Biz S. ile bize sağlamak için Leonie de Boer ve Bas Zaat (Academic Medical Centre) minnettarız epidermidis O-47 suşu. Biz COPAS XL ve GENİŞ BioImager analizi ile yardım ve tavsiye için Rico Bongaarts, Francis Smet ve Angela COMAS (Union Biometrica) teşekkür ederim. Biz balık kapıcılık ve yararlı tartışmalar için Leiden Üniversitesi&#39;nden diğer meslektaşları için Davy de Witt, Ulrike Nehrdich ve Laura van Hulst teşekkür ederim. Bu araştırma Biyomedikal Malzeme Enstitüsü, Ekonomik İşler Hollandalı Bakanlığı tarafından ortaklaşa finanse edilen araştırma programının Proje P5.03 IBIZA bölümünü oluşturur ve Ekonomik İşler Hollanda Bakanlığı Smart Mix Programı (NWOA_6QY9BM) ve bir Eğitim, Kültür ve Bilim Bakanlığı, Hollanda. Ek destek AB projesi ZF-Sağlık (FP7-Sağlık-2009-242048) elde edilmiştir, ve RMJ AB Başlangıç ​​Eğitim Ağı FishForPharma (PITN-GA-201 Tecrübeli Araştırıcı olarak Marie Curie bursu ile desteklenmiştir1-289209). SJR 115.337 ° hibe anlaşması n altında Yenilikçi İlaçlar Girişimi Ortak Teşebbüsün fon aldı, kaynakların hangi Avrupa Birliği&#39;nin Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) ve tür contribution.The yazarların EFPIA şirketlerden daha fazla kabul mali katkı oluşmaktadır robotik için Leiden Üniversitesi Fonu (LUF) dan ve Cyttron gelen mali destek, sırayla mali görüntüleme tesisleri için Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü tarafından desteklenen Besluit Sübvansiyonlar Investeringen Kennisinfrastructuur programda. COPAS sistem edinimi kısmen Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (NWO, 834.10.004) mali yardımı ile Dünya&#39;da ve Yaşam Bilimleri (ALW) için Bölümü tarafından desteklenmiştir.

1.. Bakteriyel türler ve Büyüme Koşullar <ol><li> S. hazırlayın epidermidis Aşı <ol><li> S. birkaç ayrı ayrı koloniler, alın epidermidis suşu O-47, bir pWVW189 içeren Luria Bertani (LB) 25 ml LB ortamı içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca 10 ug / ml kloramfenikol ve kültür ile takviye agar plaka ile takviye edilmiş ikinci MCherry ekspresyon vektörü (De Boer L. yayınlanmamış) türetilmiş aşama midlog için 10 ug / ml kloramfenikol. </li><li> 1 dakika boyunca 12,000 x g ve daha sonra kültür santrifüj 1 ml onları% 0.3 (v / v) Tween-80 ile 1 ml steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile 3 kez yıkayın. </li><li> 600 nm (OD 600) de optik yoğunluğunun ölçülmesi, ve (ağırlık / hacim) polivinilpirrolidon 40 (PVP 40) PBS içinde% 2 bir 0.3 OD 600 için bakteriyel süspansiyonun seyreltin. Not: Bir OD 600 x 10 8 ila 1.0 arasında koloni karşılık 0.3 birim / ml (cfu / ml) oluşturulması. </li></ol&gt; </li><li> M. hazırlayın marinum Aşı <ol><li> M. birkaç ayrı ayrı koloniler, alın marinum soy M veya stabil bir şekilde (v / v) Middlebrook OADC zenginleştirme 50 ug ile takviye /, 10 ml 28 ° C&#39;de gece boyunca kültür ml higromisin ve% 10 ile bir Middlebrook 7H10 agar plakasından 10 mCherry ifade pSMT3 mCherry vektörü içeren E11 50 ug / ml higromisin ile takviye edilmiş,% 10 (v / v) Middlebrook ADC zenginleştirme ile Middlebrook 7H9 suyu. </li><li> 1 dakika boyunca 12,000 x g ve daha sonra kültür santrifüj 1 ml, 0.3% (v / v) Tween-80 ile 1 ml steril PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> OD 600 ölçün ve PBS (w / v) 40% 2 pvp bir 0.3 OD 600 için bakteriyel süspansiyonun seyreltin. Not: Bir 1 OD karşılık gelir 600 8 ila 10 x 1,0 cfu / ml. </li></ol></li></ol> 2.. Zebra balığı Yumurta hazırlayın <ol><li> 70 erkek ve 50 dişi yaban ty maksimum yerleştirinbüyük yetiştirme kabına ayrı ayrı zebrafish pe. Not: büyük yetiştirme kabın alt kısmında, dişi balık yerleştirin. </li><li> Zebra balığı üreme başlayalım, sabah ertesi gün ayırıcısını sökün. </li><li> Yumurta, su (60 ug / ml anında okyanus deniz tuzu) ile doldurulmuş bir 50 ml tüp içinde yumurta toplayıcı aracılığıyla büyük yetiştirme kabın altındaki yumurta toplayın. </li></ol> 3.. Enjeksiyon İğneleri <ol><li> 10 um arasında bir iç çapa sahip ticari olarak temin edilebilen özel yapılmış bir cam kılcal damar iğneler elde edilir. </li></ol> Enjeksiyon 4. Deneysel Anahat <ol><li> Yaklaşık olarak 40 ° C kadar, 100 ml% 1 yumurta, su (ağırlık / hacim) agaroz ve serin kaynatın Otomatik mikroenjektörler plaka içine agaroz dökün ve agaroz içine 1.024-iyi damgası yer. Not: levha soğuduktan kullanıma hazırdır. </li><li> Üzerinde otomatik mikroenjektör işletim yazılımı tıklayın &#39;sahne Kalibre&#39;sonra &#39;1024 &#39;de ızgara üzerine tıklayın ve mikroenjektör de agaroz plaka yerleştirmek ve iyi merkezi konumunda ekranda tıklayarak plaka kalibre. </li><li> &#39;Iğne menüsüne&#39; gidin ve &#39;kalibre iğne tutucu&#39; üzerine tıklayın. </li><li> 100 kob / nl S ihtiva eden 10 ul pvp 40 biriyle bir Microloader ucu kullanılarak enjeksiyon iğnesi doldurun epidermidis veya 30 kob / nl M. marinum veya sahte enjeksiyon gibi kullanım pvp 40. </li><li> Otomatik mikro enjektör iğnesi koyun ve aşağı veya yukarı hareket eden iğne ve iğnenin konumunda ekranda tıklayarak, y pozisyonlar x kalibre edin. Daha sonra, iğnenin ucunun konumunda ekranda tıklayarak iğnenin z konumunu kalibre edin. </li><li> Plastik bir transfer pipet kullanılarak agaroz ızgara üzerinde yumurta dağıtmak, ve fazla yumurta su çıkarmak. Otomatik bir mikropüskürtücü içerisinde agaroz ızgara yerleştirin. </li><li> &#39;Injectio gitn menüsü &#39;ve ayarlayın&#39; FemtoJet ayarları menüsünden, 1 nl ile ilişkilidir &#39;200 hPa ayarı&#39; Enjeksiyon basıncı Enjeksiyon süresi &#39;0.2 sn ve&#39; Tazminat basıncı &#39;15 hPa,. </li><li> Tüm plaka enjekte etmek &#39;, tüm enjekte&#39; üzerine tıklayın. </li><li> Yumurta toplamak Petri tabağı başına 70 embriyo, maksimum bir Petri kabı (92 x 16 mm) içine yıkama ve 28 ° C de inkübe edilir göre enjeksiyon sonrasında </li></ol> 5. Akış-sitometresiyle Analizi <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre sitometresi büyük bir tanecik akışı hazırlamak ve yumurta su ile bir numune kabı ve kılıf sıvı kabı doldurun. </li><li> Işletim yazılımı de, &#39;PMT&#39; menüsüne gidin ve aşağıdaki ayarları kullanın: &#39;Yeşil&#39; ve &#39;sarı&#39; kanalları için 650 &#39;Kırmızı&#39; kanalı için V ve 0 V. Ardından &#39;eşikleri&#39; menüsüne gidin ve aşağıdaki ayarları kullanın: &#39;Opticaenkaz etkisini azaltmak amacıyla l yoğunlukta &#39;eşik sinyali: 975 mV (COPAS XL değeri: 50) ve &quot;320 mikro-saniye (800 COPAS XL değeri) Flight Of Time&#39; (TOF) minimum. </li><li> Embriyolar analizi için, 5.4 adıma gidin sıralama ve bir Petri kabı içine embriyolar sıralama 5,5 veya analiz için adıma gidin ve bir 96-plaka içine embriyolar sıralama olmadan analiz için 5.6 adıma gidin. </li><li> Numune fincan embriyolar yerleştirin ve analizine başlamak için &#39;start&#39; üzerine tıklayın. Tüm embriyolar bakıldığında &#39;dur&#39; tıklayarak analizini durdurun. &#39;Bütün Store&#39; tıklayarak verileri kaydetmek. Not: Tüm veriler TXT, LMD, DAT, CSV ve BSRT dosyaları olarak depolanır. Adım 5.7 &#39;protokolünü uygulayın. </li><li> Numune fincan embriyolar yerleştirin ve &#39;Sıralama&#39; menüsünde 70 girerek sıralanmasını plaka başına 70 embriyo maksimum tanımlar. Sıralayıcı altında boş bir Petri kabı yerleştirin ve &#39;Elle sırala&#39; üzerine tıklayın. Ne Petri di<html> sh doldurulur, &#39;bütün Store&#39; tıklayarak verileri kaydetmek. Not: Tüm veriler TXT, LMD, DAT, CSV ve BSRT dosyaları olarak depolanır. Adım 5.7 &#39;protokolünü uygulayın. </li><li> Numune fincan embriyolar yerleştirin ve &#39;Sıralama&#39; menüsünde 1 girerek sıralanmasını yuva başına 1 embriyo maksimum tanımlar. Sol plaka tutucu içine boş bir 96-plaka koyun ve &#39;plaka Doldur&#39; üzerine tıklayın. 96-plaka dolduğunda, &#39;bütün Store&#39; tıklayarak verileri kaydetmek. Not: Tüm veriler TXT, LMD, DAT, CSV ve BSRT dosyaları olarak depolanır. Adım 5.7 &#39;protokolünü uygulayın. </li><li> &#39;Durum seç&#39;: Aşağıdaki veri filtre ayarlarını kullanmak, ham verilerin işlenmesi için TXT dosyasını alın. 6 Ardından &#39;Kırmızı gelen toplam floresan sinyal numaralarını kullanabilirsiniz: 40, ve sıralama modül&#39; Durum çeşit &#39;kullanıyorsanız ortalama ve ortalamanın standart hatasını hesaplamak için &#39;kanalı. Çubuk veya saçmanız grafikler içine bu veri setleri çizilir. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. İlaç Tedavisi <ol><li> Analiz ve sıralama 3 gün sonrası enjeksiyon (dpi), M. marinum büyük bir tanecik (adım 5.5) akış sitometresi kullanılarak iki eşit gruba embriyolar etkilemiştir. Bir taşıyıcı ile bir çözücü içerisinde ilgi çekici bir bileşik grubu ile ve tek başına çözücü taşıyıcı (kontrol) ile diğer tedavi. Antibiyotik yan etkileri test etmek için enjekte kontrolü taklit benzer tedavileri uygulanır. </li><li> 4 ve 5 dpi&#39;de analizi tekrar (5.5 adım) ve yumurta su veya bileşiği içeren yumurta su yenileyin. </li></ol> 7. Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme <ol><li> % 0.02 ile embriyolar anestezisi (ağ / hac) analiz öncesi yumurta su içinde 10 dakika boyunca 3-aminobenzoik asit etil ester (Tricaine) tamponlu. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak Omurgalı otomatik tarama Technology sistemi ve büyük parçacık Sampler hazırlayın. </li><li> Nesne - &#39;Görüntüleme gelen embriyoların yaşına karşılık gelen referans görüntüleri seçin211; Algılama Kurulum &#39;menüsü. </li><li> Menüsünden - &#39;Auto mağaza görüntüleri Görüntüleme&#39; dan Omurgalı Otomatik Tarama Teknoloji sistemi tarafından yapılacak resimlerin miktarını ve yönünü seçin. </li><li> Büyük Parçacık Sampler sol plaka tutucuya (adım 5.6) embriyolar ile dolu bir 96-plaka yerleştirin ve &#39;Run plaka&#39; üzerine tıklayın. </li><li> Bir embriyo tespit ve doğru yerleştirildiğinde; görüntü baş ve CLSM bir 10X sade kuru objektif kullanarak ve görüntü işleme yazılımı kullanarak sonradan görüntüleri dikiş ile ayrı ayrı kuyruk. </li></ol>

<ol>
	<li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).</li><li>Boelens, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial-associated+persistence+of+Staphylococcus+epidermidis+in+pericatheter+macrophages.">Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages.</a> J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).</li><li>Broekhuizen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+around+catheters+is+a+niche+for+bacteria+associated+with+medical+device+infection.">Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection.</a> Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).</li><li>Busscher, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial-associated+infection:+locating+the+finish+line+in+the+race+for+the+surface.">Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface.</a> Sci Transl Med. 4, (2012).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Veneman, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+high+throughput+screening+system+used+for+Staphylococcus+epidermidis+infection+marker+discovery.">A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery.</a> BMC Genomics. 14, 255 (2013).</li><li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+marinum+strains+can+be+divided+into+two+distinct+types+based+on+genetic+diversity+and+virulence.">Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence.</a> Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).</li><li>Stoop, E. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component.">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Disease Model., &amp; Mechanisms. 4, 526-536 (2011).</li><li>Adatto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+system+for+the+rapid+collection+of+large+numbers+of+developmentally+staged+zebrafish+embryos.">A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Spaink, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+injection+of+zebrafish+embryos+for+high-throughput+screening+in+disease+models.">Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models.</a> Methods. 62, 246-254 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248, 307-318 (2002).</li><li>Mathias, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+chronic+inflammation+caused+by+mutation+of+zebrafish+Hai1.">Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1.</a> J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).</li><li>Henkel, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+exomes+of+common+carp+(Cyprinus+carpio)+and+zebrafish+(Danio+rerio).">Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9, 59-67 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab on a Chip. 12, 711 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7, 634-636 (2010).</li></ol>

JS Bu makalede kullanılan aletleri üreten Yaşam Bilimi Yöntemleri BV&#39;nin sahibi.

Bu yazıda anlatılan yüksek verimlilik metodoloji enfeksiyonları farklı tipleri ile balık embriyoları ve larvaları yüksek sayıda taranması için hızlı ve uygun maliyetli boru hattı sağlar. Yerine geleneksel tek veya aile üreme tankların büyük yetiştirme kabı kullanarak yumurtlama sürecinin kontrolü ve senkron yumurta daha fazla sayıda nesil kolaylaştırdı. Otomatik mikro-enjeksiyon sistemi 7 geliştirilmiş bir versiyonu ile, 1 saat içinde aynı hücre aşamasında hemen hemen tüm 2500 yumurta kadar enjekte etmek mümkündür. Bu güncellemeler ve geliştirilmiş yazılımı ile bir okuyabilirisiniz olarak bakteriyel çoğalması ile büyük ilaç ekranlar gerçekleştirmek için kullanılabilecek önceden mümkün olandan daha fazla yumurta enjekte etmek mümkündür. Bununla birlikte, bu yöntem yine enjeksiyon, Benard ve arkadaşları tarafından tarif edilen, örneğin diğer enjeksiyon yolları sarısı ile sınırlıdır. (2012) 6, umarım yakın gelecekte otomatik mikro-enjeksiyon sistemine dahil edilecektir. &lt;Bu yöntemler zebrafish tarama için Benchmarking rağmen p class = &quot;jove_content&quot;&gt;, hem de diğer balık türleri ile uygulamalar için yararlı olacaktır. Örneğin, ortak sazan ilaç ekranlar için avantajlara sahip olduğu gösterilmiştir. Zebra balığı gibi, yumurta ve ortak sazan erken evre embriyolar şeffaf ama yüz binlerce yumurta ve daha sabit bir genetik zemini 16 teklif kendilenmiş hatlarının kullanılabilirliği geniş spawn boyutu ana avantajı ile vardır. Enfekte embriyolarının büyük miktarlarının analizi sitometresi yüksek miktarda, büyük bir tanecik akışı ile yapılır. Bu cihaz, sıralama çok gözlü levhalar ya da bileşiklerin çok sayıda test edilmesi için özellikle uygun hale getiren bir Petri kabı içine embriyolar analiz edilebilir. Daha yüksek bir görüntüleme çözünürlük gerekli ise, kurulum tekniği sitometresi büyük bir tanecik akış ön tarama için kullanılabilecek bir şekilde adapte edilmiş ve daha sonra da ortam ile örnekleri analiz edilir dahayüksek çözünürlükte koydu. Bu Omurgalı otomatik tarama Teknolojisi 17, 18 kullanılarak yapılabilir. Bu cihaz, otomatik, çok oyuklu bir plaka veya toplu bir kap, resim CLSM veya stereo mikroskobu kullanarak bir kılcal boyunca 360 ° &#39;den 2 ve 7 gün sonra fertilizasyon arasında canlı ya da sabit embriyolar toplayıp göre embriyoların manuel ayırma sağlayan 2 dökme kaplarda tekrar bertaraf edebilir mikroskopik görüntülerde. Gelecek gelişmeler bu nedenle mümkün CLSM ile, zaman içinde embriyo otomatik olarak çok sayıda taranması için yapım çok iyi plaka içine görüntüleme sonra embriyonun sıralama sağlayacaktır. Gelecekteki uygulamalarda Omurgalılar Otomatik tarama Technology sistemi, aynı zamanda, çok gözlü levhalar içine önce dağıtma larvalarının gerek kalmadan teknoloji sitometresi büyük bir tanecik akımının bağlanabilir varsayılarak, daha gelişmiş bir sıralama yol açacaktır. Bu kağıt tesis bir açıklarS. incelemek için yüksek bir verim kurulum d optimizasyonu epidermidis ve M. ilaç keşfi için bir model olarak marinum enfeksiyonu. Bu yumurta sarısı enjekte bu bakterilerin sonucu enjeksiyonu da yumurta gelişim aşamasına bağlı olduğunu göstermektedir. M. enjekte 16-128 hücre aşamasında ya da 16-64 hücre aşamasında M gerilimde marinum E11 kuyruk damarı enjeksiyonu 2, 6 ile aynı enfeksiyon ortaya çıkarır. Ancak bu kurulum sadece bakteriyel patojenlerin çoğalması ile sınırlı değildir. Bu robot, sırasıyla, 13, aşırı ifadesi ve gen knock-down çalışmaları genetik dönüştürme için DNA, RNA veya morpholinos içeren çözeltiler enjekte mümkün olduğu daha önce gösterilmiştir. Ayrıca, bu kurulum, kanser hücresi çoğalma ve yer değiştirme çalışmaları için yararlı olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, bu boru hattı bağlamında sinyal çeşitli mekanizmalar yüksek verimli taramalar için çok yönlü bir yöntem sunardoğuştan gelen bağışıklık, enfeksiyon hastalıkları ve kanser gelişimine uygulanır. Bu ekranlar ilaç keşfi için başkaları ile değil, aynı zamanda tespit uygulanabilir ilaçların olası toksik etkileri analizi ile kombine edilebilir.

Zebra balığı Bugüne kadar (Br.rerio) başarıyla bulaşıcı hastalıklar 1. çeşitli çalışma için verimli bir model olarak kurulmuştur. Zebra balığı embriyo nedeniyle şeffaflık ve floresan proteinleri eksprese eden transjenik mevcut raportör hatlarının çok sayıda vivo görüntüleme imkanı benzersiz sunmaktadır. Bu güçlü kombinasyon Miyobakteryum marinum, M. yakın akrabası olarak patojenler ile etkileşim sırasında bu sürede farklı bağışıklık hücre türlerini izlemek için yapar tüberküloz 2 veya Staphylococcus epidermidis, biyomalzeme ilişkili enfeksiyon 3-5 ana etken. Enfeksiyon farklı yolları çalışmanın 6 amaçları bağlı zebra balığı embriyolar kullanılabilir. Bu enfeksiyon yollarından biri, bakterilerin sarısı enjeksiyon. Diğerlerine göre bu yöntemin temel avantajı sarısı enfeksiyonu olduğunuönemli ölçüde enjeksiyon süresini azaltmak ve enfeksiyonun 7, 8, yüksek tekrarlanabilirlik sağlayan, robot enjeksiyon yoluyla otomatik olarak gerçekleştirilebilir. Önceki çalışma, S. ve çalışma için in vivo model sisteminde yüksek bir verim olarak zebrafish kullanarak epidermidis ve M. marinum enfeksiyon 7, 8 başarılı olduğunu gösterdi. Bu sistem, robot sarısı erken embriyo enjeksiyon ve bakteri yükü için bir ölçüt olarak floresan sonucu kullanılarak yoluyla hastalık ilerlemesine taranması edebilmektedir. Bu kavram ile uyumlu olarak, bu kurulum optimize edilmiş ve homojen enfekte embriyolarının büyük sayılar üretmek ve bileşikler bir dizi ile muamele edildikten sonra bir süre boyunca enfeksiyonun ilerleyişini izlemek için potansiyeli olan bir yüksek verimli yüksek verimli bir boru hattı kurulmuştur. Kurulan kurulum sayesinde ekrana 8.000 senkron embriyolar kadar üretmek mümkündürhastalığın ilerlemesi için, saat başına 2,500 embriyo kadar bu şekilde işlem. Embriyolar enfekte larva homojen gruplar sağlanması, otomatik bir sistem kullanarak bakteri yüküne göre sıralanır. Ayrıca, kurulum doğrulamak için, memelilerde, tüberküloz ilerlemesini önlemek için bilinen referans etkileri M. bulaşmış embriyo üzerinde test edilmiştir marinum E11 gerginlik veya daha öldürücü M suşu 9. Bu çalışmada ayrıntılı olarak enfekte embriyo sayıda ve gelişme sırasında ve bileşik işlemden sonra bakteriyel ilerlemesinin sonraki analizi elde edebilmek için kurulmuştur yüksek verimli boru hattını açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 agar</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L5542</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>16785.03</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>25966.01</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Calbiochem, San Diego, California, USA&#160;</td>
			<td>529504</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td>
			<td>S103</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td>
			<td>5460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSPAWN</td>
			<td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td>
			<td>iSPAWN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>COPAS XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP Sampler</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle 10 &#181;m inner diameter</td>
			<td>Qvotek, Mississauga, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery

Zebra balığı, yüksek kapasiteli tarama olanakları ile bir bütün hayvan modeli olarak ilaç keşif taramaları preklinik aşamasında değerli bir araç haline gelmektedir. Bunlar, bu şekilde azaltılması, memeli modellerinde erken aşamalarında hücre bazlı deneyler arasında boşluk ve in vivo doğrulama köprü için kullanılabilir, çok daha pahalı kemirgen modellerinde testten geçen bileşiklerin sayısı. Bu açıdan, bu metin içindeki Staphylococcus epidermidis çalışma ve Mycobacterium marinum enfeksiyonu için in vivo model sistem olarak zebrafish kullanarak yeni bir yüksek veri akışı boru hattı tarif edilmektedir. Bu kurulum senkron embriyo çok sayıda üretim ve analiz homojen enfekte sağlar. Ayrıca boru hattının esnek, kullanıcının kolayca gerektiğinde analiz çözünürlüğünü artırmak için başka platformlar uygulamasına olanak tanır. Birlikte yenilikçi yüksek verim te olan Zebra balığı kombinasyonuchnologies, bu yeni bileşiklerin etki moduna çözmek için kullanılabilecek transjenik sayıda için bütün bir hayvan modeli kullanılarak değil, aynı zamanda mukavemet, sadece ilaç test ve yeni olanaklar keşif alanı açar.

Bu sonuçlar yüksek kapasiteli boru hattı S. çalışma olduğunu göstermektedir epidermidis ve M. marinum enfeksiyon başarıyla kurulmuş ve diğer enfeksiyon modellerine uzatılabilir. İlk olarak, Adatto ve arkadaşları tarafından yayınlanmış sistemine göre büyük yetiştirme kabına (Şekil 1A). (2011) 11 kullanımının, yumurtlama işleminin yüksek bir kontrolü elde tek olaylar senkron yumurtaların büyük sayılar üretmek için olanak sağlar. Daha önce geliştirilen otomatik mikro-enjeksiyon sistemi 7 geliştirilmiş bir versiyonu (Şekil 1A) kullanıldı, kısa bir süre içinde embriyo çok sayıda enjekte edebilmek için yanında. Sarısı enfeksiyon için en iyi gelişimsel aşamada, S. ile enjeksiyonları olduğunu değerlendirmek için epidermidis ve M. marinum Kimmel ve diğerleri tarafından yapılan açıklamaya göre, 1 ve 512 hücre aşamasında arasındaki tüm farklı safhalarında gerçekleştirilmiştir. (1995) 12 </sup&gt;. 100 cfu S ile Enjeksiyonlar epidermidis 16 ve 128 hücre aşamasında arasında en iyi enfeksiyon modeli (Şekil 2) temin etmiştir. Bakteriler 3 gün boyunca sarısı içinde çoğaldı ve sonrası 3 dpi vücuda yayılır. 256 hücre aşamasında embriyo gövde içine yayılan neredeyse herhangi bir bakteri ile yumurta sarısı içinde esas olarak bakteri büyüme gösterdi sonra 16 hücre aşamasından önce enjeksiyon yapılması 4 dpi ve enjeksiyon yüksek mortaliteye neden oldu. Bakteriyel yük miktarının Veneman ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi, büyük bir tanecik akış sitometresi kullanılarak flüoresan yoğunluğu analizi ile gerçekleştirilmiştir. (2013) 8 (Şekil 3). Gözlemler göstermiştir ki 30 cfu M. püskürtülmesi için uygun gelişim aşamasında marinum enjeksiyon E11 suşu (Şekil 4A) ve daha öldürücü M Strai ile 16-64 hücre aşamasına arasında 16-128 hücre aşamasında arasındadırn (Şekil 4B). Bu aşamalarda enjekte embriyolar yumurta sarısı içinde bakteri büyüme gösterdi ve embriyo (Şekil 7) yoluyla bakterilerin yayılmasını. Erken aşamalarında hem cinsleri ile Enfeksiyon 4 dpi sonra ölmeye embriyoların lider nonspesifik jeneralize bakteriyel büyümeyi sundu. Diğer taraftan, daha sonraki aşamalarda enjekte edilen embriyolar bakteri yükü sarısı sınırlıydı. Daha sonra, büyük parçacık ön düzenlemesine (Şekil 1 B)-olmayan ya da yüksek derecede enfekte embriyolar (Şekiller 5A ve 6A) hariç enfekte balıkların büyük homojen gruplar oluşturulur akış sitometresi. Ön düzenlemesine sonra, M. marinum enfekte embriyolar Rifampisin, bir birinci hat antitüberküloz ilaç ile muamele edilmiştir. Önceki çalışmalar, 200 uM&#39;lik bir dozda Rifampicin ile tedavi, etkin bir M. azalttığını göstermiştir zebrabalıkları 7, 13 marinum enfeksiyonu. Advantag alarakFarklı dozlarda uygulandı ile yüksek verimlilik ayarlaması, tedavi ile oluşturulan homojen bir şekilde enfekte edilmiş embriyoların sayıda e. M. ile enfekte embriyolar marinum M gerilme ve 12, 24 ile 48 saat boyunca muamele edilmiş ve 200 uM Rifampisin, doza bağlı bir şekilde (Şekil 5B) etkili bir şekilde azaltmak için mikobakteriyel enfeksiyonu gösterdi. Bu konsantrasyon, gelecekteki deneyler için kullanılmıştır 200 uM&#39;lik bir dozda Rifampisin ile enfeksiyonun etkili bir azalma göz önüne alındığında. Önceki sonuca paralel olarak, bakteriyel yükü ilerlemesini okuyan M. kullanarak marinum E11 gerginlik belirgin bir azalma 24 saat ve sonrasında 200 mcM Rifampicin tedaviden sonra (Şekil 6B) gözlenmiştir. Yüksek büyütme görüntüleme bu embriyoların gerekmektedir Ayrıca, eğer, bu numuneler kullanılarak analiz edilebilir yerden 96 oyuklu plakalar içinde (Şekil 1 C), otomatik olarak görüntülenebilirBüyük Parçacık Sampler ile Omurgalı Otomatik Tarama Teknolojisi sistemi CLSM üzerine monte edilmiş. Büyük Parçacık Sampler ile Omurgalı Otomatik Tarama Teknolojisi sistemi ya bir CLSM veya stereo mikroskop üzerine monte edilebilir bir sistemdir. Bu cihaz, otomatik olarak, bir cam kılcal yoluyla, 96 oyuklu bir plaka ya da dökme kabından, canlı ya da sabit embriyoların yüklenmesini sağlar ve istenen açıda (örneğin, dorsal ve lateral) de kameranın önüne yönlendirir. Bütün yönlerde embriyonun Görüntüler kamera ile ilgili kartı ya da harici bir CLSM (Şekil 7) ile yapılabilir. Embriyolar daha sonra toplama veya atık konteynere transfer edilecektir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> Şekil 1.. Yaygın deneysel outline. Büyük A) Yetişkin balık yumurtası toplanmış, bir agaroz plaka içine hizalanmış ve enjekte edilir, çiftleşmeye birlikte konur. B) enjekte yumurta 28 ° C&#39;de kuluçkaya yatırılır ve olası ilaç tedavisi için önceden sıralanacaktır. ° C) daha sonraki analizi parçacık CLSM ile sitometresinin ve / veya Büyük Partikül Numune / Omurgalı Otomatik Eleme Teknolojisi akar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> S. iyi cep evre 2. Kurulması Şekil epidermidis enjeksiyon sarısı. Zebrafish embriyolar S. 100 cfu ile 1 512 hücre aşamasından farklı gelişim aşamalarında sarısı enjekte edildi epidermidis. 1 a arasına enjekte embriyolarnd 8 hücreli evre 4 dpi sarısı ve yüksek mortalite bakteriyel büyüme gösterdi. 16 ve 128 hücre aşamasına arasına enjekte Embriyolar sarısı ve 3 dpi başlayan vücudun içinde bakteri büyüme gösterdi. 256 ve 512 hücre aşamasına arasına enjekte Embriyolar sarısı içinde birçok bakteri büyüme gösterdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> S. sitometresinin büyük parçacık akışı kullanılarak bakteri yükünün Şekil 3.. Kantitasyonu. 100 kob epidermidis zebrafish embriyoların sarısı içine enjekte edilmiştir. A) 5 dpi kadar, her gün, 10 embriyo grupları iki biyolojik kopyaları (hata çubukları göre ortalama üstel büyüme gösteren, homojenize edilir ve direkt olarak kaplanmıştırAnaliz sitometresiyle = SEM). B) Büyük parçacık akışı olmayan enjekte ve S&#39;den ortalama floresan sinyalini göstermektedir epidermidis embriyolar enjekte. . Değil önemli farklılıklar C) mikroorganizma arasındaki korelasyon ve: durum başına 30-160 embriyolar (hata çubukları = SEM), farklı harf ANOVA Tukey post-hoc testi (P &lt;0.001), ns tarafından izlenen bir arada istatistiksel olarak anlamlı farklılık göstermektedir analiz edildi 10 S. gruplarının ortalama floresans sinyali epidermidis (hata çubukları = SEM) embriyolar bulaşmış. Bu rakam Veneman ark modifiye edilmiştir. (2013) 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> Şekil 4. EstablisM. için iyi cep sahnenin taşınma süreleri marinum sarısı enjeksiyon. Zebrafish embriyolar M. 30 cfu ile 1 512 hücre aşamasında tüm farklı gelişim aşamalarında enjekte edilmiştir marinum E11 ve M suşu. A, B) Embriyolar gösterdi 1-8 hücreli aşamasında enjekte benzer yayılan ve bu enjekte ederken E11 gerginlik granülomlar ve sistemik enfeksiyon oluşumunu gösterdi hem cinsleri ile mortalite. A) Embriyolar 16-128 hücre aşamasına arasına enjekte 256 512 hücre aşaması. B) sarısı içine bakteri yükünü tuttu Embriyolar 512 hücre aşamasına kadar 128 enjekte olanlar sarısı içine bakteri yükünü tutarken yapıları ve sistemik enfeksiyon gibi granülom oluşumunu gösterdi M suşu ile 16-64 hücre aşamasına arasına enjekte . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo: Src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt;: fo içerik-width = &quot;5in&quot; Şekil 5,. M. tedavisi marinum akut enfeksiyon birinci basamak anti-tüberküloz ilaç ile. Embriyolar M. 30 cfu ile 16-64 hücre aşamasına arasına enjekte marinum M soy Her iki grupta da, bireysel embriyoların olmayan ve / veya yüksek derecede enfekte embriyolar. A) Floresans attıktan sonra iki grupta kriteri için 3 dpi akış sitometresi büyük parçacık aracılığıyla çalıştırılmıştır. B) Embriyolar Rifampicin (RIF ile muamele ), 12, 24 ve 200 uM 4 dpi&#39;de analiz edildi dozlarında 48 saat boyunca; bunların bakteri yükü önemli ölçüde. C) Örnek COPAS 12, 24&#39;ün dozlarda DMSO ile muamele edilmiş ve Rifampicin embriyo profilleri ve 24 saat boyunca 200 uM azalır. Bakteriyel yük ve dağıtım kırmızı zirveleri ile belirtilir. Mavi hat Zebrafish e dpf&#39;e kriteri elemanının profili (4 temsilmbryo) COPAS tarafından. Koşul başına 60-90 embriyo analiz edilmiştir. Her bir veri noktası tek bir embriyo temsil eder. ± SEM olarak değerleri belirtilmiştir. ns: anlamlı değil farklılıklar. Farklılıkların istatistiksel anlamlılık Analizi ANOVA Tukey posthoc testinin ardından tek yönlü tarafından yapıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> Şekil 6,. M. tedavisi marinum kronik enfeksiyon birinci basamak antitüberküloz ilaç ile. Embriyolar M. 30 cfu ile 16-64 hücre aşamasına arasına enjekte marinum E11 suşu olmayan ve / veya yüksek oranda enfekte embriyolar attıktan sonra iki grup halinde sıralanır 3 dpi sitometresini büyük parçacık akışı ile çalıştırıldı.<html> A) her iki grupta da bireysel embriyolar Floresans. B) 4 gün boyunca 200 uM Rifampicin (RIF) ile muamele Embriyolar tedavi 1 gün sonra bakteri yükünün önemli bir azalma gösteren analiz edilmiştir. Koşul başına 90 embriyo analiz edilmiştir. ± SEM olarak değerleri belirtilmiştir. Farklı harfler aynı tedavinin zaman noktaları arasında önemli farklılıklar göstermektedir. * Kontrol grubu ile anlamlı farklılıklar gösterir. ns: anlamlı değil farklılıklar. Farkların istatistiksel farkları, ANOVA analizi Tukey testi posthoc ardından bir şekilde gerçekleştirildi. (P &lt;0.05). Şekil B) Spaink ark modifiye edilmiştir. (2013) 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> hres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; M. Şekil 7. Sonucu marinum E11 sarısı enjeksiyon Omurgalı Otomatik Tarama Teknolojisi ve CLSM kullanarak görüntülü. 5 dpi FLI1-EGFP 14 embriyo (3 görüntülerini dikişli) Eşodaklı Z yığını. M. A) Canlı embriyo gösteren çoğalması vücut. B genelinde marinum E11 bakteriler (kırmızı)) M. gösteren Sabit 5 dpi fli-EGFP embriyo vücutta marinum E11 bakteriler (kırmızı) lökositlerin L-plastin 15 immün ile tespit (açık mavi) ile ko-lokalize.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discover

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

establishment-optimization-high-throughput-setup-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

13.1K Görüntüleme.  Leiden University.  Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır. 

Video: Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Kolaylaştırılması İlaç Keşfi: Zebra balığı An Otomatik Yüksek içeriği Enflamasyon Assay

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Kullanımı<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bir Model Organizma olarak Eğitim için<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Enfeksiyon

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Çok ilaca dirençli Demonstrating<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplifikasyon Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analiz 18FDG PET/BT uzmanı Mycobacterium tüberküloz enfeksiyon ve insan olmayan primatlarda tedavisi için bir araç olarak görüntüleme

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Bir fare modeli için değerlendirmek doğuştan gelen bağışıklık yanıtı Staphylococcus aureus enfeksiyon

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...