualizar a abertura do BBB, imagens ponderadas com T2 serão posteriormente usadas para garantir que nenhum dano tecidual tenha ocorrido após o tratamento de FUS34.<ol>
<li>Para imagens axiais ponderadas em T1, utilize os seguintes parâmetros: largura: 30 mm, altura: 51,2 mm, profundidade: 3,0 mm, tamanho do voxel: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3, número de imagens: 13.</li>
		<li>Para imagens axiais ponderadas por T2, utilize os seguintes parâmetros: largura: 30 mm, altura: 51,2 mm, profundidade: 2,6 mm, tamanho do voxel: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3, número de imagens: 13.</li>
		<li>Para imagens coronais ponderadas t1, utilize os seguintes parâmetros: largura: 30 mm, altura: 30 mm, profundidade: 27 mm, tamanho do voxel: 0,16 x 0,16 x 1 mm3, número de imagens: 27.</li>
		<li>Para imagens coronais ponderadas t2, utilize os seguintes parâmetros: largura: 30 mm, altura: 30 mm, profundidade: 27 mm, tamanho do voxel: 0,12 x 0,12 x 1 mm3, número de imagens: 27. NOTA: Como na etapa 3.5, esses parâmetros de imagem não precisam ser exatamente os mesmos listados. Essas imagens têm um FOV menor e resolução maior do que as coletadas na etapa 3.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Mantendo o animal na estrutura estereotaxa, transporte rapidamente o animal do leito de ressonância magnética até a configuração do FUS do topo do banco. Certifique-se de que o animal permaneça dormindo para a transferência sob o efeito da anestesia.</li>
	<li>Para tempos de transferência mais longos, use uma caixa para transferência que seja grande o suficiente para caber no animal e no quadro. Com o plugue de anestesia ainda ligado, coloque o animal e o quadro dentro da caixa e deixe o excesso de isoflurane encher a caixa por alguns minutos. Desligue a linha de anestesia e transfira rapidamente.</li>
</ol>4. Procedimento de ultrassom focado
<ol><li>Ao chegar à configuração do banco fus, conecte imediatamente a linha de anestesia no cone do nariz e continue a correr 1,5-3% de isoflurano com oxigênio. Faça isso o mais rápido possível para evitar que o animal acorde.</li>
	<li>Deslize o quadro para o suporte da armação e encaixe-o firmemente. Use cortadores para raspar a cabeça do animal. Escove o excesso de cabelo e aplique creme de removedor de cabelo no couro cabeludo. Deixe descansar por 3 minutos e limpe com água e gaze.</li>
	<li>Se a ressonância magnética não estiver disponível para segmentação, use um quadro estereotático padrão (não impresso em 3D) para anular a posição do ponteiro para bregma tocando na ponta do ponteiro para bregma (uma incisão do couro cabeludo será necessária para isso) e anulando o software ou gravando as coordenadas. Mova a carruagem XYZ em 50 mm clicando no botão up 50 no software e trocando o ponteiro pelo transdutor. Com base em um atlas cerebral de rato como descrito anteriormente35, mova-se para as coordenadas cerebrais desejadas usando os botões de pisação no software. Se usar este método em vez de ressonância magnética, pule para a seção 4.6.</li>
	<li>Se utilizar orientação de ressonância magnética, conecte o ponteiro e mova o ponteiro para a localização do fiducial de ressonância magnética(Figura 1d,g). Posicione o ponteiro na parte superior e central do fiducial de ressonância magnética (é fornecido um pequeno orifício na parte superior do suporte fiducial para apontar). Clique no botão de posição nula que é o ponto a partir do qual todas as distâncias na imagem de ressonância magnética foram calculadas.</li>
	<li>Remova o ponteiro e mova o posicionador para as coordenadas medial/lateral e as coordenadas rostral/caudal. Levante o posicionador pressionando o botão até 50 para permitir a colocação do banho de água e do gel de ultrassom. Se a parte superior da viagem do eixo Z for atingida, o local de anulação será invalidado. A coordenada dorsal/ventral será definida após a adição do transdutor.</li>
	<li>Aplique gel de ultrassom no couro cabeludo do animal e coloque o banho de água sobre o animal com a janela de fita poliimida pressionada sobre o gel. Certifique-se de que não há bolhas de ar no gel de ultrassom.</li>
	<li>Encha o banho de água com água desgaseada.</li>
	<li>Se usar o transdutor de alta potência, baixe o posicionador para que o ímã fique logo acima da água. Conecte o transdutor ao posicionador baixando cuidadosamente o transdutor na água em um ângulo para evitar que bolhas de ar fiquem presas sob o rosto e conectem os ímãs.</li>
	<li>Se usar o transdutor de imersão de baixa potência, baixe o posicionador na água logo acima do clipe do transdutor. Em seguida, corte o transdutor no lugar, baixando-o lentamente na água em um ângulo para evitar que bolhas de ar fiquem presas sob o rosto. NOTA: Um banho transparente é útil ao olhar sob a face do transdutor para bolhas.</li>
	<li>Abaixe o posicionador para a coordenada dorsal/ventral.</li>
	<li>Ligue o amplificador de energia RF.</li>
	<li>Injete 1 mL/kg de corante azul Evans (EBD) colocando a ponta da agulha no plugue do cateter e injetando. Deixe circular por 5 minutos.</li>
	<li>Ative os microbolhas sacudindo-os violentamente com o agitador de bolhas.<ol>
<li>Prepare 5x a dose de 30 μL/kg de microbolhas (bolha conc. 1,2 x 1010/mL) em 0,2 mL de soro fisiológico para explicar os 2 tratamentos de FUS e a tubulação no conjunto de infusão alado 18 G. Por exemplo, se o rato pesa 200 g, então encha a seringa contendo ponta de agulha de 18 G com 30 μL de microbolhas em 1 mL de soro fisiológico. NOTA: Certifique-se de usar pontas de agulha de 18 G para até pegar e injetar com o conjunto de infusão alado.</li>
		<li>Inverta a seringa várias vezes para obter uma distribuição uniforme de microbolhas. Em seguida, anexe e encha o conjunto de infusão alado. Posicione a seringa na bomba de infusão e ajuste a bomba de infusão para entregar 0,2 mL a uma taxa de 6 mL/h. Isso fornecerá uma infusão lenta dos microbolhas sobre a exposição de FUS de 2 minutos.</li>
		<li>Insira a agulha alada no plugue do cateter.</li>
	</ol></li>
	<li>Primeiro, execute a bomba de infusão, espere 3 s e inicie o tratamento de FUS pressionando o botão de habilitação de saída no gerador de função (rotulado "nogerador de função na Tabela de Materiais). Repita essas duas vezes por região com 5 minutos entre elas para permitir que as microbolhas se limpem.<ol>
<li>Pressione o botão on novamente no gerador de função para parar o tratamento de FUS quando a bomba de infusão parar em 2 min.</li>
		<li>Espere 5 min para as microbolhas limparem. Em seguida, inicie a infusão e o segundo tratamento de FUS.</li>
		<li>Imediatamente após o segundo tratamento de FUS, injete contraste de gadobutrol (se estiver usando ressonância magnética) e o agente de interesse, por exemplo, partículas virais. O volume total entregue de todos os agentes não deve exceder 5 mL/kg. NOTA: O tempo de entrega (por exemplo, antes ou depois da abertura do FUS BBB) do agente de interesse pode diferir dependendo do agente utilizado.</li>
	</ol></li>
	<li>Desligue o amplificador de energia RF e transporte imediatamente o animal de volta para a ressonância magnética.</li>
</ol>5. Confirmação de ressonância magnética da abertura do BBB
<ol><li>Se a ressonância magnética não estiver disponível, pule para a seção 6 e use a expressão EBD para confirmação da abertura do BBB.</li>
	<li>Coloque o animal de volta no leito de ressonância magnética exatamente no mesmo local que na etapa 3.7 e conecte a linha de anestesia.</li>
	<li>Colete os postes de ressonância magnética com os mesmos parâmetros de imagem utilizados na etapa 3.7 para visualizar o aprimoramento da ressonância magnética gadobutrol na região de abertura do BBB (Figura 3b,e).</li>
</ol>6. Perfusão e coleta de tecidos
<ol><li>Perfunda o animal com formalina fria de 4% até que o sangue se esclae completamente.</li>
	<li>Remova o cérebro e coloque em 4% de formalina ou PFA a 4 °C durante a noite. Em seguida, coloque o cérebro em 30% de solução de sacarose até que o cérebro afunde (cerca de 2-3 dias). Finalmente, o flash congele em nitrogênio líquido ou em gelo seco e armazene a -80°C até que se cryosectioning.</li>
	<li>Congele o cérebro em OUTUBRO e faça criosections.</li>
	<li>Corrigir e cobrir seções de deslizamento para microscopia de fluorescência. A excitação do EBD atinge picos de excitação de 470 e 540 nm e picos de emissões a 680 nm. Tampar com meio de montagem DAPI para visualizar morfologia celular global.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui descrevemos uma abordagem benchtop para microbolhas assistida fus bbb abertura com abordagens alternativas, incluindo, dois transdutores diferentes e métodos para direcionamento intracraniano com e sem orientação de ressonância magnética. Atualmente, para estabelecer a abertura do FUS BBB guiado por RESSONÂNCIA Magnética no laboratório, há a opção de comprar excelentes dispositivos prontos para uso que fornecem resultados altamente padronizados e reprodutíveis com interfaces fáceis de usar. No entanto, ...

Apesar das muitas descobertas na neurociência básica, o número de tratamentos emergentes para distúrbios neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativos permanece relativamente limitado1,2. Uma compreensão mais profunda dos genes, moléculas e circuitos celulares envolvidos em distúrbios neurológicos tem sugerido tratamentos promissores irrealizáveis em humanos com técnicas atuais3. Tratamentos eficazes são muitas vezes limitados pela necessidade de ser penetrável cerebral e específico do local4,5,6,7,8. No entanto, os métodos existentes de entrega de medicamentos localizados para regiões cerebrais específicas (por exemplo, entrega via injeção ou cânula) são invasivos e requerem uma abertura a ser feita no crânio9. A invasividade desta cirurgia impede o uso rotineiro do parto localizado no cérebro humano. Além disso, os danos teciduais e as respostas inflamatórias resultantes são confundimentos onipresentes para estudos básicos e pré-clínicos que dependem da injeção intracerebral10. A capacidade de fornecer agentes não invasivamente através da barreira cerebral sanguínea (BBB) e direcioná-los para regiões cerebrais específicas pode ter um tremendo impacto nos tratamentos para distúrbios neurológicos, ao mesmo tempo em que fornece uma poderosa ferramenta investigativa para pesquisas pré-clínicas.
Um método de transporte direcionado através do BBB com dano mínimo de tecido é o ultrassom focado transcranário (ME) juntamente com microbolhas para abrir o BBB11,12,13,14,15,16. A abertura do FUS BBB ganhou atenção recente para o tratamento de distúrbios neurodegenerativas, derrame e glioma, localizando terapêuticas para atingir regiões cerebrais como fatores neurotróficos17,18,19, terapias genéticas20,21,22, anticorpos23, neurotransmissores24, e nanopartículas25,26,27,28,29. Com sua ampla gama de aplicações e sua natureza não invasiva30,31, a abertura do FUS BBB é uma alternativa ideal para injeções intracranianas estereotaxas rotineiras. Além disso, devido ao seu uso atual em humanos30,32, investigações pré-clínicas usando essa técnica podem ser consideradas altamente translacionais. No entanto, a abertura do FUS BBB ainda não foi uma técnica amplamente estabelecida em ciência básica e pesquisa pré-científica devido à falta de acessibilidade. Por isso, fornecemos um protocolo detalhado para uma abordagem de bancada para a abertura do FUS BBB como ponto de partida para laboratórios interessados em estabelecer essa técnica.
Estes estudos foram conduzidos com um transdutor de ultrassom específico de ar apoiado por ar de alta potência ou um transdutor de imersão ultrassônica de baixa potência. Os transdutores foram conduzidos por um amplificador de energia RF projetado para cargas reativas e um gerador de função de bancada padrão. Os detalhes para esses itens podem ser encontrados na Tabela de Materiais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1437px;" width="1437">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Bubble shaker</td>
			<td style="width:240px;">Lantheus Medical Imaging</td>
			<td style="width:197px;">VMIX</td>
			<td style="width:729px;">VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Catheter plug/ Injection cap</td>
			<td>SAI infusion technologies</td>
			<td>Part Number: IC</td>
			<td style="width:729px;">Catheter plug/ Injection cap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Evans blue dye</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">E2129-10G</td>
			<td style="width:729px;">Evans blue dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Function generator</td>
			<td style="width:240px;">Tektronix</td>
			<td style="width:197px;">AFG3022B</td>
			<td>Dual channel, 250MS/s, 25MHz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FUS transducer, 1.1MHz</td>
			<td style="width:240px;">FUS Instruments</td>
			<td>TX-110</td>
			<td>1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Heating pad for Mice and Rats</td>
			<td style="width:240px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:197px;">PS-03</td>
			<td>Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Infusion pump</td>
			<td style="width:240px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:197px;">780100</td>
			<td>KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Kapton tape</td>
			<td style="width:240px;">Gizmo Dorks</td>
			<td>https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ 
			ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91</td>
			<td>Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low power immersion transducer, 1MHz</td>
			<td style="width:240px;">Olympus</td>
			<td>V303-SU</td>
			<td>Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Magnet sets</td>
			<td style="width:240px;">WINOMO</td>
			<td>https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ 
			ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC</td>
			<td>WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RF amplifier</td>
			<td style="width:240px;">E&#38;I</td>
			<td style="width:197px;">A075</td>
			<td>75W</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Tail vein catheter</td>
			<td style="width:240px;">BD</td>
			<td>382512/ Fisher Item: NC1228513</td>
			<td>24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ultrasound contrast microbubbles</td>
			<td>Lantheus Medical Imaging</td>
			<td style="width:197px;">DE4, DE16</td>
			<td>DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:240px;">Aquasonic</td>
			<td>https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ 
			ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P</td>
			<td>Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Winged infusion sets, 22ga.</td>
			<td style="width:240px;">Fisher Healthcare</td>
			<td>22-258087</td>
			<td>Terumo Surflo Winged Infusion Sets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">motor controller software</td>
			<td style="width:240px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:729px;">custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">runtime environment for the motor controller software</td>
			<td style="width:240px;">National Instruments</td>
			<td>LabView runtime engine version 2017 or better</td>
			<td>https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner)</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bolts</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MB-1</td>
			<td>BiSlide Bolt 1/4-20x3/4&#34; Socket cap screw (10 pack), Qty:3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">motor controller</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>VXM-3</td>
			<td style="width:729px;">Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mounting cleats</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MC-2</td>
			<td>Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mounting cleats</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MC-2</td>
			<td style="width:729px;">Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">usb to serial converter</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>VXM-USB-RS232</td>
			<td style="width:729px;">USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">x-axis linear stage</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MN10-0100-M02-21</td>
			<td style="width:729px;">BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">x-axis stepper motor</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>PK266-03A-P1</td>
			<td>Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">y-axis linear stage</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MN10-0100-M02-21</td>
			<td>BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">y-axis stepper motor</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>PK266-03A-P1</td>
			<td style="width:729px;">Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">z-axis damper</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>D6CL-6.3F</td>
			<td style="width:729px;">D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">z-axis linear stage</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MN10-0100-M02-21</td>
			<td style="width:729px;">BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">z-axis stepper motor</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>PK266-03B-P2</td>
			<td style="width:729px;">Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">3D printable files</td>
			<td style="width:240px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Immersion transducer mount and pointer</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stereotaxic frame</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stereotaxic frame holder</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">9.4T small bore animal MRI</td>
			<td style="width:240px;">Bruker</td>
			<td style="width:197px;">Bruker BioSpec 94/20</td>
			<td>ParaVision version 5.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">AAV9-hsyn-GFP</td>
			<td style="width:240px;">Addgene</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Cream hair remover</td>
			<td style="width:240px;">Church &#38; Dwight</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>Nair cream</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">gadobutrol MRI contrast agent</td>
			<td style="width:240px;">Bayer</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stereotactic frame</td>
			<td style="width:240px;">Stoelting</td>
			<td style="width:197px;">#51500</td>
			<td>not MRI compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">turnkey FUS delivery device</td>
			<td style="width:240px;">FUS Instruments</td>
			<td style="width:197px;">RK-300</td>
			<td style="width:729px;">ready to use MRI compatible FUS for rodents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a benchtop approach to the location specific blood brain barrier opening using focused ultrasound in a rat model

Cirurgia estereotaxica é o padrão ouro para a droga localizada e a entrega de genes para o cérebro de roedores. Essa técnica tem muitas vantagens sobre a entrega sistêmica, incluindo localização precisa para uma região cerebral alvo e redução de efeitos colaterais fora do alvo. No entanto, a cirurgia estereotaxa é altamente invasiva, o que limita sua eficácia translacional, requer longos tempos de recuperação e oferece desafios ao atingir múltiplas regiões cerebrais. O ultrassom focado (FUS) pode ser usado em combinação com microbolhas circulantes para abrir transitoriamente a barreira cerebral do sangue (BBB) em regiões de tamanho milímetro. Isso permite a localização intracraniana de agentes entregues sistematicamente que normalmente não conseguem atravessar o BBB. Esta técnica fornece uma alternativa não invasiva à cirurgia estereotaxa. No entanto, até o momento, essa técnica ainda não foi amplamente adotada em laboratórios de neurociência devido ao acesso limitado a equipamentos e métodos padronizados. O objetivo geral deste protocolo é fornecer uma abordagem de bancada para a abertura do FUS BBB (BBBO) que seja acessível e reproduzível e, portanto, possa ser facilmente adotada por qualquer laboratório.

Aqui, demonstramos que o ultrassom focado com microbolhas pode induzir abertura de BBB localizada utilizando os parâmetros especificados acima com o transdutor de imersão de baixa potência(Figura 3) e o transdutor FUS(Figura 4). Primeiro, em experimentos iniciais, o transdutor de imersão de baixa potência foi direcionado para um hemisfério cerebral anterior(Figura 3b) ou medial(Figura 3a). Os anim...

Watch this Scientific Journal Video about A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model at JoVE.com

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Ultrassom focado com agentes de microbolhas pode abrir a barreira cerebral sanguínea de forma focal e transitória. Esta técnica tem sido usada para fornecer uma ampla gama de agentes através da barreira cerebral do sangue. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a entrega localizada ao cérebro de roedores com ou sem orientação de ressonância magnética.

Uma abordagem benchtop para a abertura da barreira cerebral de sangue específica do local usando ultrassom focado em um modelo de rato

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

a-benchtop-approach-to-location-specific-blood-brain-barrier-opening

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.5K visualizações.  University of Alabama at Birmingham. Ultrassom focado com agentes de microbolhas pode abrir a barreira cerebral sanguínea de forma focal e transitória. Esta técnica tem sido usada para fornecer uma ampla gama de agentes através da barreira cerebral do sangue. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a entrega localizada ao cérebro de roedores com ou sem orientação de ressonância magnética.

Vídeo: A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Neurociência

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

Cirurgia estereotáxica para lesão excitotóxica de áreas específicas do cérebro do rato adulto

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Uma abordagem alternativa para estudar eventos primários na neurodegeneração usando fatias de cérebro de rato Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

Um modelo de Interface de sangue-cérebro humano para estudar os cruzamentos de barreira por agentes patogénicos ou medicamentos e suas interações com o cérebro

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

Um sistema de neuronação estereática guiada por imagem de alta produtividade e sistema de ultrassom focado para abertura de barreira hemencefálica em roedores

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Abertura da Barreira Hematoencefálica Induzida por Ultrassom Focalizado para Atingir Estruturas Cerebrais e Avaliar a Neuromodulação Quimiogenética

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase uptake of antibodies and engagement through transient opening of the blood-brain barrier (BBB). In our laboratory, we are developing therapeutic approaches for neurodegenerative diseases in which an antibody in various formats is delivered across the BBB using microbubbles, concomitant with focused ultrasound application through the skull targeting multiple spots, an approach we refer to as scanning ultrasound (SUS). The mechanical effects of microbubbles and ultrasound on blood vessels increases paracellular transport across the BBB by transiently separating tight junctions and enhances vesicle- mediated transcytosis, allowing antibodies and therapeutic agents to effectively cross. Moreover, ultrasound also facilitates the uptake of antibodies from the interstitial brain into brain cells such as neurons where the antibody distributes throughout the cell body and even into neuritic processes. In our studies, fluorescently labeled antibodies are prepared, mixed with in-house prepared lipid-based microbubbles and injected into mice immediately before SUS is applied to the brain. The increased antibody concentration in the brain is then quantified. To account for alterations in normal brain homeostasis, microglial phagocytosis can be used as a cellular marker. The generated data suggest that ultrasound delivery of antibodies is an attractive approach to treat neurodegenerative diseases.

Presented here is a protocol to transiently open the blood-brain barrier (BBB) either focally or throughout a mouse brain to deliver fluorescently-labeled antibodies and activate microglia. Also presented is a method to detect the delivery of antibodies and microglia activation by histology.

Entrega de anticorpos no cérebro usando ultrassom de varredura focalizado

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. Establishment of the EcoHIV infected rat model for studies of drug abuse and neurocognitive disorders, would be beneficial in the study of neuroHIV and HIV-1 associated neurocognitive disorders (HAND). In the present study, we demonstrate the successful creation of a rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV). First, the lentiviral construct of EcoHIV was packaged in cultured 293 FT cells for 48 hours. Then, the conditional medium was concentrated and titered. Next, we performed bilateral stereotaxic injections of the EcoHIV-EGFP into F344/N rat brain tissue. One week after infection, EGFP fluorescence signals were detected in the infected brain tissue, indicating that EcoHIV successfully induces an active HIV infection in rats. In addition, immunostaining for the microglial cell marker, Iba1, was performed. The results indicated that microglia were the predominant cell type harboring EcoHIV. Furthermore, EcoHIV rats exhibited alterations in temporal processing, a potential underlying neurobehavioral mechanism of HAND as well as synaptic dysfunction eight weeks after infection. Collectively, the present study extends the EcoHIV model of HIV-1 infection to the rat offering a valuable biological system to study HIV-1 viral reservoirs in the brain as well as HAND and associated comorbidities such as drug abuse.

Here, we present a protocol to establish a new rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV), which is critical for enhancing our understanding of HIV-1 viral reservoirs in the brain and offering a system to study HIV-associated neurocognitive disorders and associated comorbidities (i.e., drug abuse).

Um modelo de rato de infecção cerebral ecohiv

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Um modelo 3D de barreira hematoencefálica derivado de células-tronco pluripotentes humanas

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

Autor em destaque: uma abordagem personalizada para investigar a doença de Alzheimer usando um modelo de barreira hematoencefálica in vitro 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...