Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü tarafından K22AI134677 Ödül Numarası altında desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Araştırmacılar, uygun hayvan bakım ve kullanım komitelerinden tüm hayvan deneyleri için onay almalıdır. Bu makalede gösterilen temsili veriler, Clemson Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (AUP2018-070, AUP2019-012) tarafından onaylanan protokoller kapsamında yapılan deneylerden elde edilmektedir.
1. Aspergillus sporlarının enjeksiyon için hazırlanması
<ol><li>Aspergillus spor süspansiyonundan, 1 x 106 spor elde etmek için gereken hacmi hesaplayın. Hacim 20–100 μL olmalıdır; değilse, % 0.01 (v/ v) steril Ara-20'de (Ara su) 10x seyreltme üretin; Malzeme Masası). Örneğin, hesaplanan hacim 5 μL ise, 10x seyreltme üretin ve seyreltilmiş çözeltinin 50 μL'sini kullanın. NOT: Daha fazla spor toplamak için veya kontaminasyon durumunda yedek olarak iki plaka/ suş hazırlanabilir.</li>
	<li>Biyogüvenlik kabininde steril tek kullanımlık L şeklinde bir serpici ile bir glikoz minimal ortam (GMM) plakasına(Malzeme Masası)1 x10 6Aspergillus sporları sürün. Plakanın kenar boşluğuna yayılmaktan kaçının. Plaka baş aşağı bakacak şekilde 3-4 gün boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslayın.</li>
	<li>Toplama gününde, steril miracloth ve 50 mL konik tüpler (suş başına iki), taze steril Ara su şişeleri (suş başına bir) ve steril tek kullanımlık L şeklindeki serpicileri biyogüvenlik kabinine getirin. NOT: Miracloth parçalar halinde ~8 x 6'da kesilebilir, folyoya sarılabilir ve sterilize etmek için otoklavlanabilir.</li>
	<li>Etiketli her 50 mL konik tüpe bir parça miracloth yerleştirin ve yeniden kaplanın. Kalan miracloth paketini kaputtan çıkar.</li>
	<li>Plakaları biyogüvenlik kabinine getirin. Bir tabak açın, sonra tabağın yaklaşık dörtte üçünü kaplayacak şekilde üzerine Ara suyu dökün.</li>
	<li>Tek kullanımlık L şeklinde bir serpme kullanarak, mantar kültürünün yüzeyini ileri geri hareketle hafifçe kazıyın, diğer el ile plakayı döndürün. Neredeyse tüm sporlar ara suya homojenize olana kadar kazıyın. NOT: Yüksek hidrofobiklik nedeniyle, ara su eklendiğinde veya kazıma sırasında sporlar "puflar" oluşturabilir. Yakındaki tüplerin veya plakaların kirlenmesini önlemek için büyük özen verilmelidir. Eldivenlerin değiştirilmesi ve farklı suşların ekstraksiyonu arasında% 70 etanol ile yüzeyden silinmeleri önerilir.</li>
	<li>Bir adet 50 mL konik tüp alın ve miracloth parçasını çıkarın. İkiye katlayın ve 50 mL konik tüpün üstüne yerleştirilmiş bir filtre haline getirin.</li>
	<li>Mantar homojenatını plakadan miracloth'un üzerine tüpe dökün. NOT: Bir suşun iki plakası hazırlanırsa, her iki plakayı da kazıyın ve aynı konik tüpe dökün.</li>
	<li>Konik tüpteki toplam hacmi 50 mL'ye çıkarmak için ara su dökün.</li>
	<li>10 dakika boyunca 900 x g'da döndürün. Santrifüjde aerosolizasyon önleyici kapaklar kullandığınızdan emin olun.</li>
	<li>Arındırmak için süpernatantı ~% 10 çamaşır suyu çözeltisine dökün. Konik tüpe 50 mL steril 1x PBS dökün, ardından peleti yeniden çıkarmak için girdap veya sallama.</li>
	<li>10 dakika boyunca 900 x g'da tekrar döndürün. Süpernatant dökün ve peleti 5 mL steril 1x PBS'de yeniden diritin. Taze bir miracloth parçasından 50 mL'lik yeni bir konik tüpe filtreleyin.</li>
	<li>Mantar homojenliğinin 10 kat seri seyreltmelerini (10x, 100x, 1000x) 1,7 mL santrifüj tüplerinde yapın (örneğin, 10x çözeltisi için, mantar homojenliğinin 100 μL'sini 900 μL Ara su ile karıştırın).</li>
	<li>Ara suya boşaltıldığında sporların görünmediği ilk seyreltmeyi seçin ve hemositometre kullanarak spor sayısını saymak için bu seyreltmeyi kullanın.</li>
	<li>Aşağıdaki formülü kullanarak hazırlanan mantar homojenatındaki (su süspansiyonu) spor konsantrasyonu hesaplayın: Konsantrasyon (sporlar/mL) = Ortadaki spor sayısı 25 kutu x seyreltme faktörü x 104</li>
	<li>Steril 1x PBS'de 1,7 mL mikrosantrifüj tüpünde 1,5 x 108 spor/mL'lik 1 mL'lik bir stok hazırlayın. Bu spor hazırlığı ~ 4 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.</li>
	<li>Enjeksiyonlarda kullanılmadan önce, 1 x 108 spor/ mL'lik son bir spor konsantrasyonu elde etmek için 20 μL spor preparatını 1.7 mL santrifüj tüpünde% 1 steril fenol kırmızısının 10 μL'si ile karıştırın. Enjeksiyondan önce iyice girdap. NOT: %1 fenol kırmızı çözelti filtre sterilize edilmeli ve aliquotlarda saklanmalıdır.</li>
	<li>Sahte bir enjeksiyon için, 20 μL 1x PBS'yi 10 μL% 1 steril fenol kırmızısı ile karıştırın.</li>
</ol>2. Enjeksiyon için agar plakalarının hazırlanması
<ol><li>E3 ortamında% 2 agarose hazırlayın ve bir mikrodalgada eritin.</li>
	<li>100 mm x 15 mm Petri kabına (plaka başına ~ 25 mL) dökün, plakayı eşit şekilde örtmek için döndürün ve soğumaya bırakın.</li>
	<li>Plakayı parafin filmi ile sarın ve 4 °C'de ters olarak saklayın.</li>
	<li>Enjeksiyondan önce plakayı oda sıcaklığına (RT) getirin.</li>
	<li>Plakaya ~1 mL filtre sterilize edilmiş %2 sığır serum albümini (BSA) dökün, tüm tabanı yaymak ve örtmek için plakayı eğin ve E3 ile durulayın. NOT: %2 BSA çözeltisi filtre sterilize edilebilir ve -20 °C'de 1 mL aliquots olarak saklanabilir% 2 BSA ön işlem larvaların agarose yüzeyine yapışmasını önler.</li>
	<li>Plakaya tamponlu trikain ile E3 dökün ve enjeksiyona kadar bekletin.</li>
</ol>3. Zebra balığı larva arka beyin ventrikül mikroenjeksiyon
<ol><li>Bir Petri kabında 2 dpf'de yaban arıları ile larvaları manuel olarak kaynatır. NOT: Dekonsiyon 1,5 dpf'den enjeksiyon zamanına kadar her zaman yapılabilir.</li>
	<li>Petri kabından mümkün olduğunca çok E3 çıkarın ve larvaları uyuşturmak için E3'te tamponlanmış 300 μg / mL trikain ekleyin. NOT: E3'te tamponlanmış 4 mg/mL trikain stok çözeltisi hazırlanabilir ve 4 °C'de saklanabilir. Çalışma çözeltisi, stok çözeltisinin 4 mL'si E3 ile 50 mL'ye kadar seyreltilerek yapılabilir.</li>
	<li>Basınç enjektörü, sırt basınç ünitesi, ayak ispiyoncu, mikropipet tutucu, mikromanipülatör ve manyetik bir stand ve plaka ile birlikte verilen bir mikroenjeksiyon kurulumu kullanın, hepsi basınçlı hava kaynağına(Malzeme Tablası)bağlı.</li>
	<li>Basınçlı hava vanasını açın ve mikroenjektörü açın. Basıncı ~25 PSI, darbe süresini 60 ms ve geri basınç ünitesini 1 PSI olarak ayarlayın.</li>
	<li>Yaklaşık 3-5 μL hazırlanmış PBS veya fenol kırmızısı spor süspansiyonlu bir mikro doldurucu pipet ucu(Malzeme Masası)kullanarak bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin. İğneyi mikromanipülatöre monte edin. NOT: Mikroenjeksiyon iğneleri daha önce açıklandığı gibi hazırlanabilir23. Mikroenjeksiyonlar için kullanılan stereo mikroskop, mikroenjeksiyon iğnesini kalibre etmek için bir göz parçası retiküline sahip olmalıdır. Retikül bir kademeli mikrometre ile kalibre edilmeli ve retikül ölçeğinin (μm) uzunluğu belirlenmelidir. İğneden fırlayan spor süspansiyon damlasının çapı, damla ile örtüşen hash sayısına (retikülün) bağlı olarak ölçülür.</li>
	<li>Mikromanipülatörü, iğnenin ucu stereo mikroskop altında en düşük büyütmede görüntülensin diye konumlandırın. İğneyi görünümde tutarak 4x büyütmeye yakınlaştırın.</li>
	<li>Keskin tokalar kullanarak iğnenin ucını kırpın. Çıkan damlacık boyutunu görselleştirmek için enjeksiyon pedalı tuşuna basın. ~3 nL spor süspansiyonu enjekte edilene kadar kırpmaya devam edin (burada, bu beş hashes' tir).</li>
	<li>Larvalar enjeksiyon plakasına düzenlenirken yanlışlıkla iğneye çarpmamak için mikromanipülatör ve iğneyi yoldan çıkar.</li>
	<li>Enjeksiyon plakasından E3-Tricaine dökün, ardından ~24 anestezi edilmiş larvayı bir transfer pipet kullanarak mümkün olduğunca az E3 ile enjeksiyon plakasına aktarın.</li>
	<li>Zebra balığı larvalarını (yani saç döngü aracını veya kirpik aracını) manipüle etmek için küçük bir araç kullanarak larvaları karşı karşıya oldukları yöne göre düzenleyin. Özellikle, tüm sağa bir satırda ve hepsi aşağıda bir satırda sola bakacak şekilde yerleştirin. NOT: Larvalar yer dışında "yüzeceğinden" plakada çok fazla sıvı varsa bu düzenleme zordur. Bununla birlikte, larvalar kuruyabileceği veya anestezi yıpranabileceği için enjeksiyonlar uzun sürerse çok az sıvı da sorunludur. Bu nedenle, tüm mikroenjeksiyon işlemi boyunca plakadaki sıvı miktarına dikkat edilmelidir.</li>
	<li>Mikroskop yakınlaştırmasını en düşük büyütmeye ayarlayın. Mikromanipülatörü geri getirin ve iğnenin larvalara yakın olacak şekilde, görüş alanının ortasında ~ 30 ° - 60 ° açıyla düzenleyin.</li>
	<li>En yüksek büyütmeye yakınlaştırın ve iğnenin konumunu daha fazla ayarlamak için ince ayar düğmelerini kullanın. Spor süspansiyonu larvaların yanındaki plakadaki sıvıya enjekte ederek iğneden ~30-70 spor çıktığını doğrulayın. Gerekirse enjeksiyon kurulumundaki zamanı ve basıncı ayarlayın. NOT: İğneden çıkan spor sayısı zamanla artabileceğinden veya azalabileceğinden, bu test her beş ila altı larvadan sonra tekrarlanmalıdır.</li>
	<li>Larvaların iğneye doğru yöneldiği satırdan başlayarak, plakayı iğnenin doğrudan üstünde olacak ve ilk larvaların yanına yer olacak şekilde hareket ettinin.</li>
	<li>İğneyi mikromanipülatörle hareket ettirerek, iğneyi otik vezikülün etrafındaki dokudan geçirerek arka beyin ventrikülüne delin. İğne açısıyla larvaların doğru yönünü elde etmek için plakayı gerektiği gibi diğer elinizle hareket ettirin.</li>
	<li>İğnenin ucunun arka beyin ventrikülünün merkezinde olduğunu görsel olarak doğrulayın, spor enjekte etmek için ayak pedalını basın ve iğneyi hafifçe geri çekin. NOT: Fenol kırmızı boyası öncelikle arka beyin ventrikül içinde kalmalıdır. Küçük bir miktar orta beyine gidebilir, ancak beyine veya beynin dışına ulaşmamalıdır. Varsa, enjekte edilen hacim çok büyüktür ve basınç ve zaman buna göre azaltılmalıdır veya yeni bir iğne kalibre edilmelidir.</li>
	<li>Plakadan aşağı inerken, o sıradaki tüm larvaları enjekte edin. Ardından, plakayı çevirin ve diğer sıradaki tüm larvaları enjekte edin. NOT: Başarısız bir şekilde enjekte edilen veya yanlışlıkla hasar gören larvalar 1) kırmızı bir işaret oluşturmak için yumurta sarısına birkaç kez enjekte edilmesi veya 2) larvayı iğne ile sıranın dışına sürüklemesi ile işaretlenebilir.</li>
	<li>İğneyi tekrar yukarı ve yoldan çek. Mikroskopta daha düşük bir büyütmeye uzaklaştırın. Fenol kırmızı boyası her larvanın arka beyinlerinde hala görülebilir olmalıdır.</li>
	<li>İlk olarak, herhangi bir larvayı başarısız enjeksiyonlarla atmak için saç halkası aracı ve pipetle çekin. Kalan larvaları taze steril E3 ve transfer pipet ile tabaktan yıkayarak yeni bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>İstenilen son deneysel numune numarası için gerektiği gibi tekrarlayın.</li>
	<li>Larvaları E3 ile en az 2 kat durulayın ve anesteziden iyileşmeyi sağlayın.</li>
	<li>Başka bir tedavi olmadan sağkalım miktarını ölçmek için, bir transfer pipet kullanarak larvaları E3'te 96 kuyu plakasına (kuyu başına 1 larva) aktarın.</li>
</ol>4. Enjekte edilmiş ve uygulanabilir spor numaralarının oluşturulması
<ol><li>Enjeksiyondan hemen sonra, bir transfer pipet kullanarak, enjekte edilen larvalardan yaklaşık sekizini rastgele toplayın ve 1,7 mL santrifüj tüplerine (tüp başına bir larva) aktarın.</li>
	<li>Larvaları trikain ile veya 0,5-2,0 saat boyunca 4 °C'ye yerleştirerek ötenazi.</li>
	<li>Steril 1x PBS'de 1 mL 1 mg/mL ampisilin ve 0,5 mg/mL kanamycin antibiyotik çözeltileri hazırlayın. Kalan çözelti 4 °C'de saklanabilir ve daha sonra kullanılabilir. NOT: Ampisilin stok çözeltileri 100 mg/mL ve kanamycin 50 mg/mL önceden yapılabilir, filtre sterilize edilebilir ve -20 °C'de aliquotlarda saklanabilir. Çalışma çözeltisini elde etmek için bu 100x'i 1x PBS'de seyreltin.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak, santrifüj tüpünden mümkün olduğunca fazla sıvı çıkarın, larvayı geride bırakın ve antibiyotiklerle 1x PBS'nin 90 μL'sini ekleyin. NOT: Antibiyotikler, ASPERGILLUS kolonilerinin sayımını engelleyebilecek GMM plakalarında bakteri üremesini önlemek için kullanılır.</li>
	<li>Larvaları 6 dakika boyunca 1.800 salınım/ dak (30 Hz) bir doku liköründe homojenize edin. 30 sn için 17.000 x g'da geri dön.</li>
	<li>Etiket GMM plakaları (homojenize larva başına bir plaka). Steril bir ortam oluşturmak için bir Bunsen brülörü kullanarak, homojenize süspansiyonu bir tüpten GMM plakasının ortasına pipetledi, ardından tek kullanımlık L şeklinde bir serpme aracı kullanarak yayıldı. Homojenatı janta yaymaktan kaçının.</li>
	<li>Plakaları 2-3 gün boyunca 37 °C'de baş aşağı kuluçkaya yatırın ve oluşan koloni sayısını (CFU) sayın.</li>
	<li>Enfeksiyon döneminde canlı spor sayısını ölçmek için, enjeksiyondan (dpi) sonra 1-7 gün içinde 96 kuyu plakasından larvaları toplayın ve santrifüj tüplerine aktarın. 4.1–4.5 adımlarında açıklandığı gibi, GMM plakalarında yayılmak için larvaları ötenazi ve homojenize edin.</li>
</ol>5. Enjekte edilen larvaların ilaç tedavisi
<ol><li>Bölüm 4'den sonra, kalan enjekte edilen larvaları iki 3,5 mm'lik yemeklere bölün: biri ilaç tedavisi ve diğeri kontrol için. Durum başına yaklaşık 24 enfekte larva kullanın. NOT: 3,5 mm'lik yemekler suda% 2 yağsız kuru sütle tedavi edilebilir, durulanabilir, havayla kurutulabilir ve önceden RT'de saklanabilir. Sütle kaplama, larvaların plastiğe yapışmasını önleyecektir.</li>
	<li>İstenilen ilaç solüsyonunu ve aracı E3'te konik tüplerde metilen mavisi olmadan gerekli son konsantrasyona göre hazırlayın, ardından iyice karıştırın. Örneğin, deksametazonlara maruz kalan larvaların hayatta kalmasını izlemek için, deksametazon için 24 larva (çoğalır) ve DMSO gibi araç kontrolü için 24 larva kullanın. İlaç çözeltisinin 5 mL'sini gerekli konsantrasyonda hazırlayın. Burada% 0.1 DMSO'nun 5 mL'si ve 10 μM deksametazon kullanıldı ve 24 larva / durum araç / ilaç çözeltisinin / larvalarının ~ 200 μL'sine aktarıldı.</li>
	<li>Transfer pipeti ile bir tabaktan mümkün olduğunca fazla sıvı çıkarın ve araç kontrolü içeren önceden karıştırılmış E3 ekleyin. Diğer yemek için ilginin tedavisini içeren önceden karıştırılmış E3 ile tekrarlayın.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak larvaları 96 kuyu plakasına (kuyu başına bir larva) aktarın. Araca veya ilaca maruz kalan enjekte edilmiş larvaların hayatta kalmasını 7 gün boyunca izleyin. NOT: İlaç sadece enfeksiyon gününde uygulanabilir ve tüm deney için larvalarda tutulabilir veya günlük olarak yenilenebilir.</li>
</ol>6. Zebra balığı Büyüme ve Görüntüleme için Yaralama ve Tuzak Cihazı (zWEDGI) kullanılarak enfekte larvaların günlük görüntülenmesi
<ol><li>Pigmentasyonu önlemek için larvaların 24 hpf'de 100 μM N-feniltilthiourea (PTU) ile tedavi edildiğinden ve PTU'nun tüm deney için larvalarda tutulduğundan emin olun. NOT: 75–100 μM'deki PTU, herhangi bir brüt gelişimsel kusur olmadan larvaların pigmentasyonunu önler24. Bununla birlikte, PTU bazı biyolojik süreçlere müdahale edebilir25ve araştırmacılar ilacın incelenecek herhangi bir süreci etkileyip etkileyemeyeceğine önceden karar vermelidir.</li>
	<li>Transgenik larvaları, bölüm 3'te açıklandığı gibi floresan bir proteini ifade etmek için tasarlanmış Aspergillus sporları ile 2 dpf'de etiketli hücre popülasyonlarıyla enfekte edin. Daha sonra, enfekte olmuş larvaları metilen mavisi olmadan yaklaşık 500 μL / kuyu E3'te 48 kuyu plakasının kuyularına aktarın. NOT: Burada 48 kuyu plakası kullanılır, çünkü tekrarlanan günlük görüntüleme sırasında larvaları içine ve dışına aktarmak daha kolaydır.</li>
	<li>Görüntüleme gününde, iki adet 3,5 mm Petri kabı hazırlayın: biri 100 μM PTU ve diğeri E3-trikaine ile.</li>
	<li>zWEDGI cihazının odalarına E3-tricaine ekleyin26,27. Stereo mikroskop altında, bir P100 mikropipette kullanarak odalardan ve kısıtlama kanalından hava kabarcıklarını çıkarın. Tüm fazla E3-trikaini çıkarın, böylece sadece odalarda.</li>
	<li>Bir transfer pipet kullanarak plakadan bir larva pipet. Çıkarmak için çok fazla sıvı kullanılırsa, E3-PTU içeren 3,5 mm'lik bir kabın içine pipet. Sonra, mümkün olduğunca az sıvı kullanarak tekrar pipet ve E3-tricaine aktarın.</li>
	<li>Anestezi için ~30 s bekleyin, ardından yaralama ve tuzak cihazının yükleme odasına aktarın (örneğin, zWEDGI).</li>
	<li>Stereo mikroskop altında larvayı konumlandırın. E3-trikaini yara odasından çıkarmak ve larva kuyruğunu kısıtlama kanalına taşımak için yükleme odasına bırakmak için P100 mikropipette kullanın. Larvaların yanal, dorsal veya dorso-lateral tarafına yerleştirildiğinden emin olun, böylece arka beyin ters objektif bir lensle görüntülenebilir.</li>
	<li>Konfokal mikroskop ile görüntü larva.</li>
	<li>Görüntülemeden sonra, P100 pipeti ile, larvaları kısıtlama kanalından yükleme odasına itmek için E3-trikaini yaralama odasına bırakın.</li>
	<li>Bir transfer pipet kullanarak larvayı alın ve E3-Tricaine ile Petri kabına geri aktarın. Mümkün olduğunca az sıvı kullanarak, E3-PTU ile Petri kabına aktarın. PTU'da durulayın ve 48 kuyu plakasına geri aktarın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Latge, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+and+aspergillosis.">Aspergillus fumigatus and aspergillosis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).</li><li>Denning, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+aspergillosis.">Invasive aspergillosis.</a> Clinical Infectious Diseases. 26 (4), 781-803 (1998).</li><li>Dagenais, T. R., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Aspergillus+fumigatus+in+Invasive+Aspergillosis.">Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).</li><li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+case-fatality+rate:+systematic+review+of+the+literature.">Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).</li><li>Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+animal+models+of+aspergillosis+in+studying+immunity+against+Aspergillus+infections.">Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections.</a> Journal de Mycologie M&#233;dicale. 29 (1), 84-96 (2019).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes.">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).</li><li>Behnsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+dimensionality+controls+the+interaction+of+phagocytes+with+the+pathogenic+fungi+Aspergillus+fumigatus+and+Candida+albicans.">Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 13 (2007).</li><li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Infection:+From+Pathogenesis+to+Cell+Biology.">Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li><li>Rosowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+as+a+Model+Host+for+Invasive+Fungal+Infections.">The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections.</a> Journal of Fungi. 4 (4), (2018).</li><li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo.">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System.">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).</li><li>Knox, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+phagocyte+responses+to+Aspergillus+fumigatus+conidia+and+hyphae+in+zebrafish+larvae.">Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae.</a> Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).</li><li>Rosowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+inhibit+Aspergillus+fumigatus+germination+and+neutrophil-mediated+fungal+killing.">Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing.</a> PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229 (2018).</li><li>Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+establishes+infection+in+zebrafish+by+germination+of+phagocytized+conidia,+while+Aspergillus+niger+relies+on+extracellular+germination.">Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12791 (2019).</li><li>Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-glucan-dependent+shuttling+of+conidia+from+neutrophils+to+macrophages+occurs+during+fungal+infection+establishment.">beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000113 (2019).</li><li>Herbst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis-dependent+activation+of+a+TLR9-BTK-calcineurin-NFAT+pathway+co-ordinates+innate+immunity+to+Aspergillus+fumigatus.">Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).</li><li>Shah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+Orchestrates+Lateral+Transfer+of+Aspergillus+fumigatus+during+Macrophage+Cell+Death.">Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).</li><li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selenate+sensitivity+of+a+laeA+mutant+is+restored+by+overexpression+of+the+bZIP+protein+MetR+in+Aspergillus+fumigatus.">Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus.</a> Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+Small+Molecules+Enhance+Neutrophil+Activities+Against+Aspergillus+fumigatus+in+vivo+and+in+vitro.">Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro.</a> Frontiers in Immunology. 10, 644 (2019).</li><li>Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+voriconazole+against+A.+fumigatus+infection+depends+on+host+immune+function.">Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).</li><li>Herbst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+and+clinically+relevant+murine+model+of+solid-organ+transplant+aspergillosis.">A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis.</a> Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).</li><li>Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+immune+cell+clearance+of+Aspergillus+fumigatus+spores+and+hyphae.">Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae.</a> Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).</li><li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+the+Innate+Immune+Response+in+a+Zebrafish+Larval+Model+of+Streptococcus+iniae+Infection.">Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52788 (2015).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=zWEDGI:+Wounding+and+Entrapment+Device+for+Imaging+Live+Zebrafish+Larvae.">zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).</li><li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Live+Imaging+Device+for+Improved+Experimental+Manipulation+of+Zebrafish+Larvae.">Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).</li><li>Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+Antifungal+Drug+Resistance.">Update on Antifungal Drug Resistance.</a> Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).</li></ol>

Açıklanınacak herhangi bir çatışma veya finansal çıkar yoktur.

Burada açıklanan enfeksiyon modeli konak immün yanıtları, konak-patojen etkileşimleri ve mantar patogenezini analiz etmek için faydalıdır12,13,14,15. Bu bilgiler, floresan etiketli patojenlerin ve konak hücrelerin13, larva sağkalımının ve zaman içinde CFU kalıcılığının yüksek çözünürlüklü görüntülemesinden elde edilebilir.
Mikroenjeksiyon tekniği bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir ve farklı mikroenjeksiyon ekipmanları ve kurulumları kullanırken ayarlanması gerekebilir. Özellikle, enjeksiyon basıncı ve zamanı iki ana değişkendir ve iğne tarafından çıkarılan hacmin ~3 nL olduğundan emin olmak için ayarlanabilir. İğneninpsle kırpılarak belirlenen boyutu, enjekte edilen spor sayısını da düzenler; ancak, daha büyük bir açıklık larva doku hasarına neden olabilir. Öte yandan, bir açıklığın çok küçük kısmı nispeten büyük sporların (>2 μm) dışarı çıkmasına izin vermez ve iğne tıkanmasına neden olabilir. Bu durumda, iğne biraz daha büyük bir açıklığa sahip olacak şekilde kapatılabilir.
Bakterilerin mikroenjeksiyonu için diğer protokoller homojen bir enjeksiyon karışımının korunmasına yardımcı olmak için PVP-40'ı kullanır, ancak bu taşıyıcıyı Aspergillus sporlarıyla kullanmakta herhangi bir avantaj bulamadık. İğnenin tıkanması, iğneyi yüklemeden önce herhangi bir kümeyi kırmak için mantar preparatının iyice girdaplanmasıyla hafifletilebilir. Bazen, iğnedeki bir tıkanıklık, basıncı veya enjeksiyon süresini geçici olarak artırarak ve iğne larvaları çevreleyen sıvıdayken mikroinjektörü tetikleyerek de yerinden çıkabilir. Basınç ve enjeksiyon süresi daha sonra tekrar önceki seviyelere indirilmelidir. Diğer durumlarda, bir tıkanıklık çıkarılamaz ve yeni bir iğnenin yüklenmesi ve yeniden kalibre edilmesi gerekir.
Bu protokol larva başına ~30-70 spor enjekte etmek için tasarlanmıştır. Spor hazırlığının konsantrasyonuna ve enjekte edilen hacme dayanarak, bu sayının oldukça düşük olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, ampirik olarak bu koşullar altında enjekte edilen spor sayısının bu olduğu bulunmuştur. Bu farkın neden oluştuğu bilinmemektedir, ancak iğnedeki spor topaklarından kaynaklanabilir. Daha fazla sayıda spor enjekte etme girişimlerimiz büyük ölçüde başarısız oldu.
Yaklaşık 30-70 spor enjekte edildiğinden emin olmak ve tüm larvalar boyunca enjeksiyonların tutarlılığını korumak için, larvaları çevreleyen E3'e enjekte ederek spor sayısını kontrol edin. Tüm enjeksiyonlar boyunca her beş ila altı larvada bir tekrarlayın. Spor sayısı değişiyor gibi görünüyorsa, basınç ve/ veya enjeksiyon süresi birden fazla larvaya tutarlı sayıda spor enjekte etmek için ayarlanabilir. Bununla birlikte, enjeksiyon dozun öncelikle arka beyinde kalmasına ve orta beyin ve ön beyinleri doldurmamasına dikkat edilmelidir.
Lokalize bir enfeksiyon sağlamak için, spor süspansiyonu arka beyin ventrikül içinde yer almalıdır. Bu, enjeksiyondan hemen sonra fenol kırmızısı lekeleme ile görselleştirilebilir, ancak kırmızı renk zamanla yayılır. Enjeksiyonlar için, otik veziklin etrafındaki bölge, ventrikülü 45 ° - 65 ° açıyla delmek ve ulaşmak için kullanılır. Bu bölgenin ana kan damarları yoktur, daha az doku hasarına neden olur ve anında iyileşir. Ventrikül üzerindeki deri delinirse, spor süspansiyonu dışarı sızabilir, çünkü Aspergillus spor enjeksiyonları için kullanılması gereken iğne bakteriyel süspansiyonlar için kullanılandan daha büyüktür. Başarısız bir şekilde enjekte edilen veya yanlışlıkla hasar gören larvalar, kırmızı bir işaret oluşturmak için yumurta sarısına birkaç kez enjekte edilerek veya larvayı iğneyle sıranın dışına sürükleyerek işaretlenebilir. Bir dizi enjeksiyon tamamlandıktan sonra, geri kalanı plakadan yıkanmadan önce bu larvalar çıkarılmalı ve atılmalıdır. Metilen mavisi olmayan E3, enjeksiyondan önce larvaları uyuşturmak ve ayrıca enjeksiyonlardan sonra larvaları tutmak için kullanılır, çünkü metilen mavisi mantar karşıtıdır.
Enjeksiyon anında, CFU sayıları enfekte konakçı içindeki uygulanabilir sporların sayısını temsil eder. Bununla birlikte, sporlar hyphae'ye çimlenirse, bunlar homojenizasyon sırasında ayrı uygulanabilir "mantar birimlerine" ayrılabilir ve birden fazla koloniye yol açabilir. Ya da kırılmamış çok hücreli bir hypha tek bir koloniye yol açabilir, bu da mantar yükünün ortalama, ancak kesin olmayan bir temsili ile sonuçlanır. Bu, CFU sayılarının, enjekte edilen sporların kaderinin görsel verilerini sağlayan bireysel larvaların boyuna mikroskopisi ile birleştirilmesiyle azaltılabilir.
Memeli sistemi ile karşılaştırıldığında, zebra balığı larva enfeksiyon modeli optik erişilebilirliği nedeniyle özellikle önemlidir. Doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin işe alınması ve yanıtları canlı sağlam bir konakçı içinde görselleştirilebilir. Bu, her hedefin canlı bir hayvanda Aspergillus sporlarına karşı makrofaj veya nötrofil reaksiyonunu nasıl etkilediğini analiz etmek için moleküler hedeflerin genetik veya kimyasal inhibisyonu ile birlenebilir.
Zebrabalığı larvası Aspergillus enfeksiyon modeli IA 12 , 13 ,14, 15,16,17,18,19,20,22'ninfarklı yönlerini tanımlamada etkili olmaya devam ederken, başka genişleme alanları da vardır. Konakçı tarafından, hücresel düzeyde bağışıklık tepkilerini tanımlamak için kullanılır, ancak bu, hedeflenen morfoino, CRISPR, kararlı mutant çizgileri veya kimyasal maruziyet ile birleştirerek bağışıklık mekanizmalarını moleküler düzeyde analiz etmek için genişletilebilir. Bir uyarı, zebra balıklarında bilinen tüm memeli doğuştan gelen bağışıklık yolu bileşenleri için homologların tanımlanmış olmamasıdır.
Patojen tarafından, farklı türlerin ve suşların virülansı tanımlanmıştır. Gelecekteki araştırmaların umut verici bir yolu, belirli genlerin veya proteinlerin virülans faktörleri olarak nasıl katkıda bulunduğunu test etmek için mutant Aspergillus suşlarının kullanılmasıdır. Böylece, bu proteinleri hedeflemek için yeni mantar önleyici ilaçlar geliştirilebilir. Mevcut mantar önleyici ilaçlar insan hastalarda düşük etkililiğe sahiptir ve mantarlarda bu ilaçlara karşı artan direnç vardır28. Bu in vivo model, bu ilaçların neden başarısız olduğunu araştırmak ve yeni anti-mantar ilaçlarının etkinliğini test etmek için bir ara model olarak kullanılabilir. Genel olarak, bu model kullanılarak keşfedilen bulgular, Aspergillusenfekte hastalar için gelecekteki etkili tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir.

Aspergillus fumigatus her yerde bulunan bir saprofitik mantardır ve havadaki sporları hem iç hem de dış mekanlarda bulunabilir1. Bu sporlar herkes tarafından solunur, ancak bağışıklık yetersiz bireylerin akciğerlerinden etkili bir şekilde temizlenir1,2. Bununla birlikte, kistik fibrozis gibi akciğer rahatsızlıkları değişmiş olan kişilerde akciğerlerde mantar çimlenmesine bağlı bronkopulmoner aspergillosis gelişebilir3. Bu enfeksiyonun en şiddetli formu olan invaziv aspergillosis (IA), bağışıklık sistemi baskılanmış bireyleri etkiler ve mantarın diğer organlara büyümesini içerir2,3. IA, mantar karşıtı tedavilerin mevcudiyetine rağmen enfekte hastaların%50'>ölümüne yol açar 4 . İmmün yetinsiz bireylerde doğuştan gelen immün yanıtlar solunan sporların temizlenmesinde önemli rol oynar1. Bununla birlikte, bu doğuştan gelen bağışıklık boşluğuna katkıda bulunan spesifik mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır. IA için yeni terapötik stratejiler bulmak için Aspergillus'un temizlenmesinde ana doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin (yani makrofajların ve nötrofillerin) hücresel ve moleküler mekanizmalarını anlamak önemlidir.
Memeli modelleri mantar virülans faktörlerinin tanımlanmasında etkili olmuş ve immün yanıtları barındırırken5,6, hücresel düzeyde konak-patojen etkileşimleri için görsel erişilebilirlik sınırlıdır. Doku kültürü deneyleri, tüm hayvanlarda var olan karmaşık çok hücreli ortamı ve etkileşimleri tam olarak nüksedemez7. Bu nedenle, zebra balığı bu boşluğu doldurmak ve çok günlük bir enfeksiyon boyunca canlı, sağlam bir konakta konak-patojen etkileşimlerinin incelenmesini kolaylaştırmak için alternatif bir model organizma olarak popülerlik kazanmıştır8,9. Zebra balığı doğuştan gelen bağışıklık sistemi 24 saat döllenme sonrası (hpf)10kadar erken gelişir ve adaptif sistemin 11 geliştirmesi4-6hafta sürer , doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarının izolasyonda değerlendirilebileceği bir zaman aralığı sağlar. Doğuştan gelen bağışıklık tepkileri insanlar ve zebra balıkları arasında iyi korunmuş11. Zebra balıkları, optik netlik (sağlam konakçıların yüksek çözünürlüklü canlı görüntülenmesine izin verir) ve genetik çekiş (moleküler mekanistik çalışmaları kolaylaştıran) dahil olmak üzere bu yanıtların araştırılmasını kolaylaştıran birçok özelliğe sahiptir.
Burada açıklanan larva zebra balığı Aspergillus enfeksiyon modeli başlangıçta Knox ve ark.12. Son zamanlarda grubumuz ve diğerleri tarafından konak bağışıklık mekanizmaları12,13,konak-patojen etkileşimleri13 , 14,15, immünosupresyon mekanizmaları 13,16,17,mantar virülansı18ve mantar önleyici ilaç etkinliği19,20' yi araştırmak için genişletilmiştir. Bu model, insan aspergillosisinin birden fazla yönünü yeniden özetler. İmmün yetme larvalar dirençli olsa da, bağışıklık sistemi baskılanmış larvalar enfeksiyona yenik düşebilir12,13,16,17.
Bu modelde, fagositlerle daha az nüfuslu bir alan olan larvaların arka beyin ventriküllerine spor enjekte edilerek lokalize bir enfeksiyon kurulur ve fagosit işe alımı ve davranışıdeğerlendirilebilir 12,13. Makrofajların, insanlarda Aspergillus sporlarına karşı ilk savunma hattı olarak hareket ettiğine inanılmaktadır 1 vememeli modelleri6,21. Benzer şekilde, zebra balığı modelinde, enjekte edilen Aspergillus sporlarına makrofajlar işe toplanırken, nötrofiller hipnoz büyümesine yanıt olarak ikinci olarak işe alınmaktadır12,13,22. Bu modelden, Aspergillus'un 7 günden fazla enfeksiyondan sonra wildtype immün yetmsiz larvalarda devam edebileceği de öğrenilmiştir. Ayrıca, enfeksiyonun tüm seyri aynı canlı hayvanlarda günlük konfokal görüntüleme ile takip edilebilir.
Bu protokol, döllenme sonrası 2 günlük (2 dpf) larvaların arka beyin ventriküllerine spor enjekte etmek için mikroenjeksiyon tekniğini açıklar. Zebra balığı larvaları beslenmeden 10 dpf'ye kadar yaşayabildiği için enfeksiyon 7 güne kadar izlenir. İmmünsüpresyon ilaç tedavisi ile indüklenebilir ve ilaçların larvalara uygulanması da tarif edilir. Son olarak, bireysel larvalardan CFO'ların ölçülmesi ve günlük canlı görüntüleme kurulumu da dahil olmak üzere enfeksiyon ilerlemesini takip etmek için iki yöntem açıklanmaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyepiece reticle</td>
			<td>Microscope World</td>
			<td>RETR10</td>
			<td>For calibrating needles, used in Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector setup: Back pressure unit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>BPU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Footswitch</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>FTSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipet holder kit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>M-Pip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator setup: Micromanipulator</td>
			<td>Narashige (Tritech)</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand and plate</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>MINJ-HBMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>To homogenize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ6380706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, fraction V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ65855-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAJ1792406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L spreaders</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14 665 230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary needles (no filament)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>TW100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipet tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-310</td>
			<td>To load the needle with Aspergillus suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM475855-1R</td>
			<td>To filter Aspergillus suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenylthiourea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AAL0669009</td>
			<td>To prevent pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red, 1% solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>57254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC118000500</td>
			<td>To anesthetize larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Solutions</td>
			<td>Components/Recipe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 media: 60x E3</td>
			<td>17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 &#183; 7H2O, to 1 L with H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x E3</td>
			<td>16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine stock solution</td>
			<td>2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 &#183; 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar</td>
			<td>10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Nitrate salts</td>
			<td>120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 &#183; 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace elements (TE)</td>
			<td>2.20 g ZnSO4 &#183; 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 &#183; 4H2O, 0.16 g FeSO4 &#183; 7H2O, 0.16 g CoCl2 &#183; 6H2O, 0.16 g CuSO4 &#183; 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 &#183; 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infection of zebrafish larvae with aspergillus spores for analysis of host-pathogen interactions

İnvaziv aspergillosis (IA), bağışıklık sistemi baskılanmış bireyler arasında en sık görülen mantar enfeksiyonlarından biridir. Antifungal ilaçların mevcudiyetine rağmen, IA enfekte immün sistemi baskılanmış hastalarda% 50'> mortaliteye neden olabilir. Yeni terapötikler geliştirmek için enfekte hastalarda enfeksiyon duyarlılığına ve düşük sağkalım oranlarına katkıda bulunan hem konak hem de patojen faktörlerinin belirlenmesi çok önemlidir. Doğuştan gelen immün yanıtlar, Aspergillus sporlarının tanınmasında ve temizlenmesinde önemli bir rol oynar, ancak tam hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Konakçı ve patojen arasındaki ayrıntılı mekanistik etkileşimleri araştırmak için güvenilir modeller gereklidir. Zebra balığı larvalarının optik netliği ve genetik çekiş kabiliyeti, onları canlı ve sağlam bir konakta birden fazla insan bakteriyel ve mantar enfeksiyonunun konak-patojen etkileşimlerini incelemek için ilgi çekici bir model haline getirir. Bu protokol larva zebra balığı Aspergillus enfeksiyon modelini açıklar. İlk olarak, Aspergillus sporları izole edilir ve mikroenjeksiyon yoluyla zebra balığı arka beyin ventrikül içine enjekte edilir. Daha sonra, immünsüpresif ilaçlar gibi kimyasal inhibitörler doğrudan larva suyuna eklenir. Enjekte edilen larvalarda enfeksiyonu izlemek için iki yöntem tanımlanmıştır, 1) koloni oluşturma ünitesi (CFU) numaralandırması için larvaların homojenizasyonu ve 2) tekrarlanan, günlük canlı görüntüleme kurulumu. Genel olarak, bu teknikler in vivo Aspergillus enfeksiyonunun ilerlemesini mekanistik olarak analiz etmek için kullanılabilir ve konak-patojen etkileşimlerini sorgulamak için farklı konak arka planlarına ve Aspergillus suşlarına uygulanabilir.

Aspergillus sporlarının zebra balığı larvalarının arka kısmına mikroenjeksiyondan sonra, enfeksiyon sonucu hayatta kalma, CFO'lar ve canlı görüntüleme dahil olmak üzere birden fazla test ile takip edilebilir. Bir sağkalım testinde, 1-7 dpi hayatta kalan enfekte larvaların sayısı izlendi. Wildtype larvaları tedavi edilmediğinde, çok az ölüm gözlendi ve larvaların ~% 80-100'ü deneyin tamamında hayatta kaldı (Şekil 1). Larvalar, kortikosteroid ilaç deksametazon (10 μM) maruz kalarak immünosuprese edilmişse, sağkalımda önemli ölçüde azalma gözlenmiştir(Şekil 1).
CFO'lar, A. fumigatus sporları ile enfekte olan wildtype larvalarından 7 günlük deney boyunca ölçtildiğinde, zaman içinde yavaş boşluk ile sporların kalıcılığı gözlenmiştir (Şekil 2A). 1, 2, 3, 5 ve 7 dpi'de hayatta kalan spor sayısı, çoğaltmalar arasında kalıcılık ve boşluğu karşılaştırmak için 0 dpi'de enjekte edilen spor sayısına normalleştirildi (Şekil 2B).
Lökositlerdeki floresan proteinleri floresan protein ifade eden Aspergillus sporları ile birlikte ifade eden transgenik balık hatları, hem lökosit işe alım ve davranışını hem de mantar çimlenmesini ve büyümesini görselleştirmek için kullanılabilir13. Makrofajlar etiketlendiğinde (örneğin, Tg (mpeg1:H2B-GFP) larvaların ~ % 50'sinde makrofaj kümelenmesi tipik olarak 2-3 dpi'den başlayarak gözlenmiştir (Şekil 3A). Nötrofil (Tg (lyz:BFP) işe alımı tipik olarak ertelendi, öncelikle mantar çimlenmesi meydana geldikten sonra meydana geldi (Şekil 3A). Larvaların çoğunda tüm deney için mantar yükü devam ederken (Şekil 3A), boşluk gözlenmiştir (Şekil 3B). Bazı larvalarda, makrofajlarda muhtemelen mantar yayılması nedeniyle, enfeksiyonun ilerleyen bölümlerinde arka beyin dışındaki mantar yükü de gözlenmiştir.
Otik veziklin etrafındaki alan, bu yayılmanın bulunabileceği olası bir yerdir (Şekil 3C). Bu gözlemler tüm deney boyunca birden fazla bireysel larvada ölçüldü (Şekil 4). Tipik olarak, çimlenme larvaların ~% 60'ında 5 dpi(Şekil 4A) ile görülmüştür. Fagosit küme alanı, makrofaj işe alımı ve nötrofil işe alımı hem zaman içinde hem de larvalar arasında değişir, bazıları deney boyunca eğilim gösterir ve bazıları zaman içinde çözülür (Şekil 4B,C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig01.jpg"> Şekil 1: Enfekte larvaların temsili sağkalım analizi. Aspergillusenfekte larvalar araç kontrolüne (DMSO) veya deksametazon (Dex) maruz kaldı ve sağkalım izlendi. Veriler üç havuza kopyayı temsil eder. Ortalama enjeksiyon CFO'ları: DMSO = 30, Dex = 29 (p değeri ve tehlike oranı Cox oransal tehlike gerileme analizi, ****p < 0.0001 ile hesaplanmıştır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2.jpg"> Şekil 2: Temsilci CFU, enjeksiyondan hemen sonra (0 dpi) ve enfeksiyon seyri sırasında (2, 3, 5 ve 7 dpi) bireysel enfekte larvalardan sayılır. Sekiz enfekte larva homojenize edildi ve her zaman noktası için CFU'ya saymak ve çoğaltmak için kaplandı. (A) Bir yinelemeden örnek veriler. Her nokta bir larvayı temsil eder, çubuklar her zaman noktası için araçları temsil eder. (B) CFU sayıları her çoğaltma için 0 dpi olarak CFU sayısına normalleştirildi ve üç çoğaltma birleştirildi. Veriler varyans analizi kullanılarak deneysel koşullar arasında karşılaştırılmış ve tahmini marjinal araçlar ve standart hatalar açısından özetlenmiştir. Asterix, 0 dpi'deki CFU ile karşılaştırıldığında istatistiksel önemi temsil eder (*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2.jpg"> Şekil 3: Enfeksiyon deneylerinden temsili görüntüler. Floresan makrofajlar (mpeg1:H2B-GFP) ve nötrofiller (lyz:BFP) ile PTU ile tedavi edilen larvalara RFP ekspresyörü A. fumigatusenjekte edildi. Canlı, enfekte larvalar konfokal mikroskopta 2, 3 ve 5 dpi'de tekrar tekrar görüntülendi. Maksimum yoğunluklu Z projeksiyon görüntüleri görüntülenir. Larva şemaları her panel için görüntülemenin yerini gösterir. Tüm ölçek çubukları, 25 μm olan içe ölçek çubukları hariç 100 μm'yi temsil eder. (A) Gösterilen görüntüler, tipik bir enfeksiyon ilerlemesini temsil eden 2, 3 ve 5 dpi'de çekilen tek bir larvadandır. İç kısımlar 3 ve 5. (B) Enfeksiyonu temizleyebilen larva alt kümesinin temsili görüntüsü, düşük mantar yükü ve 5 dpi'de çok fazla iltihaplanma. (C) Enfeksiyonun daha sonraki zaman noktalarında arka beyinden dışarı yaydığı larva alt kümesinin temsili görüntüsü. Bu görüntüde, mantar, makrofajlar ve nötrofiller otik vezikliğin etrafında ve altında bulunabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2.jpg"> Şekil 4: Görüntüleme deneylerinin temsili nicelemesi. Şekil 3'teki deneysel kurulumdan elde edilen görüntüler mantar çimlenmesi ve lökosit alımı için analiz edilmiştir. (A) Larvalar her gün çimlenmiş sporların varlığı için puanlandı ve çimlenme ile larvaların yüzdesi hesaplandı. (B,C,D) Her bir larva farklı bir renk çizgisi olarak temsil edilir. Her larva için 5 günlük deney boyunca fagosit kümesi görünümü ve boyutu (B), makrofaj işe alımı (C) ve nötrofil işe alımı (D) takip edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Bu protokol zebra balığı larvalarında bir Aspergillus enfeksiyon modelini açıklar. Aspergillus sporları larvaların arka beyinlerine mikroenjeksiyona sokuldu ve immünosupresyona neden olmak için kimyasal tedavi kullanıldı. Enfeksiyon ilerlemesi, mantar büyümesini ve immün yanıtları ve canlı sporların koloni oluşturan birim kaplama ile numaralandırılmasını izlemek için günlük görüntüleme kurulumu ile izlenir.

Konakçı-Patojen Etkileşimlerinin Analizi için Zebra Balığı Larvalarının Aspergillus Sporları ile Enfeksiyonu

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

infection-zebrafish-larvae-with-aspergillus-spores-for-analysis-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

4.0K Görüntüleme.  Clemson University. Bu protokol zebra balığı larvalarında bir Aspergillus enfeksiyon modelini açıklar. Aspergillus sporları larvaların arka beyinlerine mikroenjeksiyona sokuldu ve immünosupresyona neden olmak için kimyasal tedavi kullanıldı. Enfeksiyon ilerlemesi, mantar büyümesini ve immün yanıtları ve canlı sporların koloni oluşturan birim kaplama ile numaralandırılmasını izlemek için günlük görüntüleme kurulumu ile izlenir.

Video: Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

Ex Vivo İnsan lenfoid doku ve erkek Genital mukoza insan immün yetmezlik virüsü 1 ve Histoculture ile enfeksiyonun

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İnsan Lökositler tarafından Aspergillus fumigatus Conidia Fagositozunun ölçülmesi

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...