Yazarlar plasmidlerini sağlamak için Tracy Young-Pearse&#39;nin ve Atsushi Kamiya teşekkür ederim. CK, ve MASS (DE 792/2-4); Bu çalışma OR ve CK (Bmbf 01EW1003), DFG (GRK1033 Ko 1679/3-1) için NEURON-ERANET keşfetmek tarafından finanse edildi

Ulusal ve Avrupa mevzuatına uygun olarak; Tüm hayvan deneyleri sorumlu Landesministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (87-51.05.2010.A301 LANUV NRW) tarafından yetkilendirilmiştir. 1.. Utero Elektroporasyon Bu yöntem, Walantus et al. 3 ile fare, hem de Rice et al. 4 için Jüpiter ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve burada sadece kısa bir süre özetlenmiştir. 6-8 yavruların bir DKBKS iyi bir sonuç verir. (Aşağıya bakınız), genel hayatta kalma oranını arttırmak amacıyla, en az iki non-elektroporate embriyolar olmalıdır. <ol><li> 1.5 ug / ul DNA içeren-bir karışım hazırlayın hedef Plasmid (shRNA: pentr-U6, Invitrogen, Eugene, OR / DISC1 aşın: pCAX 21), 0.5 ug / plazmid (pCAX), 0.5 ug / ul ihtiva eden, GFP Lusiferaz ul 1x PBS çözeltisi hafif lekeli Blu plazmid (pCAGGS 22) ihtiva edenHızlı Yeşil Boya ile e. </li><li> İğne Pipet Çektirme cam kılcal üzerinden enjeksiyon iğneleri hazırlayın. Ve alkol bazlı dezenfektan (kodan Tinktur forte) ile otoklav veya inkübasyon yoluyla cerrahi aletleri sterilize. </li><li> 15 dakika ameliyattan önce 16 gün fertilizasyon (E16) sonra hamile bir sıçan buprenorfinin (0.05 mg / kg) bir pre-operatif dozunu. Daha sonra izofluran odası içindeki hayvan anestetize. <ol><li> Anestezi sırasında,% 1.8 0.4 L / dk ve izofluran oksijen ayarını kullanarak, anestezi cihazına bağlı solunum maskesi ile 37 ° C ısıtılmış ameliyat masasında sırtüstü pozisyonda sıçan yerleştirin. </li><li> Karın tıraş sonra, traş alanı kodan Tinktur Forte (alkol bazlı dezenfektan) ile üç kez dezenfekte edin. </li><li> Sadece traş operasyon alanını açığa steril bezler ile sıçan örtün. </li></ol></li><li> Utero elektroporasyon gerçekleştirin. <ol><li> Bir Scisso ile karın Cutlinea alba boyunca r (~ 2 cm). </li><li> Bir halka forseps ile dikkatlice rahim boynuzları maruz. </li><li> Bütün ameliyat sırasında ısındı steril PBS ile ıslak rahim duvarını tutmaya özen gösterin. </li><li> Embriyoların lateral ventrikül birine ince bir cam iğne ile DNA çözümü enjekte edilir. </li><li> Embriyonun başının etrafında 7 mm elektrot yerleştirin. Üst korteks tabakalarının bir hücre popülasyonu vurmak için, E16 23 de İzmir Ekonomi Üniversitesi&#39;nde gerçekleştirmek ve hafif bir sırt / yanal eğilimi ile enjekte ventrikül yukarıdaki yarımkürede pozitif elektrot yerleştirmek. Hipokampal hücreleri, yan ile enjekte ventrikül göre ters tarafa pozitif elektrot yerleşimi değiştirmek hedeflemek için hafifçe dorsal yönde (Şekil 1). </li><li> Bir kare dalga darbe elektroporatörü ile 950 ms sonları ile 55 V beş 50 msn darbelerle Elektroporasvon gerçekleştirin. </li><li> T artırmak amacıyla her bir rahim boynuzu vajinal sonunda ilk embriyo yedekO, tüm embriyoların hayatta kalma şansı. </li><li> Geri anne fareye rahim boynuzları koyun. </li><li> Emilebilen Vicryl cerrahi sütür materyali ile karın duvarı Stich. </li><li> Vicryl dikiş malzemesi ile veya dikiş klipleri ile cilt kapatın. </li><li> Geri eve kafese anne sıçan yerleştirin ve 2-3 saat süreyle sıcak tutmak. </li><li> Hayvan tesis odasında kendi ev kafeste sıçan tutun ve ad libitum besleme. Onlar E22-24 arasında doğurur. </li><li> Üç hafta boyunca anneleri ile sıçan yavrular tutmak ve cinsiyete göre daha sonra onları ayırmak. </li></ol></li></ol> 2. Enzimatik Lusiferaz Reaksiyon ışıldaması Canlı Görüntüleme Bu yöntem, rahimde transfekte edilmiş hücrelerin konumunu analiz etmek için kullanılır. Co-Electroporated ateşböceği lusiferaz cDNA oxyluciferin D-lusiferin metabolize üzerine, bir foton (Şekil 2 yayan aktif lusiferazın, çevrilir (Şekil 4), yaklaşık 35 gün yaşına kadar bir IVIS Spektrum pozitif elektroporasyona genç farelerin beyinlerinde tespit edilebilir. Bu çalışmada, lusiferaz deney ve biyoışıldama görüntüleme P7 başlayarak yapıldı. Bu zaman noktası anne ve yavruların doğum stresten kurtarmak için izin seçildi. Başlangıçta P0 yavrular ile çalışırken, yavru hayatta ciddi yavrular ölü bulundu ya da anne tarafından yemiş olduğu etkilenmişti. Başlangıçta, başarılı elektroporasyon ile sıçan yavrular üç dakikalık bir pozlama süresi ile 2D-biyoparlaklık resim ile tanımlanır. Daha sonra, pozitif yavrular electroporated alanının konumunu belirtmek için 3D görüntüler oluşturmak için kullanılır. <ol><li> Ml 15 mg / ml konsantrasyonda PBS içinde D-lusiferin sodyum tuzu seyreltin ve steril bir şırınga filtresi ile filtre edilerek sterilize. </li><li> Yavrular tartılır. </li><li> Üst karın ile bir yandan yavru almak ve biraz karın germek. Lusiferin çözelti intraperitoneal, vücut ağırlığının her 10 ul / g enjekte edilir. Eski ve daha çevik olanlar için, lusiferin enjekte önce indüksiyon odasında izofluran ile yavrular ön uyuşturan. </li><li> % 3 izofluran ile IVIS Spectrum içindeki XGI-8 Gaz Anestezi Sistemi Izofluran akını açın. </li><li> Anestezi Sistemi cam burun konisi içine hayvanın burun koyun. </li><li> Derin anestezi (2-3 dakika) kadar bir yüzükoyun pozisyonda hayvan tutun. Ardından% 1.5 izofluran akını azaltır. </li><li> Bütün çöp olumlu yavrular seçmek için bir 2D-biyoparlaklık ölçümü seçin. Aşağıdaki ayarları kullanın <img alt="Ekran 1" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen1.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen1large.jpg" target="_blank">Büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <ol><li> Bir logların yazıldığı Setkmark 8&#39;de orta binning ve F / Stop ile Fotoğraf üzerinde, kamera ölçüm başladıktan sonra yukarıda bir fotoğraf alır. </li><li> Set Tahrik filtresi: blok. </li><li> Emisyon filtre ayarlayın: açık. </li><li> Orta binning ayarlayın. </li><li> 1 de F / Stop ayarlayın. </li><li> Set Sahne seviyesi A. </li><li> 180 sn ışıldama pozlama süresini ayarlayın. </li></ol></li><li> Daha pozitif yavrularından elektroporasyona alanı ölçmek ateşböceği lusiferaz için aşağıdaki DLIT ayarlarını kullanmak için 3 boyutlu resimlerin oluşturulması için. <img alt="Ekran 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <ol><li> Fotoğraf üzerinde bir onay işareti koymak; kamera ölçüm başladıktan sonra yukarıda bir fotoğraf alır. </li><li> Yapı üzerinde bir onay işareti ayarlama, hayvanın önce yüzey biyoışıldama ölçüm IVIS tarafından taranır. </li><li> Use iki hafta yaşına kadar Emisyon filtreleri ve pozlama süresi aşağıdaki ayarları değiştirebilirsiniz: Emisyon filtre 1: 590 nm, pozlama süresi 300 sn Emisyon filtresi 2: 600 nm, pozlama süresi 240 sn Emisyon filtresi 3: 620 nm, pozlama süresi 180 sn Emisyon filtresi 4: 640 nm, pozlama süresi 120 sn P20 daha yaşlı sıçanlarda Emisyon filtre 1: 600 nm, pozlama süresi 300 sn Emisyon filtresi 2: 620 nm, pozlama süresi 300 sn Emisyon filtresi 3: 640 nm, pozlama süresi 300 sn <img alt="Ekran 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . Nedeniyle yaşlı hayvanlarda sinyal gücü azalmaya, pozlama süresi üç iyi emisyon filtreleri için büyütülür. </li><li> Set Sahne seviye B </li><li> Orta binning ayarlayın. </li><li> 1 de F / Stop Set </li></ol></li><li> Sonra ölçüm, mar<html> birbirinden onları ayırt etmek için bir kulak deliğinin kod ile sıçan k ve IVIS Canlı Görüntüleme bunları fotoğraflara maç </li><li> Ölçüm prosedürünün sonunda, izofluran akını kapatın ve kendi kafesine dönmeden önce birkaç dakika boyunca ısıtılmış tabakta sıçan tutmak. </li></ol> 3. Biyoparlaklık Görüntüler Analizi 3D görüntüler, 3D film ve sinyal kaynağının hacminin nicelikleme nesil Yaşayan Image yazılımı IVIS Spectrum önceden yüklenmiş tarafından yapılır. <ol><li> 3D görüntüler Üretimi <ol><li> İlk olarak, bir yüzey topografya yeniden, bu nedenle% 20-30 arasında eşik ayarlayın. <img alt="Ekran 4" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen4.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen4large.jpg" target="_blank">Büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Ekran 5" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen5.jpg" /> een 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg &quot;/&gt; </li><li> Her dalga boyu için% 10 bir görüntü eşik ile DLIT 3D yeniden başlatın. <img alt="Ekran 7" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen7.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen7large.jpg" target="_blank">Büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Ekran 8" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen8.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen8large.jpg" target="_blank">Büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Screen 9" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen9.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen9large.jpg" target="_blank">Büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . </li><li> 3D araç içinde animasyon düğmesini kullanarak 3D filmler oluşturun. </li><li> 3D görüntünün farklı yönelimlerin yanı sıra anahtar kare olarak yakınlaştırma görüşlerini seçin ve &#39;Record &amp; # tuşuna39, düğme, tek bir pozisyon / yönlendirme diğerine geçi kayıt. <img alt="Ekran 10" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen10.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen10large.jpg" target="_blank">Büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . </li></ol></li></ol> 4. Davranışsal Test Davranış testleri sıçanda IUE aracılı gen manipülasyonu erişkinliğe uzun vadeli etkileri başlatmak olup olmadığını belirlemek amacıyla gerçekleştirilmiştir. Bu özel durumda, geçici bir etki, İEÜ&#39;de sonra tek taraflı tam boy insan kortikal DISC1 aşırı ifadesi ile ilgili dopamin için özel bir test olarak, amfetamin düşük doz ile ve olmadan (OF), bir açık alanda hareketlilik testi ile araştırılmıştır davranış 24. Tarafından gerçekleştirilen benzer bir prosedürde Niwa ve diğerleri. DISC1 demonte, IUE fareler değil kullanılarak IUE farelerde kontrol aşırı duyarlılık gösterdi18, amfetamin için. Rahimde bir DISC1 aşırı ifade eden bir vektör ile elektropore edildi sıçanlar 07:00-07:00, 12 saat ışık ile laboratuar koşulları altında yapılmıştır ve ad libitum beslendi. 3 aylık sıçanlar davranış testi uygulandı. Amfetamin etkileri bir okuma, ses ve ışığa izole edilmiş oda içinde yer alan bir tru tarama etkinliği sisteminin bir açık-alan olarak lokomosyon miktarının belirlenmesi için kullanılmıştır. Bu sistem süreyi ölçer ve açık alanın marjı veya merkezinde harcanan hayvan hareketleri, zaman ve mesafe mesafe, hem de davranış 25 yetiştirme. <ol><li> İlk gün, tuzlu enjeksiyondan sonra sınamak <ol><li> Hayvanlar tartılır. </li><li> Periton boşluğu içine bir tuzlu su çözeltisi (1 x PBS) 1 ul / g vücut ağırlığı enjekte edilir. </li><li> Sağ enjeksiyonundan sonra, açık alana hayvan koymak ve TruScan sistemin ölçümü başlatın. 15 dk An için rekord 3 x 5 dk bölüme verileri bölmek. </li><li> Geri eve kafese hayvan koymak. </li></ol></li><li> Amfetamin enjeksiyon İkinci gün, testi <ol><li> Hayvanlar tartılır. </li><li> Intraperitoneal, 0.5 mg / ml amfetamin çözeltisi 1 ml / g vücut ağırlığı enjekte edilir. </li><li> Enjeksiyon açık alana hayvan koymak ve TruScan sistemin ölçümünü başlatmak hemen sonra. 15 dakika için rekor ve 3 x 5 dk bölüme verileri bölmek. </li><li> Onun ev kafesine hayvan dönün. </li></ol></li><li> Lokomosyonu ve belirli Tru Scan yazılımı tarafından üretilen yetiştirme davranışlarını analiz. Graphpad (Prizma) ile Grafikler oluşturma ve SPSS İstatistik yazılımı tarafından istatistikleri hesaplar. </li></ol>

<ol>
	<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8.">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E16+Rat+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+Electroporation+followed+by+Primary+Neuronal+Culture+for+Studying+Gene+Function+in+Subset+of+Cortical+Neurons.">In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).</li><li>Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155 (2002).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).</li><li>Young-Pearse, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+function+for+beta-amyloid+precursor+protein+in+neuronal+migration+revealed+by+in+utero+RNA+interference.">A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).</li><li>Niwa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+DISC1+by+in+utero+gene+transfer+disturbs+postnatal+dopaminergic+maturation+in+the+frontal+cortex+and+leads+to+adult+behavioral+deficits.">Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits.</a> Neuron. 65, 480-489 (2010).</li><li>Sapir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+balance+of+the+polarity+kinase+MARK2/Par-1+is+required+for+proper+cortical+neuronal+migration.">Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).</li><li>Weinberger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neuropathology+to+neurodevelopment.">From neuropathology to neurodevelopment.</a> Lancet. 346, 552-557 (1995).</li><li>Murray, R. M., Lewis, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+schizophrenia+a+neurodevelopmental+disorder?.">Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder?.</a> British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).</li><li>Kamiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+schizophrenia-associated+mutation+of+DISC1+perturbs+cerebral+cortex+development.">A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development.</a> Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).</li><li>Miyoshi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted-In-Schizophrenia+1,+a+candidate+gene+for+schizophrenia,+participates+in+neurite+outgrowth.">Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth.</a> Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+in+schizophrenia+1+regulates+neuronal+progenitor+proliferation+via+modulation+of+GSK3beta/beta-catenin+signaling.">Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling.</a> Cell. 136, 1017-1031 (2009).</li><li>Millar, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia.">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li><li>Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted-in-Schizophrenia+1+(DISC1)+is+necessary+for+the+correct+migration+of+cortical+interneurons.">Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).</li><li>Niwa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+DISC1+by+in+utero+gene+transfer+disturbs+postnatal+dopaminergic+maturation+in+the+frontal+cortex+and+leads+to+adult+behavioral+deficits.">Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits.</a> Neuron. 65, 480-489 (2010).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+as+a+tool+for+genetic+manipulation+in+vivo+to+study+psychiatric+disorders:+from+genes+to+circuits+and+behaviors.">In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors.</a> The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. , 169-179 (2012).</li><li>Bai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex.">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 41, 335-344 (1999).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphetamine-induced+sensitized+state+as+a+model+of+schizophrenia.">The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia.</a> Progress in Neuro-psychopharmacology &amp; Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).</li><li>Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociating+effects+of+cocaine+and+d-amphetamine+on+dopamine+and+serotonin+in+the+perirhinal,+entorhinal,+and+prefrontal+cortex+of+freely+moving+rats.">Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats.</a> Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li></ol>

Bu çalışmanın yazarları, bu çalışmada mali ilgi yok ve bu çalışma için endüstrisi tarafından desteklenen edilmemiştir. Açık erişim ücreti PerkinElmer Inc sonrası yayın ile katkıda bulunmuştur.

Çalışmamız IUE nöronların beyin seçici bir alanda bir transgen ifade eden ve bu müdahalesinin bir sonucu olarak, bu hayvanlar yapılan manipülasyon işlevselliğini gösteren davranış değişiklikleri gösteren yetişkin fareler üretmek için uygun olduğunu göstermektedir. Bu çalışmada, bir örnek olarak, prefrontal kortekste küçük bir kısmında, tek taraflı DISC1 aşırı ifade eden fareler amfetamin karşı aşırı duyarlılık (Şekil 9) göstermektedir. In vivo görüntüleme biyolüminesans ile elektroporasyon başarı için fareler seçme IUE hücre transfeksiyon doğal değişkenlik kontrol edilmesinde etkili olduğu ve daha sonraki incelemeler için düşük denekler arası değişkenlik homojen IUE alana sahip gruplar elde etmek için uygulanmıştır. Bu çalışmada, biz Tho bile, yeni doğan hayvan ko-elektroporate GFP-uyarılan floresan tespiti ile çöp itibaren Electroporated yavrular seçmek koyamadıköf, aynı zamanda ve aynı hayvanda eşit eş elektroporate lusiferazın bir biyoışıldama sinyal luciferase enjeksiyon (Şekil 6) sonra tespit edilebilir, ve nöronlar ifade GFP altı aylık yaşta hala beyin mevcuttu. Biz, sıçan, lusiferaz / lusiferin Reaksiyon başarılı elektroporasyona beyinleri ile hayvanlar (Şekil 3) ayırt etmek için çok uygun olduğu sonucuna varılmıştır. IUE başarı kantitatif kontrolü aynı maruz kalma süresi (Şekil 3) içinde fotonların sayısı ile ölçülür ve ortak tanımlanmış lusiferaz enzimatik aktivitesine karşılık gelir biyoışıldama sinyalinin gücü ile ilgilidir. Küçük biyoışıldama sinyalleri 6 aylık sıçan beyninde histolojide ~ 1x10 4 fotonlar / sn / cm 2 / steradyan göstermek 1,000-2,000 GFP-boyanmış hücrelerin bir parlaklık ile, foton sayıları 100-200 tarafından saptanabilen ve. Yüksek sinyal dispbir ışıltısını koydu ~ 5x10 6 fotonlar / sn / cm 2 / steradyan ve ~ 64.000 sayıları kadar. Kullanılan Sprague Dawley fare suşu olarak, artan yaşla birlikte uzunlamasına biyoışıldama sinyalin zayıflamasına gözlenen ve sinyal P35 yaşına (Şekil 4) ötesine kayboldu. Bu noktada, lusiferazın geçici, plazmid vektör tabanlı ekspresyon ya da azaltır, ve biyoışıldama sinyal nedeniyle artan beyin kitle, veya her ikisi de yok olan sinyal için nedenleri için zayıfladıkça olup olmadığını bilmek yoktur. Yetişkin farelerde, bu fonksiyonel deneyi için, davranış çalışmaları için seçim sadece sinyalin yere göre yapılan, ancak bio-sinyal gücüne göre edildi. 3D niceliksel biyolüminesans izlenmesi farklı elektroporate alanlarda (Şekil 5) arasındaki farklılaşma izin olsa da, onun titizlikle derinlik kuruş bulunan hücreler için sınırlıBeynin nsion. Şekil 6 2D ve 3D resimde biyoışıldama ölçüm elektroporasyon iyi bir konumlandırma belirtilen bir hipokampal elektroporasyon bir örneğini göstermektedir. Parçalara ölüm sonrası beyinde, bir GFP floresans sinyali hipokampusun doğru hedefleme gösteren, biyoışıldama sinyali ile aynı konumu hakkında tespit edildi. Ama histoloji gösterileri de hipokampus korteks dorsal hücreler (Şekil 7) hedef olmuştu. Bu biyoışıldama deney olumlu, İEÜ yavrular tespit etmek ve aynı zamanda Electroporated alanının bir fikir var, ama, sonuçta, görüntüleme tam olumlu hedeflenen hücrelere lokalize otopsi histoloji yerini alamaz yararlı bir araç olduğunu göstermektedir. Bizim gösteri c sapmaları simülasyonu hipokampal, kortikal ya da beyin bölgelerinin ince hedef manipülasyonlar oluşturmak için IUE teknolojinin uygulanması için söz gösterirortical göç veya yetişkin hayvan etkileyebilecek diğer nörogelişimsel kusurlar. İkili elektroporasyon 26 davranışı üzerinde olası bir daha büyük bir etki avantajına sahip olmakla birlikte, embriyoların daha fazla ölüm oranı da vardır. Tek taraflı tek taraflı bir elektroporasyon, küçük bir bölgede daha IUE manipulasyon davranışı değiştirmek için yeterli olduğunu göstermek için bir iç kontrol olarak tek, hem de sahip iki hemisfer karşılaştırmak amacıyla seçildi. Nöronlar arasındaki bağlantı ya da mimari IUE kaynaklı değişimler, uygun bir davranış testi ile bir lezyon ve-olduğu-IUE-manipüle bölgenin istenen maç uyandırma olmadan indüklenebilen bilimsel söz bağlıdır. Sorun giderme İndirimli DKBKS İEÜ yavruların hayatta artan ilgili çeşitli öneriler vardır. İlk olarak, elektroporasyon sırasında çok ince cam kılcal damarların kullanılması doku lesio en aza indirmek amacıylan tavsiye edilir. İkincisi, her uterus boynuzu vajinal sonunda ilk embriyo electroporate yok: ilk doğan embriyonun ölümü diğer tüm embriyoların bir iptale şansını artırır. Üçüncü olarak, doğumdan sonra, anne fareler nedeniyle sık sık perinatal stres onların döl kısmını öldürür. Ek stresi azaltmak için, doğumdan hemen sonra canlı görüntüleme ile başlar, ama yedi gün boyunca bekleyin. Yavruların-GFP floresans saptama Bir hafta doğumdan sonra, IVIS Spektrum canlı binoküler floresan mikroskopik görüntüleme veya floresan görüntüleme kullanarak ya floresan sinyal (epifluorışıma ve transfluorescence modları; GFP uyarma / emisyon için: 465/520 nm ve 500/540 nm). Bu, derinin kafatası ve yüksek otofloresan arka plan gibi doku ile kısa dalga boyu uyarım ve emisyon ışık iletimi sınırlı azalan altında floresan kullanarak engellemek hem de mümkündürSıçan koşulları ribed. Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi, canlı bir hayvanda lusiferaz sinyali de (kafatası olmadan) kesilir beyinde tespit edilebilir ve burada, aynı zamanda, bir floresan sinyali (Şekil 6D) tespit edilebilir. Yakından aralıklı beyin bölgelerinde biyolüminesensin Farklılaşma Hatta 3D resimde biyoışıldama alanının konumu% 100 tahmin edilemez. Ya da tahmin edilen alanın altında üstünde özellikle hücreler de yanlışlıkla hedef ve transfekte edilebilir. Kesin konum (bkz. Şekil 7) ölüm sonrası (floresans) histoloji tarafından kontrol edilmelidir.

Bu göreli kolaylıkla nöro okuyan etkin yana gelişen beyinde gen ekspresyonunun modüle edilmesine izin verir, bir in utero elektroporasyon (IUE) yöntemi geliştirilmesi, bir ara-ile olmuştur. Bir hedef genin ekspresyon seviyelerindeki değişiklikler 1-7 kemirgenlerde embriyonik ve / veya perinatal gelişim sırasında belirli bir beyin bölgesi etkisi nöronal proliferasyon, göç, arborization ve bağlantı eleştirel bir gösterildi. 8-10 Şizofreni nöro anormallikler 11, 12 ve bu nedenle şizofreni için belirlenen aday genlerin çoğu için, örneğin olduğu gibi, nörolojik gelişim üzerindeki potansiyel modüle etkileri incelenmiştir ile ilgili olmuştur akut ve kronik semptomlar ile karmaşık bir ruhsal hastalıktır kesintiye uğramış-in-şizofreni -1 (DISC1) geni 13-15. Beyin gelişimi regulat olduğunupre-, peri-ve postnatal gelişim dönemlerinde rol oynar genetik faktörler ve çevre ile olan etkileşimleri tarafından ed. Çeşitli davranış bozuklukları için önemli bir risk faktörü genetik fareler 13, 17 göç kusurlarına DISC1 16 gen. DISC1 demonte yol açar ve İEÜ tarafından gelişmekte kortekste DISC1 ifade manipülasyon yetişkin farelerde 18 davranışını etkisi gösterilmiştir. İEÜ tarafından beyin gen ifadesini kurgulama çeşitli avantajlar transgenik hayvanların nesil üzerinde 19 vardır. İlk olarak, ilgi alanları içinde gen ekspresyon aydan ziyade transgenik kemirgen hatları ıslah birkaç nesillere hafta içinde elde edilir. İkincisi, germ-mühendislik hayvanlarda 20 fenotipleri kalkan olabilir erken gelişim döneminde telafi edici mekanizmalar kaçınılmalıdır. Yalnızca belirli bir hücre popülasyonu veya beynin belirli bir alan, Migrati hedef aracılığıyla, Thirdveya çoğalması farklar doğrudan olmayan mutant ile karşılaştırıldığında ya da tek taraflı electroporations seçilir ise kontralateral tarafı kontrol edilebilir. Öte yandan, IUE promotör-tahrikli cre / lox kaynaklı ifade zamanlaması ve belirli bir alanda, hücrelerin sadece bir alt gen sentezleme modelinin bir mozaik tür lider hedeflenmektedir doğruluğunu sahip değildir. Kararlı, tohum çizgisi transgenik kemirgen en önemli avantajı, göz ardı edilebilir, böylece erişkin kemirgenlerde birçok deneysel uygulamalar için, bir beyin bölgesinde hücre sınırlı sayıda geçici transfeksiyon yeterli, ya da arzu edilen olabilir. Aslında, İEÜ bazı anormal gelişmiş hücreler hücreleri veya devrenin tüm ağı etkileyebilir olup olmadığını araştırmak için yararlıdır. Diğer bir avantajı nedeniyle hit mozaik doğaya bir genin olmayan bir hücreye otonom etkilerini göstermek için yeteneği olabilir. Ayrıca, transgenik ve nakavt farelerin üretimi emekleme ve hala kullanımdaanormal beyin gelişimi sonuçları incelemek için bu türün İEÜ yüksek ilgi olduğunu. Şimdiye kadar, bu gibi yetişkin hayvanlarda müdahale sonuçlarını inceleyen İEÜ kullanmanın önemli bir engel izleme elektroporasyon başarı eksikliğidir. Şimdiye kadar, canlı Yenidoğan sıçan yavrularının uygun bir binoküler flöresanlı bir mikroskop altında ya da IVIS Spectrum floresan görüntüleme ile tespit edilemedi floresan nöronlar GFP-ko-transfekte edildi. Bu engeli aşmak için, bir lusiferaz raportör geni ile ko-transfekte IUE beyin bölgesinin 3 boyutlu (3D) miktar ölçümleri ile yavruların biyoluminesans canlı görüntüleme gerçekleştirilir. Nöro genetik manipülasyonu, sıçan embriyo lateral ventrikül içine, insan DISC1, lusiferaz ve GFP ihtiva eden plasmidlerin bir birlikte-enjeksiyon test sonraki bir fonksiyonel deneyde bu yöntemin uygulanabilirliğini göstermek için bir örnek olarak <subir cımbız elektrot ile elektroporasyon, ardından p&gt; 3 uygulandı. Floresan sinyalleri in vivo doğum sonrası aşamada tespit edilememiştir da, ko-transfekte lüsiferaz geni ile lusiferin metabolizmasından elde edilen katı bir biyoışıldama sinyal doğumdan sonraki beş hafta kadar saptandı. Yetersiz veya yanlış elektroporasyon ile yavrular İEÜ hayvanların atamasını sağlayan, böylece, baştan belirlenen (ilgi gen ve kontrol şifreli) düşük değişkenlik eşleşti elektropore beyin alanları ile deneysel grupta edildi sayede elektroporate beyin alanı izin nicelikleme 3D ölçümleri . Davranışsal paradigmalar yetişkin İEÜ farelerin kullanımı bu protokolün kullanışlılığı bir örnek olarak gösterildi.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>without calcium, without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, sodium salt</td>
			<td>SynChem OHG, Germany</td>
			<td>BC218</td>
			<td>CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>CAS: 2353-45-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Amphetamine</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>A 5880</td>
			<td>CAS: 51-63-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kodan Tinktur forte</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH, Germany</td>
			<td>104 005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material / product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Novato, California, USA</td>
			<td>borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Tujunga, California, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrode</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>7 mm in diameter platinum disc electrodes (<a href="http://www.sonidel.com/product_info.php?products_id=129" target="_blank">CUY650P7</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Straight, 12 cm (14002-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave pulse electroporator (CUY21SC)</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>(CUY21SC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl surgical suture material</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Norderstedt, Germany</td>
			<td>3-0; 2 Ph. Eur;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip Applicator</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Reflex 9 mm (12032-09)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Darmstadt, Germany</td>
			<td>0.45 &#956;m cellulose acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>Caliper Life Science / PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, MassachusettsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, Massachuset tsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-field</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td>(40 x 40 x 39 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru Scan activity system</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="4">Table of recipes</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Number</td>
						<td>Buffer name</td>
						<td>Content</td>
						<td>Comments </td>
					</tr>
					<tr>
						<td>1</td>
						<td>DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing</td>
						<td>1.5 &#956;g/&#956;l pCAX humanDISC-1, 
						0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 
						10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixture are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>2</td>
						<td>DNA-Mixure for control</td>
						<td>0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA1, 0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA2, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixure are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>3</td>
						<td>Fast green Dye</td>
						<td>10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>4</td>
						<td>D-luciferin solution</td>
						<td>15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>5</td>
						<td>Amphetamine solution</td>
						<td>0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of topically transgenic rats by in utero electroporation and in vivo bioluminescence screening

Utero elektroporasyon (IUE) nöronal gelişimi araştırmak için beyindeki hücrelerin genetik değişimine izin veren bir tekniktir. Şimdiye kadar, bir yetişkin beyinde davranış veya nevropatolojisi araştırmak için İEÜ kullanımı postnatal hayvanlarda non-invazif teknikler ile IUE transfeksiyon başarı izlenmesi için yetersiz yöntemlerle sınırlıdır. Bu çalışma için, E16 sıçanlar İEÜ için kullanıldı. Embriyoların içine nükleik asitlerin intraventriküler enjeksiyonundan sonra, cımbız elektrot yerleştirme gelişmekte korteks veya hipokampus ya da hedefleme için çok önemliydi. Ventriküler ko-enjeksiyon ve 3D yazılım ile bir miktar IVIS Spectrum cihazı kullanılarak, doğum sonrası in vivo biyoışıldama ile anestezi canlı yavru P7 intraperitoneal lusiferin enjeksiyondan sonra, transfekte edilmiş hücrelerin bir lusiferaz gen izin izlenmesi, elektroporasyonu. <pbiyolüminesans ile class = &quot;jove_content&quot;&gt; Alan tanımı açıkça kortikal ve hipokampal electroporations arasında ayrım ve doğumdan sonra 5 hafta kadar zaman içinde uzunlamasına bir sinyal tespit olabilir. Bu görüntüleme tekniği bize 3 aylık yaştan davranışsal araştırmaları gerçekleştirmek için, daha sonra, biyolojik etkilerini tetikleme ve gerekli kabul transfekte hücrelerin yeterli sayıda yavrular seçmek için izin verdi. Bir örnek olarak, bu çalışmada sıçan korteks içine insan tam uzunlukta bir gen ile DISC1 IUE amfetaminin aşırı-duyarlılığa yol açtığını gösterir. Co-GFP ile transfekte doğumdan sonraki 6 ay ≥ mevcut gen ekspresyonunu gösteren cryosections post mortem floresan mikroskobu ile nöronlarda tespit edilebilir. Biz doğum sonrası biyolüminesans görüntüleme sıçanlarda İEÜ ile geçici transfeksiyonlarının başarısını değerlendiren olanak sonucuna varıldı. Neurodevelopmen sırasında topikal gen manipülasyon etkisi üzerinde araştırmalaryetişkin beyin ve onun bağlantısı t büyük ölçüde kolaylaşır. Birçok bilimsel sorular için, bu teknik takviyesi ya da transgenik farelerin kullanımının yerini ve davranışsal nörobilim için yeni bir teknoloji sağlayabilir.

<html> Şekil 3, 150 mg lusiferin / kg vücut ağırlığı arasında, enjeksiyondan sonra, P7 az üç sıçan yavrularının görüntüleme ölçümleri canlı. İEÜ verimliliğindeki değişkenlik gösteren sinyal gücü farklar görülebilir. Güçlü biyolüminesans sinyaller P36 (Şekil 4) kadar kaydedildi. Şekil 5&#39;de, biyolüminesans görüntüleme kortikal (Şekiller 5A ve 5C) ve hipokampal (Şekil 5B ve 5D) elektroporasyon tanımlama yeteneği tasvir edilmiştir. Kafatası kaldırma (Şekil 7B) ve P14 da cryosectioned beyin (Şekil 8) karşılık gelen GFP-Elektroporasyona tabi tutulan hücrelerin sonra floresan sinyali ile biyoışıldama sinyali (Şekil 7) arasındaki korelasyon, Şekil 6-8 de gösterilmektedir. Not, orada hiçbir herhangi bir zaman noktasında, canlı farelerde bir floresan sinyalinin tespiti. çadır &quot;&gt; in vivo görüntüleme biyoışıldama gösterilen örneklerde. 2B, farklı Elektroporasyona beyin alanlarında yaklaşık ayrımı büyük ölçüde 3D ​​görüntüler (Şekiller 5C ve 5D) üreten IVIS Spectrum yazılımın DLIT programı ile artırıldı (Şekil 5A ve 5B) sağlar , prefrontal korteks ve hipokampus elektroporasyon ayırt edilebilir. Bu hipokampus electroporate hedeflerken, hipokampus korteks yalan dorsal için bazı progenitör hücreler de (Şekil 7) isabet edilebilir olduğu unutulmamalıdır. Tek taraflı rahimde, korteks içine pCAX vektör ile elektropore ve ardından tam uzunlukta bir insan DISC1 aşırı ifade eden fareler yetişkin olarak spontan ve amfetamin ile endüklenen hiperaktivite hem de incelenmiştir. PCAX-Disc1 ile elektropore edildi sıçanlar amfetamin düşük doz aşırı duyarlı idi. Bu fareler önemli ölçüde mo taşınanYeniden sonra tuzlu su enjeksiyonuna göre daha amfetamin tedavi sonrasında ise kontrol hayvanları (Şekil 10) vermedi. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig1.jpg" /> Şekil 1. A) korteks elektroporasyon ve B) hipokampal elektroporasyon için elektrot konumunu düzeni, yeşil = ventrikül içindeki DNA-Mix enjekte. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig2.jpg" /> Şekil 2. Lusiferaz reaksiyon. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig3.jpg" /> Şekil 3,. / Kg vücut ağırlığı luciferine 150 mg enjeksiyonundan sonra P7 farelerin lüminesans ölçümü; maruz kalma süresi 180 saniye; hiçbir ışık yayılması sinyali A) sıçan, B) fare<html> zayıf biyolüminesans sinyal ile, güçlü bir lüminesan sinyal ile C) sıçan. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig4.jpg" /> Şekil 4. IUE başarı tespit edilebilir büyük bir zaman penceresini gösteren 150 mg / kg luciferine enjeksiyonundan sonra aynı sıçanın arka arkaya biyoışıldama ölçümlerinin saat hattı. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig5.jpg" /> Hipokampus B) &amp; D). C) &amp; D) 3D resimler;; korteks A) ve C). P7 A) &amp; B kortikal ve hipokampal elektroporasyon arasındaki farklar) 2D resim Şekil 5 İllüstrasyon.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg &quot;&gt; büyük rakam görmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig6.jpg" /> Şekil 6,. P14 A bir sıçan yavru E16 hipokampal elektroporasyon) biyolüminesens B 2D-resim) biyoışıldama sinyal C 3D resimde) İllüstrasyon biyoparlaklık sinyali D) beyin GFP epi-floresan sinyali ile birlikte beyin disseke. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146fig6large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig7.jpg" /> Şekil 7. GFP ihtiva eden plasmid ve lusiferaz ile elektroporasyona aynı P14 fare beyni bir 20 um cryo bölümünden bir floresan resmin Detayvektör, DAPI ile çekirdekler boyama; CA1-3 = Cornu ammonis 1-3; DG = kıvrımlarının; FC = Fasciolarum cinereum. Video 1. Bir hipokampus 3D animasyon P14 de sıçan elektropore. <img alt="Şekil 8," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig8.jpg" /> Şekil 8,. Amfetamin testi şeması: ilk gün serum fizyolojik enjeksiyonu 15 dakika duruşmadan önce, 24 saat sonra amfetamin açık alanda odasında test etmeden önce enjeksiyon. <img alt="Şekil 9," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig9.jpg" /> Şekil 9,. Amfetamin testi. . Gri çubuklar = DISC1 aşın grubu; kontrol grubu n = 10; 15 dk Beyaz çubuk = kontrol grubu üzerinde bir TrueScan sistem tarafından kaydedilen hayvanın (cm) kaydırabilir mesafeyi gösteren bar grafiği DISC1 overekspresyonu grubu n = 11; ANOVA: soykırımından * tedavi p = 0.043; amfetamin ns vs toplam süre tuzlu = değil önemli Pcontrol = 0.172, pDISC1 = 0.001 T-Testi.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening at JoVE.com

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genler yetişkin hayvanlarda davranış veya nöropatoloji sonraki çalışmalar için nöronal bağlantı hızlı ve hedeflenen değişiklikleri mümkün kılmak için, E16 de utero elektroporasyon (IUE) in ile korteks veya sıçanın hipokampusun gelişimi sırasında manipüle edilebilir. IUE başarı kontrolü için in vivo görüntüleme doğum sonrası ko-transfekte edilmiş lusiferaz aktive biyolüminesans ile gerçekleştirilir.

Topikal Transgenik Rats nesil tarafından<em&gt; Utero</em&gt; Elektroporasyon ve<em&gt; In vivo</em&gt; Biyoparlaklık Eleme

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

generation-topically-transgenic-rats-utero-electroporation-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

13.4K Görüntüleme.  Medical School Düsseldorf.  Genler yetişkin hayvanlarda davranış veya nöropatoloji sonraki çalışmalar için nöronal bağlantı hızlı ve hedeflenen değişiklikleri mümkün kılmak için, E16 de utero elektroporasyon (IUE) in ile korteks veya sıçanın hipokampusun gelişimi sırasında manipüle edilebilir. IUE başarı kontrolü için in vivo görüntüleme doğum sonrası ko-transfekte edilmiş lusiferaz aktive biyolüminesans ile gerçekleştirilir. 

Video: Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Nörobilim

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.