Bu çoklu downstream uygulamaları için Drosophila pupal göz dokusunun izolasyonu için etkili bir yöntem olduğu için bu protokol önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı doku zarar vermeden pupal gözlerin çok sayıda hızlı diseksiyon sağlar olmasıdır. Drosophila pupal retina diseksiyon acemiler için zor olacak.
Tekniği uygulamak, diseksiyonlarin hızını ve sonuçların kalitesini artırmanın en iyi yoludur. Drosophila pupasını siyah bir kesiştaba yerleştirdikten sonra, mezhebin üzerine yeni bir çift taraflı bant yerleştirin, pupadan uzak, ve pupa dorsal tarafını dikkatlice bandın üzerine yerleştirmek için bir çift çifenlik kullanın. Bir stereo mikroskop altında çanak yerleştirin ve her pupa operkülkaldırmak için çerofma kullanın.
Her pupal durumda dilim mikrodiseksiyon makas kullanın, baş ortaya çıkarmak için açık flapped izin, toraks, ve ön karın segmenti, ve çift taraflı bant pupal durumda kenarları güvenli. Her pupanın karnını keskin bir şekilde delin ve pupal kılıfından pupayı çıkarın. Pupayı teypten uzakta, diseksiyonu tablanın üzerine yerleştirin ve 400 mikrolitre buz gibi PBS ile pupayı kapatın.
Karın tarafından her birini kavramak için forceps kullanın ve toraks ile temiz bir kesit kesit yapmak için mikrodiseksiyon makas kullanın, ikiye pupa kesme. İnce forceps iki çift kullanarak, her toraks epitel kesme kenarları kavramak ve yavaş yavaş göğüs ve baş kapsülü açık gözyaşı, göz-beyin kompleksi ve çevresindeki yağ dokusu açığa. Sonra, doku kavramadan, her yarı saydam, off-beyaz, dumbbell şeklinde göz-beyin kompleksi rehberlik etmek için forceps kullanın, uzak baş kapsülünün kalıntılarından.
Altı ila 10 pupa inceledikten sonra, yaklaşık bir milimetre çapında temiz bir jilet ile bir mikropipet ucu kesti ve PBS ve yağ karışımı ile ucu yağlayın. Göz-beyin komplekslerini buz üzerinde 400 mikrolitre PBS içeren dokuz kuyulu cam bir cam çanağa aktarmak için yağlanmış pipet ucunu kullanın ve sonra 20 mikrolitre PBS'deki dokuyu 35 dakikalık bir kuluçka için en az 250 mikrolitre fiksatife aktarın. Fiksasyon sonunda, buz üzerinde beş ila 10 dakika boyunca taze PBS 400 mikrolitre içeren üçüncü bir kuyuya doku aktarmak için aynı pipet ucu kullanın.
Spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için, göz-beyin komplekslerini 400 mikrolitre PBS artı Triton X'e aktarın ve buz üzerinde 10 ila 60 dakikalık bir kuluçka için. Kuluçka sonunda, aliquot 10 mikrolitre birincil antikor solüsyonunun 10 mikrolitresi 72 kuyulu bir mikrokuyunun gerekli sayıdaki kuyularına ve PBS artı Triton X ile yağlanmış modifiye edilmiş 0,5 milimetrelik bir ucu olan P10 hava deplasmanlı mikropipetkullanarak en fazla beş göz-beyin kompleksi ve en fazla üç mikrolitre PBS PBS'i antikor çözeltisine aktarın. Dört santigrat derecede bir gece kuluçka sonra, yıkama başına beş ila 10 dakika için dokuz kuyulu cam çanak bir kuyuda PBS artı Triton X 400 mikrolitre örnekleri iki kez yıkayın.
Üçüncü yıkamadan sonra, doku yutun oda sıcaklığında iki saat boyunca uygun bir ikincil antikor çözeltisi 100 mikrolitre içine aktarın, ışıktan korunan, PBS ve Triton X 400 mikrolitre üç beş ila 10 dakikalık yıkar ve PBS bir yıkama aşağıdaki. Daha sonra, 1-2 saat boyunca montaj ortamı 200 mikrolitre örnekleri dengeleyin. Kuluçka sonunda, bir mikroskop slayt örnekleri aktarın ve bir diseksiyon mikroskop altında slayt bir göz-beyin kompleksi pin sağlam bir tungsten iğne kullanın.
Daha sonra, her gözü ilişkili optik lobundan uzaklaştırmak ve her gözü mikroskop slaytının yüzeyine çıkarmak için ince bir tungsten iğnesi kullanın, böylece gözün bazal yüzeyi slayta bitişiktir. Daha sonra, örneklerin üzerine temiz bir coverslip uygulayın ve oje ile coverslip mühür. Batı leke analizi için pupal göz dokusu hazırlamak için, ilk diseksiyon 10-16 pupa daha önce iki toplu olarak gösterildiği gibi, PBS 10 ila 15 dakika arayla proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile birlikte.
PBS artı inhibitörlerin 400 mikrolitre buz üzerinde dokuz kuyucam çanak bireysel kuyularda izole göz-beyin kompleksleri iki kez durulama sonra, buz gibi PBS ve inhibitörleri 400 mikrolitre içine tüm göz-beyin kompleksleri transfer temiz bir siyah diseksiyon çanak üzerine decanted. Temiz bir diseksiyon mikroskobu altında, optik lobdan her gözü temiz bir şekilde kesmek için sağlam bir tungsten iğnesi ve ince bir jilet kullanın ve göz-beyin komplekslerini beş mikrolitre PBS artı inhibitörleri buzüzerinde 500 mikrolitrelik mikrosentrifuge tüpüne aktarmak için yağlanmış bir uç kullanın. Daha sonra, tüp e batı doku lysis tampon beş mikrolitre ve 2X konsantre protein örnek tampon 10 mikrolitre ekleyin.
RNA ekstraksiyonu için göz-beyin komplekslerini işlemek için, eldiven takmak, tezgahüstü, mikroskopu, diseksiyon araçlarını ve %70 etanol ve RNase dekontaminasyon reaktifi ile siyah diseksiyon yemeklerini temizleyin. Bölgenin kurumasını sağladıktan sonra, toplam 30 ila 40 pupanın 6 ila 8'li gruplar halinde incelenmesi. Göz-beyin kompleksleri her toplu kesildikten sonra, temiz bir kesme çanak taze, buz gibi, nükleaz içermeyen PBS 400 mikrolitre içine dokuz iyi çanak göz-beyin kompleksleri aktarın ve temiz bir inceleme çanak sağlam bir tungsten iğne ve ince bir jilet kullanın temiz optik lob her göz kesmek için.
Bir toplu iş için tüm gözler çıkarıldığında, steril, RNase içermeyen mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve numuneleri bir sonraki toplu işleme geçmeden önce sıvı nitrojenle flaş dondurun. Pupal göz gelişimsel süreçleri araştırmak için mükemmel bir model olarak hizmet veren kolay erişilebilir bir dokudur, bu sürücü morfogenez de dahil olmak üzere. Puparium oluşumundan yaklaşık 40 saat sonra hücrelerin son düzenlemesi sağlanır.
Bu, genetik mutasyonun veya modifiye gen ekspresyonunun sonuçlarını değerlendirmek için ideal bir yaştır. Örneğin, apoptozun bir çekirdek inhibitörü olan Diap1'in ektopik ekspresyonu sonrasında, kafes hücrelerinin sayısındaki artış, kontrol retinasında gözlenenle karşılaştırılabilir. Apoptoz da bir ölüm kaspase-1 etkinleştirmek için antikorlar kullanılarak ya da ölmekte olan hücreleri tespit etmek için diğer yaklaşımlar kullanılarak daha doğrudan değerlendirilebilir.
Göz lysatlarının batı lı blot analizleri, ilgi çeken proteinlerin varlığını veya göreceli ekspresyonunu belirlemek veya farklı gelişimsel zaman noktalarında protein ekspresyonunu karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu genotip veya deneysel durum başına 60'tan fazla göz diseksiyon yeterli yüksek kaliteli RNA izole etmek için en uygun olduğunu unutmayın. Hatırlanması gereken en önemli şey pupal retina son derece kırılgan olduğunu, ve bütünlüğünü sağlamak için diseksiyon sırasında büyük özen alınmalıdır.
