Bu çalışma Yazarlar S. Durry ve C. Roderigo uzman teknik yardım için, ve M. Dubbert (Elektronik Laboratuvarı, Zooloji Enstitüsü&#39;ne teşekkür isteyen CRR için Alman Bilim Vakfı (DFG, Ro2327 / 6-1) bir hibe ile desteklenen Pockels hücresi denetleyicisi ve HF anahtarı uygulanmasında yardım için Köln Üniversitesi, Almanya).

Bu çalışma sıkı Heinrich Heine Üniversitesi Düsseldorf, Almanya kurumsal kurallarına uygun, yanı sıra Avrupa Topluluğu Konseyi Direktifi (86/609 / EEC) yürütülmüştür. (: Ø52 / 05 kurumsal Sayılı Kanun&#39;la) Tüm deneyler Heinrich Heine Üniversitesi Düsseldorf, Almanya Hayvan Bakımı ve Kullanımı Tesisi&#39;nde Hayvan Refahı Dairesi tarafından tebliğ ve onaylanmıştır. Alman Hayvan Refahı Yasası uyarınca (Tierschutzgesetz, Madde 4 ve 7), beyin dokusunun postmortem kaldırılması için resmi bir ek onay gerekli. Deney hayvanlarının Ötanazi, Lüksemburg: akut dilimleri nesil için, farenin yayımlanan Avrupa Komisyonu önerisi şu (decapitated hızla CO 2 ile anestezi edildi ve Avrupa Toplulukları 1997 Resmi Yayınlar Ofisi; ISBN 92-827-9694 -9). 1. HazırlıkÇözümler <ol><li> % 95 O 2 ile fokurdatıldı 125 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 6 MgCl2, 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3 ve 20 glikoz, (mM olarak) diseksiyon için yapay serebrospinal akışkan (ACSF) hazırlanması % 5 CO2, 7.4 olan bir pH ile sonuçlanır. </li><li> (MM olarak) ihtiva eden deneyler için ACSF hazırlayın: 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3 ve% 95 O2 ve% 5 CO2 ile kabarcıklandırılmış 20 glikoz, elde edilen 7.4 bir pH. </li><li> 150 KMeSO 3, 12.5 hidroksi etil-piperazin etan sülfonik asit (HEPES), 40 KCI, 5 NaCI, 1.25 etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 5 Mg-ATP, 0.5 Na: hücre içi çözelti (ICS), (mM olarak) hazırlanması GTP. 7.3 pH ayarlayın. -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik alikotları saklayın. </li><li> Iki kere distile edilmiş su içinde sodyum bağlayıcı benzofuran izoftalat (SBFI) TUZ seyreltilir ve 5 ul alikotları hazırlamak10 mM&#39;lik bir stok çözeltisi. </li><li> Çözülme ICS, 1 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda SBFI stok çözeltisi eklenmekte ve. Vortex ve mikro-süzüntü (0.22 mikron). Deneyde kullanılıncaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edin. Refreeze ve sadece bir gün için kullanmayın. </li><li> Çifte damıtılmış su içinde eritilmesi ile 50 mM glutamat MNI stok çözelti hazırlayın. Normal ACSF 5 mM&#39;lik bir son konsantrasyona kadar MNI glutamat stok solüsyonu ile seyreltilir. Deneyde kullanılıncaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edin. Refreeze ve sadece bir gün için kullanmayın. Derhal -20 ° C &#39;de, deneyde kullanılan olmayan mağazası alikotları. </li></ol> Doku 2. Diseksiyon Not: kemirgen beyin akut hipokampal dilimler hazırlanması daha önce 13,14 detaylı bir şekilde tarif edilmiştir. Kısaca aşağıdaki protokol bu çalışmada kullanılmıştır. <ol><li> Başlarının kesilmesi işleminden sonra, hızlı bir şekilde kafatası beyin çıkarın. </li><li> Hemen bir petri beyin yerleştirinbuz-soğuk diseksiyon ACSF ile orta hat boyunca bir sagital kesim yaparak bir yarımkürede incelemek ve. </li><li> Bir engel yüzeyi olarak istenen yönde bir ikinci kesim gerçekleştirilmesi ve güçlü bir yapıştırıcı ile bir vibratome kesme aşamasına bu ekleyin. </li><li> Haznesi kesme ve soğutucu elemanın alın bölme beyin bölümü ile dondurucu ve yer kesme aşamasında üzerinden vibratome (her ikisi de, -20 ° C&#39;de tutulur). Daha sonra oda içinde soğutma elementi koymak ve buz soğukluğunda diseksiyon ACSF doku daldırın. Hazırlanmasını stabilize etmek için, bir agar jeli ile doku bloğu karşı isteyebilir. </li><li> Vibratome ile hipokampus 250 mikron kalınlığında, parasagital dilim kesin. Tüm ACS sıvılar her zaman kabarmış emin olun. </li><li> Dilimleme sonra, normal ACSF ile bir çanak içinde bir ağ örgü üzerinde tutmak ve doku, 30 dakika boyunca 34 ° C&#39;de inkübe edin. Daha sonra oda sıcaklığında tutulması. </li></ol> Donanım 3. hazırlanması Şekil ışık yolları ve çoklu foton görüntüleme, lazer tarama UV flaş fotoliz ve elektrofizyoloji oluşan. Çoklu foton ışın (kırmızı) teçhizat deneysel kontrolünü gösteren 1. Şema darbeli bir ayarlanabilir kızılötesi (IR) lazer tarafından üretilen (Tisa). Bu lazer güç ve yönetim süresi denetimini etkinleştirmek hepsi mekanik bir deklanşör, bir Pockels &#39;hücre ve IR dedektörü (ışık yoğunluğu tespiti), geçer. Flip-in / flip-üzerinden isteğe lazer diyotu, bir lazer ışınının temel hizalanması için kullanılmaktadır. , Işın, çok geniş bir arka odak düzlemi ile objektif ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Uzaktan kontrollü önceden tekerlek ilave olarak veya bunun yerine bir lazer ışını gücünü kontrol etmek için Pockels hücresindeki kullanılabilir. Tarama kafası geçtikten sonra, darbeli kızılötesi ışık numunesine yönlendirilir. Emitted floresan ışığı (açık yeşil), harici veya dahili photomultiplier dedektörleri (PMT) yoluyla toplanır. Dış dedektörler tam bir yüksek frekans anahtarı (PMT kontrolör) ile iç PMT&#39;lerin ile senkronize edilir. Uncaging kiriş (açık mavi) UV katı hal lazer (DPSS UV-Lazer) tarafından üretilir. Daha sonra, bir ışık kılavuzu ile epi-floresan kondansatörün üst arka galvo tahrik tarama birimi yöneliktir. Hassas konumlandırma Uncaging nokta veya alan (görüntüleme ve Uncaging ışını arasındaki renk sapmaları) görüntüleme yazılımından görüntü ihracat etkindir. Görüntüleme, elektrofizyoloji ve flaş fotolizini senkronizasyonu için zamanlama yönetimi elektronik olarak kontrol edilir. Transillüminasyonu dedektörü (TL-PMT) dokusu içinde pipet konumlandırma dokümantasyonu için ihtiyaç olduğunu. Kontrol birimleri ve değiştirilmiş görüntüleme sistemi, yazılım, kontrol ve diğer cihazları senkronize etmek için kullanılırSistemi çalıştırmak için gerekli. &quot;Özel&quot; yazarlar tarafından uyarlanan / tasarlanmış ve inşa edilmiş gibi sistem bileşenleri etiketlenmiş. Bazı bileşenler özel inşa çoklu foton sisteminin gereksinimlerini karşılamak için adapte edildi ve &quot;değiştirilmiş&quot; olarak etiketlenmiş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Çoklu foton sisteminin bileşenleri açın. Test ve kızılötesi lazer ışını hizalamayı. <ol><li> Yerine bir amacın merkezleme prizması çevirerek kontrol ışın konumlandırma. Kiriş yerinden ise, periskop yılında aynalar bunu yeniden ayarlayın. Prizmanın merkezleme düzlemi ise görüntüleme hedefi arka odak düzlemi olarak aynı seviyede olması gerektiğini unutmayın. </li><li> Spektrometre açınız ve kirişin çoklu foton özelliklerinin kontrol edin. </li><li> Aşağıdaki değerlere görüntüleme yazılımı parametreleri ayarlayın: Seçiniz(yüksek kare hızı ve yüksek uzaysal çözünürlüğü için sırasıyla 2.5 yakınlaştırma faktörü ile daha küçük klip kutuları) hücre bakış görüntüler için 512 x 512 piksel bir kare boyutu. Hızlı modu ve XYT tarama moduna ayarlayın görüntüleme hızı. Z-step sonra yapılan deconvolution için uzamsal örnekleme gereksinimlerini karşılamak için detaylı yığınlarının için 1 genel yığınları için mikron ve 0.2 mikron olmalıdır. </li></ol></li><li> Ve fotoğraf-çarpanları (PMT) -: (16 μW ≈ 14 hedefi altında nihaî güç) Pockels &#39;hücre ayarlarını değiştirerek çoklu foton lazer ışını (790 nm) yoğunluğunu ayarlayın. </li><li> Açma ve objektif mercek altında floresan örnek slayt koyarak Uncaging sistemini kalibre. <ol><li> Dürbün kullanarak, UV optik odak ayarlamak ve mekansal UGA tarama kafasına odaklama birimi kullanılarak maksimum çapı 2 mikron arasında bir boyuta UV lazer nokta sınırlar. </li><li> Uncaging ünite kontrol Softwar kalibrasyon rutin başlayınör. <ol><li> Floresan, bir CCD kamera ile elde edilir ise, bunun tarama aralığı içinde çeşitli noktalarına UV lazer ayarlayın. Her noktada UV lazer noktada tıklayarak, yazılım koordine belli bir karşılık için galvanik tarama aynalar konumlandırma ayarlayın. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig2highres.jpg" width="500" /> Uyarma, emisyon ve Uncaging ışın yollarının özelliklerini gösteren Şekil 2. Ayrıntılı şeması. IR uyarma ışın (kırmızı) mikroskop epi-floresan kondansatör ve amacı için dosyalayıcı tarete düzeyde dikroik ayna birleştirerek ışın geçer Numuneyi ulaşır. Uncaging kiriş (mavi) tarama mil üniteyi odaklama kolimasyonu ve kiriş bir kuvars optik ışık fiberden ve sonradan yönlendirilirtarama biriminde rrors, kiriş birleştirme dikroik ayna bir dikroik aynayı geçer. Burada uyarım tarama kiriş ile birleştirilmiştir. Örnekten yayılan ışık görüntü tarama kafasına doğru ters yönde eksitasyon taraması, ışın yolunun yolunu izler. Kamera yama pipet görsel kontrolü için ve odaklı lazer tarama mikroskobu ile kombinasyon halinde Uncaging kirişin konumlandırma için kullanılabilir (gösterilmemiştir). Yeşil ışık yolu diğer uygulamalar ile kullanım olabilir isteğe bağlı epi-floresan aydınlatma temsil eder. <ol start="3"><li><ol start="2"><li><ol start="2"><li> Fokal uygulamaları kazanmak için nokta modunda flaş potoliz sistemini kullanın. Emin olun (hedef altında ortalama güç: 0.55 mW) olması Uncaging ışınının odak ayarlaması çapı 1,5 um (xy uzantısı) bir nokta boyutu ile sonuçlanır z düzeyinde yerleştirilmiş bir floresan slayta ortaya olarak tekabül Dokudilim (gösterilmemiştir). </li></ol></li><li> Uncaging nokta doğru konumlandırma uncaging- ve görüntüleme-bilgisayar arasında bir ağ bağlantısı üzerinden görüntüleme sisteminin bir görüntünün ithalat ile elde edilir. <ol><li> Bir ekran kapmak yazılımı kullanarak, sürekli görüntüleme yazılımı (yerine kamera besleme) çerçeveleri okumak ve örtüşecek görüntüleme ve Uncaging çerçeveleri ayarlayın. Flaş ünitesinin içine bir referans görüntü tüm deney sırasında uygun ayarı sağlamak için görüntüleme yazılımı her 10. kareyi ihracat. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Şekil 3," fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil Uncaging nokta 3. Ayarı: tam Uncaging nokta, Uncaging yazılım (yeşil çerçeve) ithal edilir görüntüleme yazılımı (sarı çerçeve) bir ekran görüntüsü konumlandırmak için.Tüm CA1 piramidal hücre (doymuş piksel: siyah pikseller, kırmızı, mavi) sarı çerçeve içinde sol görüntü bir Hi-Lo kodlu görüntüyü temsil eder. Görüntü Uncaging yazılımı (yeşil bir &quot;X&quot; ler) in kalibrasyon ızgara tarafından örtülmektedir. Sağında, hücrenin büyütülmüş bir parçası Kaplanmış Uncaging nokta (kırmızı çapraz) ile gösterilir. Sarı nokta Uncaging kirişin otomatik olarak üst üste görüntü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="4"><li> Hedef bölgeye kafesli bileşiğin teslimat için mikromanipülatörler, elektrofizyoloji bileşenleri ve basınç uygulama cihazı açın. </li><li> Kafesli bileşiklerin lokal perfüzyon için bir odak basınç uygulama cihazı takın. Bu maddelerin Banyo perfüzyonu ile karşılaştırıldığında, bu son derece maliyetlerini azaltacaktır. AC bir nefes önlemek için belirli bir atmosfer basıncına tutan basınç ayarlamaIçine SF veya uygulama pipetle kafesli maddelerin kaçak. NOT: basınç uygulama cihazı pipet tutucu son derece hassas ve ultra hızlı mikro-valf ev sahipliği yapıyor. Bu minimum uygulama basınçların kullanılması mümkün kılar ve bu nedenle kafesli bileşiği ile perfüzyon sırasında yerel minimum hareket dıştan müdahale ürünlerini indirgemektedir. </li><li> Yangın cilalı borosilikat cam kılcal damarları kullanarak tüm hücre yama kelepçe ve yerel perfüzyon için pipetler çekin. Pipetler ~ 1 um&#39;lik bir uç çapına ve R ≈ 3 MW (K-3 mezo merkezli, ICS ile tespit edilmiş değerlerin) bir dirence sahip olmalıdır. </li><li> Yer deneysel banyosunda dilim ve bir ızgara ile yapıştırın (Şekil 4A, B) (250 mikron kalınlığında platin çerçeve, cerrahi iplikler ile yayılmış 40 mikron od). Dilim transferi için (kırık ucu tarafında emme topu) bir ters, ucu kırık ve yangın cilalı Pasteur pipet kullanın. Bükme ve dilimin herhangi bir diğer sert taşıma kaçının. </li></ol&gt; <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil mikroskop aşamada deney banyo ve banyo konumlandırma 4. Bileşenleri (A). Deney banyosu Manyetik metal halkayla çevrelenmiş olduğu bir banyo cebin (mavi kare) oluşur. Boru tuzlu su (ACSF) ile banyo sürekli perfüzyon sağlar. Basılı tutun ve dilim düzeltmek için ızgara banyo odasına konur. Banyo odasının içinde konumlandırılmış (B) Akut dilim hazırlık. Dilim ızgara parçacıkları tarafından tespit edilir. (C) Konumlandırma ve mikroskop aşamada deneysel banyo geometri deneyler sırasında. <ol start="8"><li> ACSF dilim serpmek kalıcı mikroskop aşamada banyo yerleştirin ve. </li></ol> 4. Tüm hücre Patch-sıkma <ol><li>SBFI içeren ve kafesli bileşik ile lokal perfüzyon pipet yüklemek ICS yükleyin yama pipet. İlgili mikromanipülatörler pipetler takın. Banyosunda referans elektrot yerleştirin. Eğer baş aşamasında (cf Şekil 4C) zarar vermemek için kalıcı topraklı emin olun. </li><li> Banyoya hem pipetler indirin ve hipokampal CA1 bölgesinde yukarıda koyun. ACSF ICS seyreltme önlemek için yama pipet (+40 mbar) hafif bir basınç uygulayın. </li><li> Elektrofizyoloji yazılımı kullanılarak yama pipet ofset potansiyelini dengeleyin. </li><li> IR-DIC Video mikroskopi kullanılarak yama pipet ile bir CA1 piramidal hücre yaklaşın. Giga-mühür elde edilinceye kadar nazik vakum uygulayın. Bir hücre, diğer taraftaki Uncaging ışınının bir taraftan düşük dağılma ve zayıflama ile sağlam hücre morfolojisi sağlamak için dilim yüzeyinin altında 30 -70 um arasında bulunduğu soma seçin. </li><li> Hızlı kapasitesini telafi. Arası membranE ve açık hücre bütün hücre yapılandırmasını kazanmak için. </li><li> Yavaş kapasite ve seri direnç için telafi eder. </li><li> Hücre görüntüleme bir deney başlamadan önce en az 30 dakika boyunca SBFI-ICS ile diyalize izin verin. </li></ol> 5. Çoklu-foton görüntüleme ve stimülasyon <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig5highres.jpg" width="600" /> Şekil 5. Deneysel protokol. Deney, (kırmızı işareti (ᴨ) ve kırmızı çizgi ile gösterilen) bir pals başlatmak için aynı anda görüntüleme (mavi), elektrofizyoloji (yeşil) ve kafesli yönetimini başlatmak için ayarlanır zaman noktası 0 sn bileşik (sarı). Bu ilk dönemde, görüntüleme kiriş tamamen (mavi ışık) soluk edilmelidir. 4.5 s (kesikli çizgi) sonra, kafesli bileşiğin lokal perfüzyon sonlandırılır ve görüntüleme demet kel ayarlanmalıdırveri toplama (mavi) için kral yoğunluğu. Sarı flaş gösterilen; 300 msn&#39;den: 1.5 sn sonra (zaman noktası 6 sn), ikinci bir pals verilen UV flaş birimi (flaş süresini başlatır, (kırmızı işareti (ᴨ) ve kırmızı çizgi ile gösterilen) bir ) ve elektrofizyoloji ve görüntüleme protokolünde göstergesini belirler. <ol><li> Aksiyon potansiyellerinin voltaj-kapılı sodyum kanallarının aktivasyonu ve oluşumunu önlemek için ACSF için Tetrodotoksin (TTX, 500 nM) ekleyin. </li><li> Çoklu foton uyarılması ile ve SBFI floresan edilen hücresel morfoloji görselleştirmek ve deney için bir dikenli dendrit seçin. Daha yüksek çözünürlükte görüntüler için büyüt ve dendrit etrafında bir klip kutusu yerleştirin. </li><li> Kafesli glutamat içeren 10 ul ACSF ile standart bir yama pipet doldurun. Basınç uygulama sistemi için pipet bağlayın ve micromanipulator takın. </li><li> Dendritin yakın kafesli bileşik (~ 30 mikron) ile pipet yerleştirin. Izin pipet yerleştirinseçim dendritin etkin yerel perfüzyon. Uncaging lazer ayarlayın: yakın Uncaging noktaya konumu - ilgi yapısına (~ 1 2 mikron). </li><li> Seçilen dendritin faiz ve görüntüleme yazılımı kullanarak komşu dikenler Set bölgeleri. </li><li> Ilgi bölgeyi yaklaşım ve fokal düşük basınç ile birkaç sn (&lt;3 PSI) için kafesli bileşik enjekte. Tetikleme sinyali ile yama kelepçe ve (790 nm çoklu foton uyarma) floresan kayıtları başlatın. NOT: kafesli bileşiğin yerel perfüzyon sırasında, uyarma ışın tamamen beyazlatma önlemek için soluklaşır. </li><li> Kafesli bileşik yerel perfüzyon durdurun. SBFI verimli uyarma etkinleştirmeniz ve Uncaging (Uncaging süresi 300 msn&#39;den) başlatmak için UV flaş uygulamak için iki foton lazer yoğunluğunu artırın. </li><li> SBFI floresan değişiklikleri izlemek. SBFI floresan başlangıç ​​noktasına geri kurtarıldı sonra kaydı durdurmak. </li></ol> 6. Farmakoloji <ol><li> Reseptör blokerleri istihdam, kafesli glutamat UV flaş fotoliz uyandırdığı akım ve / veya sodyum sinyalleri üretimi, iyonotropik glutamat reseptörlerinin yer aldığını test etmek için. <ol><li> AMPA-reseptör bloke edici siyano-nitrokuinoksalin-dion (CNQX, 10 uM) ve TTX (yukarıya bakınız) ek olarak NMDA-reseptör bloke edici-amino-phosphonopentanoate (APV, 50 uM) ihtiva eden geçiş ACSF ve en az 10 bir dilim serpmek Min. </li><li> Tekrar stimülasyon prosedürü (5.4 ve 5.5 bakınız.) </li></ol></li><li> Engelleyicilerin etkilerinden geri dönüştüğü <ol><li> Sadece TTX içeren normale ACSF geri dönün. </li><li> 20 dakika boyunca dilim serpmek. </li><li> Tekrar stimülasyon prosedürü (5.4 ve 5.5 bakınız.). </li></ol></li></ol> 7. Morfoloji <ol><li> Yapılan ölçümler için klip kutu bölge kümesinin bir XYZ-yığını kaydedin. Bu yığın oversample olduğundan emin olunuzamsal (piksel başına en az 0.2 mikron) en iyi görüntü dekonvulasyon etkinleştirmek için d ve görüntü kalitesi ve çözünürlüğü artırmak için. </li><li> Hücre morfolojisini değerlendirmek için tüm hücrenin bir XYZ-yığını kaydedin. </li><li> Çalıştırın dekonvolüsyon algoritması. </li></ol>

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes.">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li><li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li><li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li><li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na++influx+between+axon+and+soma.">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li><li>Denk, W., Piston, D., Webb, W., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 445-458 (1995).</li><li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons.">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mobility+in+muscle+cells.">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li><li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups.">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li><li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm:+photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim. Yazarlar video makalede kullanılan bir alet üreten Rapp optoelektronik (Wedel, Almanya), tarafından Açık Erişim yayını sağlayan mali destek aldı. Şirket deneylerde ne veri işleme ne de el yazması yazı yer ne oldu.

Bu çalışma, SBFI küçük hücresel bölümlerinde Hücre içi sodyum transient iki foton görüntüleme için uygun olduğunu göstermektedir. Bu SBFI kuantum etkinliği, sodyum konsantrasyonu oldukça azdır, 15 ve nispi değişikliklerin fizyolojik aktiviteye sahip oldukça küçük olduğu, ancak, akılda tutulmalıdır. Böylece, ince süreçlerin Na + Transientlerin yüksek çözünürlüklü ölçüm nispeten sıkıcı bir iştir, ve birkaç deneme binning veya ortalama tatmin edici sinyalleri elde etmek için gerekli olabilir. Ayrıca, sodyum Transientlerin kinetik uzun süreler için kayıt zorunlu hale şaşırtıcı yavaş. Bu gözlem, nöronal dendritler ve astrositlerin sodyum transient monoexponential bozunma oda sıcaklığında 1,2,6 10 saniye aralığındaki büyük bozulma süresi sabiti ile karakterize edilir burada daha önceki çalışmalarda, olanlara karşılık gelir. Sodyum geçici Bu şekilde çok daha düşük bir zaman co gösterir gibi görünürURSE ve kalsiyum geçici 16 oranla çok daha büyük bozulma zaman sabitleri. Bu sakıncaları bir kenara, sodyum görüntüleme nöronal alt etki fizyolojik özelliklerinin araştırılması için değerli bir araç olduğunu kanıtlıyor. Örneğin, sodyum görüntüleme ya da yakın aktif sinaps uyarıcı sinaptik aktivitesini izlemek için hizmet edebilir. Sodyum esas 8,17 tamponlanmamış için, aktivitesi ile uyarılan geçici sodyum doğrusal sinaptik glutamat salınımı geniş bir ilişkili ya da dışsal olarak glutamat uygulanır. Bu nedenle bir nöronal Glutamaterjik aktivitenin doğrudan ve tarafsız göstergeleri temsil eder. Ayrıca, sodyum göstergesi boyalar yüksek K d &#39;(SBFI en Kd 25 aralığında mM 1 ise) sergilerler. (- 1 mM genellikle 0.5), yüksek Kd &#39;nin boyaları kendileri s tampon olarak hareket yok olduğunu ima bile yeterli bir parlaklık elde etmek için kullanılan nispeten yüksek hücre içi boya konsantrasyonlardaiğrençlik. Sonuç olarak, onlar kalsiyum duyarlı boyalar hücrelere 18 sokulur her zaman bir endişe olduğu, sodyum Transientlerin genlik ne zaman ders bozmaz. Bu nedenle bulgulanan sinyaller, hücre içi sodyum, &quot;gerçek&quot; değişiklikleri iyi bir ölçümünü temsil ettiği kabul edilebilir. Bunların yavaş olan süreçleri nöron sodyum için hücre içi difüzyon hızı önceden tahmin 19 daha küçük olduğu anlamına gelir. Dikenler ve dendritler içine uyarıcı sinaptik iletim ve sodyum akını yolların özelliklerini ele deneylerin başarılı bir şekilde yürütülmesi için önemli bir gereklilik postsinaptik yapıların hızlı ve son derece lokalize aktivasyon indüksiyon olduğunu. Bu, bir omurga bölgesinin hemen yakınında ya da kafes bileşiklerin flaş fotoliz dendritlerin glutamat glutamat agonistleri ve hızlı yerel uygulanması ile elde edilebilir. Flaş potoliz değil mekanik Dama yokge doku, hareket eserler ücretsiz ve bununla ilgili sorular soruşturma için (örneğin, yerel kalsiyum sinyalizasyonu) kuruldu. Uncaging spot çapı xy düzleminde 1,5 um idi. Uncaging hem dikenleri bir dikenli dendrit kaynaklı sodyum sinyalleri yakın ve ana dendrit. Sinyalleri Uncaging noktaya en yakın dikenler büyük olma eğilimi ise, ana dendrit amplitüdleri ve omurgaları daha uzakta hala Uncaging noktasının hemen yakınında kişilerce oldukça benzerdi. Uncaging içeri doğru akımlar amplitüdünün artış sırasında 300 milisaniye boyunca uygulandı. Uncaged glutamat daha uzakta Uncaging yerden dendritik bölgelere ve dikenler üzerinde İyonotropik glutamat reseptörleri ve sodyum akışını aktive aynı dönemde dokuda yayılmış olabilir. Hücre banyo çözümü aracılığıyla uygulanan kafesli bileşiklerin photolysis için UV lazer kullanılarak oluşur içsel bir sorun&#39;İç filtreleme&#39; olduğunu. Çünkü kafesin yüksek emme oranı, UV ışığı uyarım siteye 20,21 için hedeften yol boyunca güçlü zayıflatılmaktadır. Bunu önlemek için bir uygun yol, sadece, ayrıca en az bir kafes için gerekli bileşik miktarını azaltır uyarı bölgesinden, sınırlıdır kafes yerel bir perfüzyon. UV lazer tarama aracılı Uncaging, yakın enfraruj, iki foton ile karşılaştırıldığında, 22 Uncaging stimülasyon doğruluğu z ekseni artar çünkü esas olarak, uzaysal olarak daha hassas. Diğer taraftan nedeniyle, iki foton uyarılması ile birlikte kullanılan bir yüksek kafesli bileşik konsantrasyonu ya da çok yüksek olmak üzere, potansiyel olarak fototoksik ışık yoğunlukları gereken daha uzun dalga boyları için yaygın olarak kullanılan kafeslerin küçük kesitine. Ayrıca, iki foton Uncaging ekipman çok daha yüksek bir yatırım gerektirir; diğerlerinin yanı sıra, ek bir kızılötesi lazer artı gerekli olan optik bileşenler ihtiyaç vardır. SBFI ve MNI-glutamat ikisi de aynı dalga boyu aralığında uyarılabilir bulunmaktadır. Bu, flaş Uncaging ve / veya kızılötesi ışın ile glutamat sürekli uncaging ile SBFI ağartılmasında sonuçlanan UV Uncaging lazer ve SBFI veya kızılötesi görüntüleme lazer ve MNI-glutamat istenmeyen bir ara bağımlılığı yol açabilir. Şekil 6C&#39;de gösterildiği gibi Ne var ki, tek başına veya çoklu foton görüntüleme ile, UV flaş bizim deney koşulları altında, bu karşılıklı etkilere neden olmuştur. Burada açıklanan benzer UV flaş sistemler, pek çok diğer laboratuarlarda rutin olarak kullanılır ve nispeten kolay herhangi mevcut bir foton görüntüleme mikroskop içine dahil edilebilir. Bu fotoliz için lazer ışını görüş alanında serbestçe konumlandırılabilir avantajını sunmaktadır. Buna ek olarak, sistem bir deney sırasında, görüş alanı sırasıyla lazer ışınının hızlı ve otomatik yeniden konumlandırılması ve serbest hacmi, sağlar. OuR modifikasyon kolaylaştırır ve görüntüleme yazılımı çerçeveleri örtüşecek görüntüleme ve Uncaging çerçeveleri ayarlamak üzere iş görmektedirler, böylece Uncaging noktasının doğru konumlandırma artırır. Birlikte ele alındığında, glutamat UV ışık kaynaklı uncaging için modifiye edilmiş bir prosedür ile birlikte dendrit ve merkezi nöron dikenler tam hücre patch-clamp ve çoklu foton sodyum görüntüleme, doku glutamat reseptörlerinin, güvenilir ve fokal aktivasyonunu sağlar. Böylece, sağlam doku nöronların uyarıcı sinirsel iletimin ve postsinaptik sodyum sinyallerin özelliklerini analiz etmek için hizmet edebilir.

Bu tür çoklu foton mikroskopi gibi hafif mikroskobik tekniklerindeki son gelişmeler, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip sağlam doku beyin hücrelerinin morfolojik ve fizyolojik parametrelerin çalışma sağlamıştır. Elektrofizyoloji ile birlikte, bu teknikler artık yaygın yani ince dendritler ve dendritik dikenler, küçük subselüler bölümlerinde nöronlar üzerinde etkinlik ile ilgili elektrik sinyalleri yanı sıra eşlik eden kalsiyum sinyalleri analiz etmek için kullanılır. Kalsiyum geçici ek olarak, sinaptik etkinliği de dendrit ve omurga içinde sodyum sinyalleri uyarır özellikleri büyük oranda araştırılmamıştır. Bu tür sinyaller [Na +] önemli boya ağartma veya foto-hasarı 1,2 vermeden uzun süre i Transientlerin on-line ölçüm sağlar hücre içi sodyum iki-foton görüntüleme ([Na +] i) ile analiz edilebilir. [Na +] i görüntüleme için </&gt; alt sadece birkaç kimyasal gösterge boya maddeleri, örneğin korona Yeşil veya Asante Sodyum yeşil 3,4 mevcuttur. Na görüntüleme için en yaygın biçimde kullanılan flüoresan prob sodyum bağlayıcı benzofuran izoftalat (SBFI) &#39;dir. Bu iyi bilinen kalsiyuma duyarlı boya Fura-2&#39;ye benzer bir oran ölçer, UV ile uyarılmış ve boya (örneğin, 5,6), birçok hücre tipinde, geleneksel Na görüntüleme için kullanılmıştır. Heyecan verici boya ve floresan toplama farklı olasılıklar vardır. Yüksek temporal çözünürlük (yani yüksek görüntüleme kare hızı) mekansal bilgi ile birlikte gerekiyorsa, SBFI yüksek hızlı şarj ile tespit ksenon ark lambasından veya yüksek güç ışık yayan diyot (LED) cihaz ve emisyon ile heyecanlı olabilir -coupled cihaz (CCD) kamera 7,8. Derin doku, maksimal uzamsal çözünürlük için, çoklu foton lazer tarama mikroskobu tercih 9 yöntemdir. Nispeten düşük kuantum efficie(- 2 mM 0.5) ve keskin bir mikroelektrot 10 veya yama pipet 1 ile SBFI membran geçirmeyen biçiminin doğrudan yükleme SBFI arasında ncy nispeten yüksek boya konsantrasyonları gerektirir. SBFI kullanarak, kemirgen hipokampus akut doku dilimleri yapılan önceki çalışmaları ağırlıklı olarak 1,2 reseptörleri İyonotropik NMDA ile sodyum akını kaynaklanır CA1 piramidal nöronların dendrit ve dikenler etkinlik ile ilgili sodyum transientler gösterdi. Daha ayrıntılı olarak, yerel sodyum sinyallerin özelliklerinin çalışma için, reseptör agonistlerinin uygulanması ile postsinaptik reseptör özgü aktivasyon tercih edilen bir çok uygun bir yöntemdir. Presinaptik aktivite ve verici salınımını taklit etmek, uygulama nispeten kısa olması ve yerel uyarımı sağlamak için odaklı olmalıdır. Ancak bu, sağlam dokularda oldukça zor olduğu kanıtlanmıştır. Ince uçlu bir pipet kullanarak reseptör agonistlerinin lokal basınç uygulanması çok odak ap sağlarkatmer, ama (böyle bir dendrit ve dendritik dikenler gibi örneğin) ilgi yapısının hareketini üretmek için potansiyel risk barındıran ve böylece yüksek çözünürlüklü görüntüleme engellemektedir. Nöro-aktif maddelerin iyontoforez uygunluğu elektrik durumuna bağlıdır ve yüksek akım genlikleri, hem de hücresel eserler üretebilir. Bu engelleri aşmak için bir yol fotoğraf aktive bileşiklerin ve bunların flaş photolysis istihdam olduğunu. Temel olarak iki farklı prensipler kafesli maddeler foto-aktivasyon için kullanılır: 12 ile birlikte lazer tarama modülleri kullanılarak I) &#39;in geniş alan flaş fotoliz ve 11 II)&#39; fokal Uncaging. Geniş alan flaş potoliz ilgi geniş bölgelerini aktive etmek için kullanılır iken, örneğin bütün bir hücre, odak Uncaging özellikle küçük hücresel bölmeleri uyarmak için kullanılır. Bu çalışmada biz tüm hücre yama-kelepçe ve çok p bir prosedür göstermekDokuda, glutamat reseptörlerinin, güvenilir ve fokal hareketliliğe olanak tanıyan glutamat UV ışık kaynaklı uncaging, modifiye edilmiş bir prosedür ile birlikte dendrit ve merkezi nöron dikenler hoton sodyum görüntüleme.

<table><tbody><tr><td>Borosilicate-glass capillaries</td><td>Hilgenberg</td><td>1405059</td><td>75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Jenoptik</td><td>ProgRes MF</td><td>IR-DIC compatible camera</td></tr><tr><td>Deconvolution software</td><td>SVI</td><td>Huygens Pofessional X11</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic spectrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>USB 4000</td><td>Miniature fiber optic spectrometer</td></tr><tr><td>Filter tubes</td><td>VWR</td><td></td><td>cenrifugal filter, 0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Olympus Europe</td><td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td><td></td></tr><tr><td>IR beam power controller</td><td>Custom built</td><td></td><td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td></tr><tr><td>IR laser</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai-Tai</td><td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION</td></tr><tr><td>IR power monitor</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Burleigh</td><td>PCS 5000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope/Imaging System</td><td>Olympus Europe</td><td>BX51WI/FV300</td><td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td></tr><tr><td>ND filter wheel</td><td>Newport</td><td>50Q04AV.2</td><td>UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>NIR Apo 60x/1.0w</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Narishige</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic drug ejection system</td><td>NPI Electronic</td><td>PDES-DXH</td><td></td></tr><tr><td>Pockels cell</td><td>Conoptics</td><td>350-80 LA-BK</td><td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td></tr><tr><td>Pockels cell driver</td><td>Conoptics</td><td>M302-RM</td><td>High voltage differential amplifier</td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6ZM2</td><td>ALMgF&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-coated BeCu blades</td></tr><tr><td>Shutter controller</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shutter driver</td><td>Vincent Associates</td><td>Uniblitz VCM D1</td><td></td></tr><tr><td>Slicer/Vibratome</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Uncaging software</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td><td></td></tr><tr><td>UV laser</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-355/10</td><td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td></tr><tr><td>UV laser scanning system</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA 40</td><td>Galvanometric scanning system</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Compound&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/&lt;br /&gt;Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td></tr><tr><td>SBFI K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; salt</td><td>Teflabs</td><td>OO32</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td></tr><tr><td>NMI-caged-L-Glutamate</td><td>Torcis</td><td>1490</td><td>Caged glutamate released upon UV absobtion</td></tr></tbody></table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

Çoklu foton floresan mikroskopi yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip sağlam doku beyin hücrelerinin morfolojik ve fizyolojik parametrelerin analizini sağladı. Elektrofizyoloji ile birlikte, yaygın olarak dendrit ve dendritik dikenler gibi küçük subselüler bölümlerinde etkinlik ile ilgili kalsiyum sinyalleri incelemek için kullanılır. Kalsiyum geçici ek olarak, sinaptik etkinliği de postsinaptik sodyum sinyalleri, sadece marjinal anlaşılmalıdır ki özelliklerini neden olur. Burada, merkezi nöronların hücre mikro etki kombine tam hücre patch-kelepçesi ve çoklu foton sodyum görüntüleme için bir yöntem tarif eder. Ayrıca, doku, glutamat reseptörlerinin, güvenilir ve fokal hareketliliğe olanak tanıyan, ultra viyole (UV) ışığı-glutamat kaynaklı uncaging için modifiye edilmiş bir prosedürü getirmektedir. Bu amaçla, tam-hücre kayıtları cornu ammonis alt bölüm 1 (CA1) akut doku dilimleri piramidal nöronlar üzerinde gerçekleştirilmiştirFare hippocampusu. Nöronlar yama pipet ile sodyum duyarlı floresan boya SBFI ile dolu, ve SBFI çoklu foton uyarma dendritler ve komşu dikenler görselleştirme sağlanmıştır. UV yol açtığı fokal uncaging oluşturmak için, ışık yoğunluğu, UV ışın Uncaging etkilenen hacmi, ışının pozisyonu ile kafesli bileşik konsantrasyonuna dahil olmak üzere birçok parametre olarak test edilmiş ve optimize edilmiştir. Bizim sonuçlar kafesli glutamat (MNI-Glutamat) ile yerel perfüzyon ve dendritler ve dikenler içe akımlar ve sodyum geçici onun odak UV-Uncaging sonuç gösterebilir. Bir zaman ve içeri doğru akımlar ve sodyum sinyalleri hem genlik Uncaging palsın süresi ile ilişkilidir. Ayrıca, sonuçlar, bu yolun da sodyum girmesi aracılık ettiğini gösteren hücre içi sinyaller sodyum iyonotropik glutamat reseptörleri için bloker varlığında bloke olduğunu göstermektedir. Özetle, bizim yöntem için güvenilir bir araç sağlarsağlam beyin dokusunda fokal reseptör aktivasyonu tarafından uyarılan hücre içi sodyum sinyallerinin incelenmesi.

Bu çalışmada, akut fare hipokampal doku dilimleri CA1 piramidal nöronlarda natriyuma bağlı floresan boya SBFI Hücresel sodyum dinamiklerinin çoklu foton mikroskopi için bir prosedürü göstermektedir. Ayrıca, nöro-aktif bileşiklerin lazer tarama-tabanlı uncaging (örneğin kafesli glutamat) ve hücresel mikro-etki hedefleyen onun kesin olan bu görüntüleme tekniği birleştirmek için nasıl gösterir. Yama pipet ile SBFI ile olan yükleme, nöronlar ince dendrit ve çoklu foton uyarılması kullanılarak bitişik dikenler (Şekil 6 A, B, D ve Şekil 7A) dahil olmak üzere bütün hücre görselleştirme sağladı. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil 6. Sodyum sinyaller ve kafesli glutamat flaş photolysis tarafından uyarılan sinaptik akımlar. (A) Maximyama pipet (PP) üzerinden SBFI yüklü bir CA1 piramidal nöron al projeksiyon görüntüsü. Kutusu B. LP büyütülmüş olarak gösterilen alan kafesli glutamat yerel perfüzyon için pipet konumunu ve yönünü gösterir gösterir. (B) bitişik dendritik dikenler ile dendritlerin optik bölümleri bir yığının Yüksek güç maksimum projeksiyon. Optik kesit yığınları z hizalama ve dekonvulasyon uygulandı. Kırmızı çapraz Uncaging ışınının hedef bölgeyi gösterir. Turuncu noktalı çizgi floresans emisyon kaydedildiği ilgi bölgesini belirlemektedir. (Sarı flaş ile gösterilir) kafesli glutamat flaş photolysis oluşturduğu akım (alt satır) içeri Sodyum sinyali (üst sıra) ve somatik: kutusu Sol D. (C) büyütülmüş olarak gösterilen bölgeyi gösterir. Kırmızı çizgi, deneysel verilerin bir uyumu temsil eder. Gri alan dönemini temsil eden Uncaging flaş (300 içindekafesli glutamat ile ön-perfüzyon olmadan, aynı UV flaş ne SBFI emisyonunda bir değişiklik, ne de içe doğru bir akım uyarılmış (D) Sol:. msn) Sağ SBFI floresan görüntüleme engel. dendrit ve bitişik Yüksek güç imajını yanı sıra B&#39;de tarif gibi, ters gri değerleri ile aynı görüntüyü spines. Noktalı çizgiler, floresans emisyon kaydedildiği ilgi olduğu bölgeleri belirtmektedir. Kırmızı çapraz Uncaging kirişin lokalizasyonu gösterir Sağ:. Kafesli glutamat UV-flaş photolysis tarafından uyarılan Sodyum transientler. Mavi iz: dendritin sodyum sinyalleri; kırmızı iz: Uncaging noktaya bitişik üç diken yanıtı ortalama; yeşil iz: uzak üç diken yanıtı ortalama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonu için lütfen buraya tıklayın.</a> Kafesli yerel perfüzyon sonraglutamat, bir dendrit yakın UV flaş uygulanması Hücre içi sodyum konsantrasyonu (Şekil 6C, D ve Şekil 7B) bir artışla, SBFI floresan emisyonunda bir düşme gözlendi. Aynı zamanda, içeri doğru akım soma (Şekil 6C ve Şekil 7B) kaydedildi. UV flaş süresini artırmak sistemi de dinamik aralığı içinde ve Uncaging ne de hücresel tepkiler de doymuş olduğunu olduğunu göstermektedir, her iki akım ve sodyum sinyalleri (veri gösterilmemiştir) içeri doğru ortaya genliklerini artmasına neden. Kafesli glutamat ile önceden perfüze değil dilimleri aynı ya da daha uzun bir süre için bir UV flaş uygulanması, bu sinyaller glutamat uncaging (Şekil 6C) bağlı olduğunu gösteren, SBFI floresan veya içeri doğru akımlar ortaya değişiklik olmadı. Ayrıca, bu sonuçlar imaging- ve Uncaging bileşenlerin herhangi bir bağımlılık u görülmektedir olduğunu göstermektedirBizim deneysel koşullar nder. Sodyum sinyaller de dendritik dikenler (Şekil 6D) tespit edilebilir. Biz sadece glutamat uncaging tek bir omurga hareketini elde girişimi yoktu iken, genlik zirve dikenler daha uzakta ana dendrit (Şekil 6D) gibi hemen hemen aynı floresan değişiklikler göstermesine karşın, Uncaging yakın nokta dikenler biraz daha yüksek olma eğilimindeydi. Son olarak, glutamat uncaging yanıt dendritler ve dikenler içine sodyum girmesi için yolu okudu. Bu amaçla, sırasıyla AMPA- ve NMDA alt tipi, sodyum geçirgen iyonotropik glutamat reseptörleri için selektif blokerler oldukları, CNQX ve APV yararlanılmıştır. Sonuçlarımız, glutamat ile indüklenen hücre içi sinyal ve sodyum ortaya çıkardı somatik akımlar bu bloke edicilerin (Şekil 7B) mevcudiyetinde ihmal olduğunu göstermektedir. Bloker yıkama-out sırasında, sinyalleri yeniden kazandırılır. Bu tha gösteriyorglutamat t Uncaging hücre içi sodyum geçici ve içe akımları sonuçlanan, dendritler ve dikenler içine sodyum akını aracılık CA1 piramidal nöronlar üzerinde İyonotropik glutamat reseptörleri aktive. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> Uyarılmış sodyum sinyalleri ve içe akımları Şekil 7. Farmakolojik profili. Soma bağlı (A) yama pipet (PP) ile SBFI dolu CA1 piramidal nöron (B) Sol:. Sodyum geçici ve bir dendrit kafesli glutamat foto-aktivasyonu ile tetiklenen bedensel akımı ve bağlı dikenleri Merkezi:. Ile Perfüzyon İyonotropik glutamat reseptör blokerleri CNKX ve APV sodyum sinyali ve uncaging tarafından uyarılan içe akımını hem inhibe Sağ:. bloker yıkama-out sırasında sinyalleri geri yüklenir. Kırmızı çizgi Temsilci Vekilideneysel verilerin bir uyum ts. Gri alan Uncaging flaş (300 msn) SBFI floresan görüntüleme tıkalı olduğu dönemi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonu için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons at JoVE.com

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Bu tam hücre patch-kelepçesi ve fare beyin, akut doku dilimleri dendrit ve hipokampal nöronlar dikenler Hücre içi sodyum transient çoklu foton görüntüleme ile, nöro-aktif bileşiklerin fokal UV uyarımlı foto-aktivasyon kombinasyonunu tarif eder.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K Görüntüleme.  Heinrich Heine University Düsseldorf.  Bu tam hücre patch-kelepçesi ve fare beyin, akut doku dilimleri dendrit ve hipokampal nöronlar dikenler Hücre içi sodyum transient çoklu foton görüntüleme ile, nöro-aktif bileşiklerin fokal UV uyarımlı foto-aktivasyon kombinasyonunu tarif eder. 

Video: Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Nörobilim

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

Normal ve Huntington Farelerden Akut Beyin Dilimlerinde Glutamat Salınımı ve Alımının Tek Sinaps Göstergeleri

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

Primer Fare Orta Beyin Nöronlarında Spontan Ca2+ Akılarının ve Downstream Etkilerinin Ölçülmesi

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler