Bu eser HY bir Ehrman burs tarafından desteklenmiştir. H., DV, JR bir New York Üniversitesi Dekan Tez CD DJ Bursu, NIH GrantR01 EY13010 ve DFG bursu için RJJ, NIH hibe F32EY016309 Medical Research doktora sonrası dostluk için bir Jane Tabut Childs Memorial Fonu (RI 2208/1- 1). Biz el yazması üzerinde yorum yapmak için Nina Vogt ve Pamela Boodram ederim.

1. Giriş Üçüncü dönem larva, midpupal ve yetişkinlik evresi: Bu video, biz üç tanımlanan gelişimsel dönemlerinde retina diseksiyonu ve immünohistokimya yöntemleri açıklanmaktadır. Bizim protokol aynı zamanda diğer pupa aşamalarında (önceki aşamalarında ilgili ayrıntılar için, 16) için çalışıyor olsa da tek bir odak düzlemli ve onların çekirdekleri tüm PR ve görüntülenmesini kolaylaştırır, hangi kolayca tanımlanabilir görüntüleme için optimum olduğu gibi, biz, midpupal sahne seçti transkripsiyon faktörü ekspresyonu. Geç pupa retinanın diseksiyonu yetişkin retinanın diseksiyonu çok benzer. İlk olarak, istenilen safhalarında larva ve pupa toplamak için nasıl gösterilmektedir. Sonra, larva 17-18 midpupal ve yetişkin retina optimal diseksiyonları edinme açıklar. İkincisi, immünohistokimyasal ve konfokal mikroskopi kullanılarak bu aşamada PR gelişimi görselleştirmek nasıl gösterilmektedir. Böceklerin gelişim dönemi sıcaklığa bağımlıdır. Larva ve pupa arasında tekrarlanabilir evreleme kolaylaştırmak için, biz 12 saat/12 saat aydınlık / karanlık döngüsü altında 25 tüm sinek stokları ° C yükseltilmesi önerilir. Üçüncü evre larvalar: 96 Hakkında yumurtlama sonra saat (25 ° C&#39;de), geç Üçüncü dönem larva durağı beslenme ve sonunda pupa gıda flakon, duvarlarında dolaşmaya. Yavaşça gıda flakonun duvarına bir dolaşıp üçüncü evre larva kaldırmak için yumuşak bir fırça veya bir forseps kullanın. En az% 50 pupa (&#39;midpupae&#39;) pupa devresi sonra yaklaşık 48 saat gözlenmiştir. Kesin zamanlama için, gıda flakon bir işaretleyici ile sadece biçimli beyaz pupa daire. Alternatif olarak, düzgün bir sahneleme flakon (morfolojik kriterler kullanarak pupası evrelemesi için, 19) elde etmek için yeni bir flakon tüm beyaz pupa taşıyın. Sonra 48 saat, dikkatle rembir forseps kullanarak flakondan midpupae ove. Yetişkin sinekler: Bir CO 2 pad üzerinde uyutmak genç yetişkin sinekler (2-5 gün eclosion sonra). Bir forseps kullanarak kafaları çıkarın ve bir bardak saklayabilirsiniz de soğuk 1x PBS içeren çanak. 3. Diseksiyon Prosedürü (Deney başına 1-2 Hakkında hr) Örnek topladıktan sonra, bir Sylgard diseksiyon çanak soğuk PBS bir damla koyun. Genotip başına 10-15 retinaları hakkında teşrih. Reaktifler ve ekipman doğru kullanımı için Malzeme Güvenlik Bilgi Formları yanı sıra kurum Çevre Sağlığı ve Güvenliği Ofisi (bu protokolün sonunda tabloya bakın) danışın. 1. Larva Göz hayalsel Diskler <ol><li> Ağız kanca içeren larva, ön sonuna bulun. Sylgard çanak tabanı nazikçe larva orta kısmına basın bir forseps kullanın. Anoth kullanıner ağız kanca kapmak ve vücuttan hafifçe ve yavaşça çekin forseps. Gövde, ana kısım atılır ve beyin bağlı kalmasını hayali diskler, harici dokulardan çıkarmak için ön kısmı tutmak için ağız parçaları kullanır. </li><li> Üç sıra cam tabak 1x PBS bir forseps ile ağız kanca kapma hayali diskler ile beyin aktarın. Fiksasyon adımı (adım 4.1.) Gerçekleştirin. </li><li> Tespit edildikten sonra, yağ dokusu tükrük bezleri kaldırmak ve göz antennal hayalsel disk uzak beyin çekin. &#39;Zor&#39; antikorların erişilebilirliğini artırmak için, epitel yüzeyinde bulunan peripodial membran, diskin anten kısmını basılı tutarak ve bir diseksiyon iğne ile uzak membran soyulması ile kaldırılabilir. Sonraki, immünohistokimyasal (adım 5.1.) Gerçekleştirin. </li></ol> 2. 50% pupa devresi / Midpupal retinaları <ol><li> Bir forseps ile pupa davanın posterior ucundan tutun.Yavaşça başka bir forseps ile manikür kapma pupa halinde ön yüzeyi kaldırmak ve yavaş yavaş puparium uzağa çekin. Peel uzakta kafa maruz kalan kütikül. </li><li> Delmek dorsal anterior bölgede yatan, yumuşak çuval forsepsi &#39;ipuçlarını kullanın. Bu kafa erişim sağlar. Yavaşça yavaşça P20 pipet ile kafasını emerek torakstan başını ayırın. Taze soğuk 1x PBS içine pipet, baş kovduktan aşırı doku kaldırmak; baş manikür kapmak ve hortum çıkarın. Fiksasyon adımı (adım 4.1.) Geçin. </li><li> Sürekli doku bir diseksiyon iğne ile Pierce optik lob. Lamina ve lamina / optik lob retinanın ayrılması retina arasındaki diğer kesme pimini takın. Immünohistokimyasal (adım 5.1.) Gerçekleştirin. </li></ol> 3. Yetişkin Gözler <ol><li> Bir forseps ile posterior kafa kapsül merkezinde tut ve ağız parçaları (hortum), yağ tiss kaldırue ve trakea. </li><li> Tek bir forseps ile dorsal baş manikür tut ve hafifçe yanlara doğru çekerek beyin dokusundan gözleri ayırmak için diğer kullanın. Çoğu durumda, tabaka, beyin nöropil bir ince, şeffaf kılıf, retina bağlı kalacaktır. Bu tespit sonrası lamina kaldırmak daha kolaydır. </li><li> Göz marjdaki kütikül çıkarın, ancak farklı çözümler retinanın transferini kolaylaştırmak için arkasında küçük bir parça bırakın. (Adım 4.1.) Fiksasyon gerçekleştirin. </li><li> Bir forseps ile bir tarafında o kapma ve yavaşça retinanın bozmadan diğer forseps ile yanlara çekerek lamina çıkarın. Bu montaj sırasında retina üzerine katlayın olabilir gibi, rezidüel manikür çıkarın. Bu iki adım aksi lamina tarafından engellenir ve görüntüleme işlemi sırasında kütikül kalır olacaktır fotoreseptör, görselleştirme için kritik öneme sahiptir. Immünohistokimyasal (adım 5.1.) Geçin. </li></ol> 4. Fiksasyon ve Washing (Hakkında 1 saat) <ol><li> Taze (1x PBS, buz üzerinde girdap ve mağaza 360 ul% 37 formaldehit solüsyonu 40 mikrolitre sulandırmak) fiksatif hazırlanırken buz üzerine yerleştirilir üç sıra cam tabak 1x PBS disseke retinaları saklayın. Biz fiksasyon protokolü ile devam etmek ve buz (&gt; 15 dk) uzun saklama süreleri önlemek için tavsiye. </li><li> % 3,7 formaldehit solüsyonu 200 ul 1x PBS değiştirin. Doku fiksatif batmış olduğundan emin olun. Aksi takdirde düzgün sabit olabilir gibi bu önemlidir. Gerekirse, forseps ile hava kabarcıklarını çıkarmak ve trakea. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karıştırma cihazı üzerinde inkübe edin. </li><li> 1x PBS ile fiksatif değiştirin ve 1x PBS ile iki kez yıkayın. 30 dk (çalkalayıcı üzerinde, oda sıcaklığında) PBS içinde yıkama devam edin. </li><li> PBST ile PBS değiştirin. PBST ile iki kere yıkayın. </li><li> Larva göz diskleri (3.1.3.) Ve midpupal / yetişkin retina gelen laminalar gelen peripodial zarı çıkarmadan devam edin &lt;strong&gt; (3.2.3., 3.3.4.). </li></ol> 5. İmmünohistokimya <ol><li> Engelleme: Oda sıcaklığında karıştırma cihazı üzerinde, 20 dakika için PBST ile inkübe retina% 5, normal serum ve 200 ul PBS ile değiştirin. </li><li> Primer antikor çözümü engelleme çözümü değiştirin. Parafilm ile üç kuyu çanak mühürleyin ve oda sıcaklığında karıştırma cihazı üzerinde, gece boyunca inkübe edilir. </li><li> PBST ile çözüm değiştirin ve 3 kez yıkayın. Oda sıcaklığında karıştırma cihazı üzerinde, 1 saat arasında, en az PBST ile yıkama devam edin. </li><li> Gece boyunca oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde parafilm-mühürlü cam sıra çanak sekonder antikor çözüm ve inkübe Transfer. </li><li> PBST ile antikor çözüm değiştirin ve üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında karıştırma cihazı üzerinde, bir saat arasında, en az PBST ile yıkama devam edin. Numuneler, birkaç gün için PBST içinde tutulur ama kurumasını önlemek için en az bir gün başına bir defa PBST taze eklemek için kritik olabilir. </li></ol> 6. Mounting <ol><li> Larva ve midpupal retina montaj için, temiz bir cam slayt merkezine retina aktarmak için P20 kullanılır. Aşırı PBST çıkarın. Görüntüleme kolaylaştırmak amacıyla retinaları hizalamak için bir forseps kullanın. </li><li> Retina üstüne orta montaj 10 ul ekleyin. Net oje ile 24x40-1 kapak kayma ve mühür ile onları hafifçe örtün. </li><li> Montaj yetişkin retina için, &#39;köprüler&#39; 20 hazırlamak: Bir tarafı cam her iki ucuna% 50 gliserol iki 5 ul damlacıkları ekleyin ve 22x22-1 kapak camları (kalın 0,13-0,17 mm) ile bunları kapatın. </li><li> Bir P20 pipet ile PBST çıkarın; retina kurumasına yok emin olun. Iyi orta montaj 20 ul ekleyin. &#39;Köprü&#39; cam slayt P20 ile retina aktarmak için montaj ortamı kullanın. </li><li> Yönlendirmek için bir forseps kullanın (lensler cam slayt bakmalıdır) ve görüntüleme kolaylaştırmak için retina hizalayın. Gerekirse, P20 ile hava kabarcıklarını çıkarmak. </li><li> Yavaş yavaşnet oje veya seloteyp ile üst ve conta kenarları bir tarafında yer 24x40-1 kapak kayma (kalın 0,13-0,17 mm). Mağaza numuneler 4 ° bir mikroskop lamı koruyucu kutusuna C (karanlıkta tutmak). </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Bu protokolün uygulanması için bir örnek olarak, video üç gelişim aşamalarında fotoreseptör farklılaşma görselleştirmek için temsili sonuçlar göstermektedir. Bir larva göz antennal disk ve midpupal retina gelişimini (Şekil 1A, B) sırasında farklı fotoreseptör tipleri etiket ve bir yetişkin retinanın iki fotoreseptör alt (Şekil 1C) görselleştirmek için iki rodopsin antikor ile boyandı antikorları ile boyandı.

<ol>
	<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li><li>Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+fly+retina.">Functional organization of the fly retina.</a> Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).</li><li>O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ninaE+gene+encodes+an+opsin.">The Drosophila ninaE gene encodes an opsin.</a> Cell. 40, 839-850 (1985).</li><li>Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structure+of+a+rhodopsin+gene+from+D.+melanogaster.">Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster.</a> Cell. 40, 851-858 (1985).</li><li>Rister, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+mosaics+of+opsin+expression+in+invertebrates+and+vertebrates.">The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates.</a> Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).</li><li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+Drosophila+opsin+reveals+specific+patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells.">Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells.</a> Neuron. 17, 1101-1115 (1996).</li><li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells+of+Drosophila:+evidence+for+induced+and+default+cell-fate+specification.">Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification.</a> Development. 126, 607-616 (1999).</li><li>Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rhodopsin+in+R8+photoreceptors+of+Drosophila:+evidence+for+coordinate+expression+with+Rh3+in+R7+cells.">A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells.</a> Development. 124, 1665-1673 (1997).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li><li>Roignant, J. Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc.">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).</li><li>Tsachaki, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+developmental+mechanisms+underlying+the+formation+of+the+Drosophila+compound+eye.">Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye.</a> Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).</li><li>Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+genetic+analysis+of+Drosophila+eye+development:+sevenless,+bride+of+sevenless+and+rough.">Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough.</a> Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).</li><li>Basler, K., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+cell+fate+in+the+developing+eye+of+Drosophila.">Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila.</a> Bioessays. 13, 621-631 (1991).</li><li>Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+fly+eye:+terminal+differentiation+events+of+the+retina,+corneal+lens,+and+pigmented+epithelia.">Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia.</a> Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).</li><li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system.">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li><li>Wolff, T., Sullivan, W. e. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+Techniques+for+the+Drosophila+Eye+Part+I:+Larva+and+Pupa.">Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes.">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li><li>Morante, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+staining+of+Drosophila+optic+lobes+at+different+stages+of+development.">Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging.">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).</li><li>Stowers, R. S., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+method+for+generating+Drosophila+eyes+composed+exclusively+of+mitotic+clones+of+a+single+genotype.">A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype.</a> Genetics. 152, 1631-1639 (1999).</li><li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics.">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127, 851-860 (2000).</li><li>Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+De-repression+of+Rhodopsins+in+Single+Photoreceptors+of+the+Fly+Retina.">Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).</li><li>Johnston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlocked+feedforward+loops+control+cell-type-specific+Rhodopsin+expression+in+the+Drosophila+eye.">Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye.</a> Cell. 145, 956-968 (2011).</li><li>Jukam, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+regulation+of+Hippo+pathway+by+Merlin/NF2,+Kibra,+Lgl,+and+Melted+specifies+and+maintains+postmitotic+neuronal+fate.">Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate.</a> Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).</li><li>Vasiliauskas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+from+rhodopsin+controls+rhodopsin+exclusion+in+Drosophila+photoreceptors.">Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors.</a> Nature. 479, 108-112 (2011).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

1. Sorun Giderme Bizim tecrübelerimize göre, diseksiyonlar uygulamada (birkaç haftaya kadar) gerektirir ve masada dirsek ve ön kol bekleterek ve parmak diseksiyon çanak ile temas rahat bir el pozisyonu 21 elde kolaylaştırılmaktadır. Bu şekilde, sadece başparmak, işaret ve orta parmakları ince hareketleri gerçekleştirin. Fotoreseptörler zarar vermeden lamina Çıkarma muhtemelen en zor adımdır. Lamina kırmızı göz pigmentasyon karşı ...

<table border="1"><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktif </td></tr><tr><td> (PBS1x, pH 7.4) ile tuzlu su, fosfat tamponlu </td><td> Sigma </td><td></td><td> 10x stok solüsyonu 20 hazırlayın. Oda sıcaklığında 1x PBS ve mağaza almak için distile su ile seyreltin. Diseksiyonlar önce buz üzerinde soğutun. </td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> 9002-93-1 </td><td> Dikkat: Tahriş edici eldiven giyin. Ile% 0.3 Triton X-100 (PBST). 50 ml 1xPBS hazırlanması Oda sıcaklığında saklayın. </td></tr><tr><td> % 37 formaldehit solüsyonu </td><td> Fisher Scientific </td><td> F75P1GAL </td><td> Dikkat: Toksik, muhtemel insan kanseri eldiven giyin. Fiksasyon adım önce, taze buz üzerine, PBS ile seyrelterek bir kimyasal davlumbaz mağaza% 3.7 solüsyon hazırlanır. </td></tr><tr><td> % 5, normal at serumu </td><td> Jackson Immuno Araştırma </td><td> 008-000-001 </td><td> PBST içinde% 5 v / v seyreltme hazırlayın. Dört derece saklayın. </td></tr><tr><td> Birincil ve ikincil antikorlar (örn. Donkey anti-koyun Alexa Fluor 488, Donkey anti-tavşan Alexa Fluor 555, Donkey anti-fare Alexa Fluor 647) </td><td> Invitrogen Moleküler Sondalar </td><td> A11015 A31572 A31571 </td><td> Dört derece PBST ve mağaza 1:800 sekonder antikor seyreltin. </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Phalloidin </td><td></td><td> A12379 </td><td> Sekonder antikor çözüm 1:100 seyreltin. </td></tr><tr><td> Slowfade Altın antifade reaktifi </td><td> Invitrogen Moleküler Sondalar </td><td> S36936 </td><td> Orta Montaj. -20 Derecede saklayın. </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fisher Scientific </td><td> G31-1 </td><td> Montaj için. Oda sıcaklığında distile su, mağaza ile% 50 seyrelme 10 ml hazırlayın. </td></tr><tr><td> CO2 </td><td></td><td></td><td> Ergin sinek anestezi için. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr><td> İki keskin forseps (Dumont # 55) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11255-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silikon Elastomer Takımı </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Sylgard karışımı ile bir plastik Petri kabı doldurarak Sylgard diseksiyon çanak hazırlayın. </td></tr><tr><td> Üç sıra cam diseksiyonu yemekler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-379 </td><td></td></tr><tr><td> Two minutien kesme pimler (0.1 mm çap) ve iki pinholders (12 cm) </td><td> Güzel Bilim araçları </td><td> 26002-10 </td><td> Iki pinholders her biri minutien pim ekleyin ve kanca oluşturmak üzere pimlerin bir viraj. </td></tr><tr><td> Mikroskop kapak slipi (22x22-1 ve 24x40-1) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop slaytlar (25x75x1.0 mm; precleaned) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-143 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lehçe veya seloteyp tırnak Temizle </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orbital çalkalayıcı </td><td> Bellco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Slayt tutucu kutusu </td&gt; <td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Bemis </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> İnce fırça </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> P20 ve P200 mikropipetler ve ipuçları </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Diseksiyon </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Buz ile Küçük kovası </td><td></td><td></td><td> Cam kuyucuğu, disseke retina ve çözümler soğutma için. </td></tr></table>

dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas

Drosophila melanogaster bileşik göz yaklaşık 750 küçük gözcüklerinin (birim göz) oluşur. Her bir ommatidium lens koni salgılayan hücreler, pigment hücreler, bir kıl hücresi ve sekiz fotoreseptör (PR) R1&#39;in-R8 2 de dahil olmak üzere yaklaşık 20 hücreleri oluşur. PRs ışığa duyarlı pigmentleri, Rhodopsins (RHS) içeren özel microvillar yapıları, rhabdomeres var. Altı PRS rhabdomeres (R1-R6) bir yamuk oluşturur ve RH1 3 4 içerir. R7 ve R8 rhabdomeres yamuk merkezi arka arkaya yerleştirilmiş ve ışık aynı yol paylaşırlar. R7 ve R8, PR stokastik olarak iki ana tipi 5 ST farklı kombinasyonlarını ifade eder: &#39;p&#39; tipinde, s R7s içinde RH3 p R8s içinde RH5 ile bağlanmaktadır, &quot;y&quot; alt tipinde, y R7s içinde RH4 ile ilişkili iken y RH6 6 7 8 R8s. PRs ve küçük gözcüklerinin gelişimi erken belirtimi larva göz antennal hayalsel disk, epitel hücre tek tabaka başlar. Farklılaşma dalgası diski 9 genelinde süpürür ve küçük gözcüklerinin 10-11 içine farklılaşmamış hücre montajı başlatır. &#39;Kurucusu hücre&#39; R8 ilk olarak belirtilen ve R7 12-14 R1-6 ve sonra acemi. Edilir Daha sonra, pupa gelişme sırasında, PR farklılaşma rhabdomere oluşumu, sinaptogenez ve sonunda rh ekspresyonunu içeren kapsamlı morfolojik değişiklikler 15, yol açar. Bu protokol, biz retina oluşumu ve gelişme yollarını ilgili çeşitli sorular ele uygulanabilir Retina gelişimi üç tanımlandığı dönemlerde, retinal diseksiyonu ve immünohistokimya yöntemleri açıklanmaktadır. Burada, bütün montaj larva, midpupal ve yetişkin retina (içinde tek hücre düzeyinde aşamalı PR farklılaşma görselleştirmek için bu yöntemleri kullanabilirsiniz <s&gt; Şekil 1) Trong.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas at JoVE.com

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

<em&gt; Drosophila</em&gt; Retina bir basmakalıp şekilde oluşturulan hücre tipleri az sayıda oluşan bir kristal kafes benzeri bir<sup&gt; 1</sup&gt;. Sofistike genetik analizi için onun amenability kompleks gelişim programlarının çalışma sağlar. Bu protokol fotoreseptör farklılaşma odaklanarak, üç ayrı gelişim aşamalarında diseksiyonlarının ve retinanın immunohistokimyasal açıklar.

Larva, Pupa ve Erişkin diseksiyonu ve İmmünohistokimya<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinaları

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

dissection-immunohistochemistry-larval-pupal-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

25.1K Görüntüleme.  New York University.  Drosophila Retina bir basmakalıp şekilde oluşturulan hücre tipleri az sayıda oluşan bir kristal kafes benzeri bir 1. Sofistike genetik analizi için onun amenability kompleks gelişim programlarının çalışma sağlar. Bu protokol fotoreseptör farklılaşma odaklanarak, üç ayrı gelişim aşamalarında diseksiyonlarının ve retinanın immunohistokimyasal açıklar.

Video: Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

Larvaların ve Yetişkin Enhancer-trap Flippase İfade Haritalama ve Uygulama Drosophila MSS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Nörobilim

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Tek Drosophila Ommatidium Diseksiyon ve Görüntüleme

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear. Since there is no cell line that satisfactorily represents mammalian hair cells, research on hair cells relies on primary organ cultures. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice (Figure 1) 1-6. The utricle is a vestibular organ, and the hair cells of the utricle are similar in both structure and function to the hair cells in the auditory organ, the organ of Corti. The adult mouse utricle preparation represents a mature sensory epithelium for studies of the molecular signals that regulate the survival, homeostasis, and death of these cells.
Mammalian cochlear hair cells are terminally differentiated and are not regenerated when they are lost. In non-mammalian vertebrates, auditory or vestibular hair cell death is followed by robust regeneration which restores hearing and balance functions 7, 8. Hair cell regeneration is mediated by glia-like supporting cells, which contact the basolateral surfaces of hair cells in the sensory epithelium 9, 10. Supporting cells are also important mediators of hair cell survival and death 11. We have recently developed a technique for infection of supporting cells in cultured utricles using adenovirus. Using adenovirus type 5 (dE1/E3) to deliver a transgene containing GFP under the control of the CMV promoter, we find that adenovirus specifically and efficiently infects supporting cells. Supporting cell infection efficiency is approximately 25-50%, and hair cells are not infected (Figure 2). Importantly, we find that adenoviral infection of supporting cells does not result in toxicity to hair cells or supporting cells, as cell counts in Ad-GFP infected utricles are equivalent to those in non-infected utricles (Figure 3). Thus adenovirus-mediated gene expression in supporting cells of cultured utricles provides a powerful tool to study the roles of supporting cells as mediators of hair cell survival, death, and regeneration.

Mechanosensory hair cells are the receptor cells of the inner ear. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice. We present the dissection of the adult mouse utricle, and we demonstrate adenovirus-mediated infection of supporting cells in cultured utricles.

Yetişkin Fare kesecik ve Adenovirüs aracılı Yardımcı hücre Enfeksiyon Diseksiyonu

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Yüksek-Kalite Dijital Video Edinme<em&gt; Drosophila</em&gt; Bir Yanal Perspektifinden Larva ve Yetişkin Davranışları

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Doğrusal Agaroz Kanallar kullanarak Okuyacak<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Tarama Davranış

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...