Bu çalışma Yazarlar S. Durry ve C. Roderigo uzman teknik yardım için, ve M. Dubbert (Elektronik Laboratuvarı, Zooloji Enstitüsü&#39;ne teşekkür isteyen CRR için Alman Bilim Vakfı (DFG, Ro2327 / 6-1) bir hibe ile desteklenen Pockels hücresi denetleyicisi ve HF anahtarı uygulanmasında yardım için Köln Üniversitesi, Almanya).

Bu çalışma sıkı Heinrich Heine Üniversitesi Düsseldorf, Almanya kurumsal kurallarına uygun, yanı sıra Avrupa Topluluğu Konseyi Direktifi (86/609 / EEC) yürütülmüştür. (: Ø52 / 05 kurumsal Sayılı Kanun&#39;la) Tüm deneyler Heinrich Heine Üniversitesi Düsseldorf, Almanya Hayvan Bakımı ve Kullanımı Tesisi&#39;nde Hayvan Refahı Dairesi tarafından tebliğ ve onaylanmıştır. Alman Hayvan Refahı Yasası uyarınca (Tierschutzgesetz, Madde 4 ve 7), beyin dokusunun postmortem kaldırılması için resmi bir ek onay gerekli. Deney hayvanlarının Ötanazi, Lüksemburg: akut dilimleri nesil için, farenin yayımlanan Avrupa Komisyonu önerisi şu (decapitated hızla CO 2 ile anestezi edildi ve Avrupa Toplulukları 1997 Resmi Yayınlar Ofisi; ISBN 92-827-9694 -9). 1. HazırlıkÇözümler <ol><li> % 95 O 2 ile fokurdatıldı 125 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 6 MgCl2, 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3 ve 20 glikoz, (mM olarak) diseksiyon için yapay serebrospinal akışkan (ACSF) hazırlanması % 5 CO2, 7.4 olan bir pH ile sonuçlanır. </li><li> (MM olarak) ihtiva eden deneyler için ACSF hazırlayın: 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3 ve% 95 O2 ve% 5 CO2 ile kabarcıklandırılmış 20 glikoz, elde edilen 7.4 bir pH. </li><li> 150 KMeSO 3, 12.5 hidroksi etil-piperazin etan sülfonik asit (HEPES), 40 KCI, 5 NaCI, 1.25 etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 5 Mg-ATP, 0.5 Na: hücre içi çözelti (ICS), (mM olarak) hazırlanması GTP. 7.3 pH ayarlayın. -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik alikotları saklayın. </li><li> Iki kere distile edilmiş su içinde sodyum bağlayıcı benzofuran izoftalat (SBFI) TUZ seyreltilir ve 5 ul alikotları hazırlamak10 mM&#39;lik bir stok çözeltisi. </li><li> Çözülme ICS, 1 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda SBFI stok çözeltisi eklenmekte ve. Vortex ve mikro-süzüntü (0.22 mikron). Deneyde kullanılıncaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edin. Refreeze ve sadece bir gün için kullanmayın. </li><li> Çifte damıtılmış su içinde eritilmesi ile 50 mM glutamat MNI stok çözelti hazırlayın. Normal ACSF 5 mM&#39;lik bir son konsantrasyona kadar MNI glutamat stok solüsyonu ile seyreltilir. Deneyde kullanılıncaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edin. Refreeze ve sadece bir gün için kullanmayın. Derhal -20 ° C &#39;de, deneyde kullanılan olmayan mağazası alikotları. </li></ol> Doku 2. Diseksiyon Not: kemirgen beyin akut hipokampal dilimler hazırlanması daha önce 13,14 detaylı bir şekilde tarif edilmiştir. Kısaca aşağıdaki protokol bu çalışmada kullanılmıştır. <ol><li> Başlarının kesilmesi işleminden sonra, hızlı bir şekilde kafatası beyin çıkarın. </li><li> Hemen bir petri beyin yerleştirinbuz-soğuk diseksiyon ACSF ile orta hat boyunca bir sagital kesim yaparak bir yarımkürede incelemek ve. </li><li> Bir engel yüzeyi olarak istenen yönde bir ikinci kesim gerçekleştirilmesi ve güçlü bir yapıştırıcı ile bir vibratome kesme aşamasına bu ekleyin. </li><li> Haznesi kesme ve soğutucu elemanın alın bölme beyin bölümü ile dondurucu ve yer kesme aşamasında üzerinden vibratome (her ikisi de, -20 ° C&#39;de tutulur). Daha sonra oda içinde soğutma elementi koymak ve buz soğukluğunda diseksiyon ACSF doku daldırın. Hazırlanmasını stabilize etmek için, bir agar jeli ile doku bloğu karşı isteyebilir. </li><li> Vibratome ile hipokampus 250 mikron kalınlığında, parasagital dilim kesin. Tüm ACS sıvılar her zaman kabarmış emin olun. </li><li> Dilimleme sonra, normal ACSF ile bir çanak içinde bir ağ örgü üzerinde tutmak ve doku, 30 dakika boyunca 34 ° C&#39;de inkübe edin. Daha sonra oda sıcaklığında tutulması. </li></ol> Donanım 3. hazırlanması Şekil ışık yolları ve çoklu foton görüntüleme, lazer tarama UV flaş fotoliz ve elektrofizyoloji oluşan. Çoklu foton ışın (kırmızı) teçhizat deneysel kontrolünü gösteren 1. Şema darbeli bir ayarlanabilir kızılötesi (IR) lazer tarafından üretilen (Tisa). Bu lazer güç ve yönetim süresi denetimini etkinleştirmek hepsi mekanik bir deklanşör, bir Pockels &#39;hücre ve IR dedektörü (ışık yoğunluğu tespiti), geçer. Flip-in / flip-üzerinden isteğe lazer diyotu, bir lazer ışınının temel hizalanması için kullanılmaktadır. , Işın, çok geniş bir arka odak düzlemi ile objektif ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Uzaktan kontrollü önceden tekerlek ilave olarak veya bunun yerine bir lazer ışını gücünü kontrol etmek için Pockels hücresindeki kullanılabilir. Tarama kafası geçtikten sonra, darbeli kızılötesi ışık numunesine yönlendirilir. Emitted floresan ışığı (açık yeşil), harici veya dahili photomultiplier dedektörleri (PMT) yoluyla toplanır. Dış dedektörler tam bir yüksek frekans anahtarı (PMT kontrolör) ile iç PMT&#39;lerin ile senkronize edilir. Uncaging kiriş (açık mavi) UV katı hal lazer (DPSS UV-Lazer) tarafından üretilir. Daha sonra, bir ışık kılavuzu ile epi-floresan kondansatörün üst arka galvo tahrik tarama birimi yöneliktir. Hassas konumlandırma Uncaging nokta veya alan (görüntüleme ve Uncaging ışını arasındaki renk sapmaları) görüntüleme yazılımından görüntü ihracat etkindir. Görüntüleme, elektrofizyoloji ve flaş fotolizini senkronizasyonu için zamanlama yönetimi elektronik olarak kontrol edilir. Transillüminasyonu dedektörü (TL-PMT) dokusu içinde pipet konumlandırma dokümantasyonu için ihtiyaç olduğunu. Kontrol birimleri ve değiştirilmiş görüntüleme sistemi, yazılım, kontrol ve diğer cihazları senkronize etmek için kullanılırSistemi çalıştırmak için gerekli. &quot;Özel&quot; yazarlar tarafından uyarlanan / tasarlanmış ve inşa edilmiş gibi sistem bileşenleri etiketlenmiş. Bazı bileşenler özel inşa çoklu foton sisteminin gereksinimlerini karşılamak için adapte edildi ve &quot;değiştirilmiş&quot; olarak etiketlenmiş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Çoklu foton sisteminin bileşenleri açın. Test ve kızılötesi lazer ışını hizalamayı. <ol><li> Yerine bir amacın merkezleme prizması çevirerek kontrol ışın konumlandırma. Kiriş yerinden ise, periskop yılında aynalar bunu yeniden ayarlayın. Prizmanın merkezleme düzlemi ise görüntüleme hedefi arka odak düzlemi olarak aynı seviyede olması gerektiğini unutmayın. </li><li> Spektrometre açınız ve kirişin çoklu foton özelliklerinin kontrol edin. </li><li> Aşağıdaki değerlere görüntüleme yazılımı parametreleri ayarlayın: Seçiniz(yüksek kare hızı ve yüksek uzaysal çözünürlüğü için sırasıyla 2.5 yakınlaştırma faktörü ile daha küçük klip kutuları) hücre bakış görüntüler için 512 x 512 piksel bir kare boyutu. Hızlı modu ve XYT tarama moduna ayarlayın görüntüleme hızı. Z-step sonra yapılan deconvolution için uzamsal örnekleme gereksinimlerini karşılamak için detaylı yığınlarının için 1 genel yığınları için mikron ve 0.2 mikron olmalıdır. </li></ol></li><li> Ve fotoğraf-çarpanları (PMT) -: (16 μW ≈ 14 hedefi altında nihaî güç) Pockels &#39;hücre ayarlarını değiştirerek çoklu foton lazer ışını (790 nm) yoğunluğunu ayarlayın. </li><li> Açma ve objektif mercek altında floresan örnek slayt koyarak Uncaging sistemini kalibre. <ol><li> Dürbün kullanarak, UV optik odak ayarlamak ve mekansal UGA tarama kafasına odaklama birimi kullanılarak maksimum çapı 2 mikron arasında bir boyuta UV lazer nokta sınırlar. </li><li> Uncaging ünite kontrol Softwar kalibrasyon rutin başlayınör. <ol><li> Floresan, bir CCD kamera ile elde edilir ise, bunun tarama aralığı içinde çeşitli noktalarına UV lazer ayarlayın. Her noktada UV lazer noktada tıklayarak, yazılım koordine belli bir karşılık için galvanik tarama aynalar konumlandırma ayarlayın. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig2highres.jpg" width="500" /> Uyarma, emisyon ve Uncaging ışın yollarının özelliklerini gösteren Şekil 2. Ayrıntılı şeması. IR uyarma ışın (kırmızı) mikroskop epi-floresan kondansatör ve amacı için dosyalayıcı tarete düzeyde dikroik ayna birleştirerek ışın geçer Numuneyi ulaşır. Uncaging kiriş (mavi) tarama mil üniteyi odaklama kolimasyonu ve kiriş bir kuvars optik ışık fiberden ve sonradan yönlendirilirtarama biriminde rrors, kiriş birleştirme dikroik ayna bir dikroik aynayı geçer. Burada uyarım tarama kiriş ile birleştirilmiştir. Örnekten yayılan ışık görüntü tarama kafasına doğru ters yönde eksitasyon taraması, ışın yolunun yolunu izler. Kamera yama pipet görsel kontrolü için ve odaklı lazer tarama mikroskobu ile kombinasyon halinde Uncaging kirişin konumlandırma için kullanılabilir (gösterilmemiştir). Yeşil ışık yolu diğer uygulamalar ile kullanım olabilir isteğe bağlı epi-floresan aydınlatma temsil eder. <ol start="3"><li><ol start="2"><li><ol start="2"><li> Fokal uygulamaları kazanmak için nokta modunda flaş potoliz sistemini kullanın. Emin olun (hedef altında ortalama güç: 0.55 mW) olması Uncaging ışınının odak ayarlaması çapı 1,5 um (xy uzantısı) bir nokta boyutu ile sonuçlanır z düzeyinde yerleştirilmiş bir floresan slayta ortaya olarak tekabül Dokudilim (gösterilmemiştir). </li></ol></li><li> Uncaging nokta doğru konumlandırma uncaging- ve görüntüleme-bilgisayar arasında bir ağ bağlantısı üzerinden görüntüleme sisteminin bir görüntünün ithalat ile elde edilir. <ol><li> Bir ekran kapmak yazılımı kullanarak, sürekli görüntüleme yazılımı (yerine kamera besleme) çerçeveleri okumak ve örtüşecek görüntüleme ve Uncaging çerçeveleri ayarlayın. Flaş ünitesinin içine bir referans görüntü tüm deney sırasında uygun ayarı sağlamak için görüntüleme yazılımı her 10. kareyi ihracat. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Şekil 3," fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil Uncaging nokta 3. Ayarı: tam Uncaging nokta, Uncaging yazılım (yeşil çerçeve) ithal edilir görüntüleme yazılımı (sarı çerçeve) bir ekran görüntüsü konumlandırmak için.Tüm CA1 piramidal hücre (doymuş piksel: siyah pikseller, kırmızı, mavi) sarı çerçeve içinde sol görüntü bir Hi-Lo kodlu görüntüyü temsil eder. Görüntü Uncaging yazılımı (yeşil bir &quot;X&quot; ler) in kalibrasyon ızgara tarafından örtülmektedir. Sağında, hücrenin büyütülmüş bir parçası Kaplanmış Uncaging nokta (kırmızı çapraz) ile gösterilir. Sarı nokta Uncaging kirişin otomatik olarak üst üste görüntü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="4"><li> Hedef bölgeye kafesli bileşiğin teslimat için mikromanipülatörler, elektrofizyoloji bileşenleri ve basınç uygulama cihazı açın. </li><li> Kafesli bileşiklerin lokal perfüzyon için bir odak basınç uygulama cihazı takın. Bu maddelerin Banyo perfüzyonu ile karşılaştırıldığında, bu son derece maliyetlerini azaltacaktır. AC bir nefes önlemek için belirli bir atmosfer basıncına tutan basınç ayarlamaIçine SF veya uygulama pipetle kafesli maddelerin kaçak. NOT: basınç uygulama cihazı pipet tutucu son derece hassas ve ultra hızlı mikro-valf ev sahipliği yapıyor. Bu minimum uygulama basınçların kullanılması mümkün kılar ve bu nedenle kafesli bileşiği ile perfüzyon sırasında yerel minimum hareket dıştan müdahale ürünlerini indirgemektedir. </li><li> Yangın cilalı borosilikat cam kılcal damarları kullanarak tüm hücre yama kelepçe ve yerel perfüzyon için pipetler çekin. Pipetler ~ 1 um&#39;lik bir uç çapına ve R ≈ 3 MW (K-3 mezo merkezli, ICS ile tespit edilmiş değerlerin) bir dirence sahip olmalıdır. </li><li> Yer deneysel banyosunda dilim ve bir ızgara ile yapıştırın (Şekil 4A, B) (250 mikron kalınlığında platin çerçeve, cerrahi iplikler ile yayılmış 40 mikron od). Dilim transferi için (kırık ucu tarafında emme topu) bir ters, ucu kırık ve yangın cilalı Pasteur pipet kullanın. Bükme ve dilimin herhangi bir diğer sert taşıma kaçının. </li></ol&gt; <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil mikroskop aşamada deney banyo ve banyo konumlandırma 4. Bileşenleri (A). Deney banyosu Manyetik metal halkayla çevrelenmiş olduğu bir banyo cebin (mavi kare) oluşur. Boru tuzlu su (ACSF) ile banyo sürekli perfüzyon sağlar. Basılı tutun ve dilim düzeltmek için ızgara banyo odasına konur. Banyo odasının içinde konumlandırılmış (B) Akut dilim hazırlık. Dilim ızgara parçacıkları tarafından tespit edilir. (C) Konumlandırma ve mikroskop aşamada deneysel banyo geometri deneyler sırasında. <ol start="8"><li> ACSF dilim serpmek kalıcı mikroskop aşamada banyo yerleştirin ve. </li></ol> 4. Tüm hücre Patch-sıkma <ol><li>SBFI içeren ve kafesli bileşik ile lokal perfüzyon pipet yüklemek ICS yükleyin yama pipet. İlgili mikromanipülatörler pipetler takın. Banyosunda referans elektrot yerleştirin. Eğer baş aşamasında (cf Şekil 4C) zarar vermemek için kalıcı topraklı emin olun. </li><li> Banyoya hem pipetler indirin ve hipokampal CA1 bölgesinde yukarıda koyun. ACSF ICS seyreltme önlemek için yama pipet (+40 mbar) hafif bir basınç uygulayın. </li><li> Elektrofizyoloji yazılımı kullanılarak yama pipet ofset potansiyelini dengeleyin. </li><li> IR-DIC Video mikroskopi kullanılarak yama pipet ile bir CA1 piramidal hücre yaklaşın. Giga-mühür elde edilinceye kadar nazik vakum uygulayın. Bir hücre, diğer taraftaki Uncaging ışınının bir taraftan düşük dağılma ve zayıflama ile sağlam hücre morfolojisi sağlamak için dilim yüzeyinin altında 30 -70 um arasında bulunduğu soma seçin. </li><li> Hızlı kapasitesini telafi. Arası membranE ve açık hücre bütün hücre yapılandırmasını kazanmak için. </li><li> Yavaş kapasite ve seri direnç için telafi eder. </li><li> Hücre görüntüleme bir deney başlamadan önce en az 30 dakika boyunca SBFI-ICS ile diyalize izin verin. </li></ol> 5. Çoklu-foton görüntüleme ve stimülasyon <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig5highres.jpg" width="600" /> Şekil 5. Deneysel protokol. Deney, (kırmızı işareti (ᴨ) ve kırmızı çizgi ile gösterilen) bir pals başlatmak için aynı anda görüntüleme (mavi), elektrofizyoloji (yeşil) ve kafesli yönetimini başlatmak için ayarlanır zaman noktası 0 sn bileşik (sarı). Bu ilk dönemde, görüntüleme kiriş tamamen (mavi ışık) soluk edilmelidir. 4.5 s (kesikli çizgi) sonra, kafesli bileşiğin lokal perfüzyon sonlandırılır ve görüntüleme demet kel ayarlanmalıdırveri toplama (mavi) için kral yoğunluğu. Sarı flaş gösterilen; 300 msn&#39;den: 1.5 sn sonra (zaman noktası 6 sn), ikinci bir pals verilen UV flaş birimi (flaş süresini başlatır, (kırmızı işareti (ᴨ) ve kırmızı çizgi ile gösterilen) bir ) ve elektrofizyoloji ve görüntüleme protokolünde göstergesini belirler. <ol><li> Aksiyon potansiyellerinin voltaj-kapılı sodyum kanallarının aktivasyonu ve oluşumunu önlemek için ACSF için Tetrodotoksin (TTX, 500 nM) ekleyin. </li><li> Çoklu foton uyarılması ile ve SBFI floresan edilen hücresel morfoloji görselleştirmek ve deney için bir dikenli dendrit seçin. Daha yüksek çözünürlükte görüntüler için büyüt ve dendrit etrafında bir klip kutusu yerleştirin. </li><li> Kafesli glutamat içeren 10 ul ACSF ile standart bir yama pipet doldurun. Basınç uygulama sistemi için pipet bağlayın ve micromanipulator takın. </li><li> Dendritin yakın kafesli bileşik (~ 30 mikron) ile pipet yerleştirin. Izin pipet yerleştirinseçim dendritin etkin yerel perfüzyon. Uncaging lazer ayarlayın: yakın Uncaging noktaya konumu - ilgi yapısına (~ 1 2 mikron). </li><li> Seçilen dendritin faiz ve görüntüleme yazılımı kullanarak komşu dikenler Set bölgeleri. </li><li> Ilgi bölgeyi yaklaşım ve fokal düşük basınç ile birkaç sn (&lt;3 PSI) için kafesli bileşik enjekte. Tetikleme sinyali ile yama kelepçe ve (790 nm çoklu foton uyarma) floresan kayıtları başlatın. NOT: kafesli bileşiğin yerel perfüzyon sırasında, uyarma ışın tamamen beyazlatma önlemek için soluklaşır. </li><li> Kafesli bileşik yerel perfüzyon durdurun. SBFI verimli uyarma etkinleştirmeniz ve Uncaging (Uncaging süresi 300 msn&#39;den) başlatmak için UV flaş uygulamak için iki foton lazer yoğunluğunu artırın. </li><li> SBFI floresan değişiklikleri izlemek. SBFI floresan başlangıç ​​noktasına geri kurtarıldı sonra kaydı durdurmak. </li></ol> 6. Farmakoloji <ol><li> Reseptör blokerleri istihdam, kafesli glutamat UV flaş fotoliz uyandırdığı akım ve / veya sodyum sinyalleri üretimi, iyonotropik glutamat reseptörlerinin yer aldığını test etmek için. <ol><li> AMPA-reseptör bloke edici siyano-nitrokuinoksalin-dion (CNQX, 10 uM) ve TTX (yukarıya bakınız) ek olarak NMDA-reseptör bloke edici-amino-phosphonopentanoate (APV, 50 uM) ihtiva eden geçiş ACSF ve en az 10 bir dilim serpmek Min. </li><li> Tekrar stimülasyon prosedürü (5.4 ve 5.5 bakınız.) </li></ol></li><li> Engelleyicilerin etkilerinden geri dönüştüğü <ol><li> Sadece TTX içeren normale ACSF geri dönün. </li><li> 20 dakika boyunca dilim serpmek. </li><li> Tekrar stimülasyon prosedürü (5.4 ve 5.5 bakınız.). </li></ol></li></ol> 7. Morfoloji <ol><li> Yapılan ölçümler için klip kutu bölge kümesinin bir XYZ-yığını kaydedin. Bu yığın oversample olduğundan emin olunuzamsal (piksel başına en az 0.2 mikron) en iyi görüntü dekonvulasyon etkinleştirmek için d ve görüntü kalitesi ve çözünürlüğü artırmak için. </li><li> Hücre morfolojisini değerlendirmek için tüm hücrenin bir XYZ-yığını kaydedin. </li><li> Çalıştırın dekonvolüsyon algoritması. </li></ol>

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes.">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li><li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li><li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li><li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na++influx+between+axon+and+soma.">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li><li>Denk, W., Piston, D., Webb, W., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 445-458 (1995).</li><li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons.">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mobility+in+muscle+cells.">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li><li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups.">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li><li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm:+photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim. Yazarlar video makalede kullanılan bir alet üreten Rapp optoelektronik (Wedel, Almanya), tarafından Açık Erişim yayını sağlayan mali destek aldı. Şirket deneylerde ne veri işleme ne de el yazması yazı yer ne oldu.

Bu çalışma, SBFI küçük hücresel bölümlerinde Hücre içi sodyum transient iki foton görüntüleme için uygun olduğunu göstermektedir. Bu SBFI kuantum etkinliği, sodyum konsantrasyonu oldukça azdır, 15 ve nispi değişikliklerin fizyolojik aktiviteye sahip oldukça küçük olduğu, ancak, akılda tutulmalıdır. Böylece, ince süreçlerin Na + Transientlerin yüksek çözünürlüklü ölçüm nispeten sıkıcı bir iştir, ve birkaç deneme binning veya ortalama tatmin edici sinyalleri elde etmek için gerekli olabilir. Ayrıca, sodyum Transientlerin kinetik uzun süreler için kayıt zorunlu hale şaşırtıcı yavaş. Bu gözlem, nöronal dendritler ve astrositlerin sodyum transient monoexponential bozunma oda sıcaklığında 1,2,6 10 saniye aralığındaki büyük bozulma süresi sabiti ile karakterize edilir burada daha önceki çalışmalarda, olanlara karşılık gelir. Sodyum geçici Bu şekilde çok daha düşük bir zaman co gösterir gibi görünürURSE ve kalsiyum geçici 16 oranla çok daha büyük bozulma zaman sabitleri. Bu sakıncaları bir kenara, sodyum görüntüleme nöronal alt etki fizyolojik özelliklerinin araştırılması için değerli bir araç olduğunu kanıtlıyor. Örneğin, sodyum görüntüleme ya da yakın aktif sinaps uyarıcı sinaptik aktivitesini izlemek için hizmet edebilir. Sodyum esas 8,17 tamponlanmamış için, aktivitesi ile uyarılan geçici sodyum doğrusal sinaptik glutamat salınımı geniş bir ilişkili ya da dışsal olarak glutamat uygulanır. Bu nedenle bir nöronal Glutamaterjik aktivitenin doğrudan ve tarafsız göstergeleri temsil eder. Ayrıca, sodyum göstergesi boyalar yüksek K d &#39;(SBFI en Kd 25 aralığında mM 1 ise) sergilerler. (- 1 mM genellikle 0.5), yüksek Kd &#39;nin boyaları kendileri s tampon olarak hareket yok olduğunu ima bile yeterli bir parlaklık elde etmek için kullanılan nispeten yüksek hücre içi boya konsantrasyonlardaiğrençlik. Sonuç olarak, onlar kalsiyum duyarlı boyalar hücrelere 18 sokulur her zaman bir endişe olduğu, sodyum Transientlerin genlik ne zaman ders bozmaz. Bu nedenle bulgulanan sinyaller, hücre içi sodyum, &quot;gerçek&quot; değişiklikleri iyi bir ölçümünü temsil ettiği kabul edilebilir. Bunların yavaş olan süreçleri nöron sodyum için hücre içi difüzyon hızı önceden tahmin 19 daha küçük olduğu anlamına gelir. Dikenler ve dendritler içine uyarıcı sinaptik iletim ve sodyum akını yolların özelliklerini ele deneylerin başarılı bir şekilde yürütülmesi için önemli bir gereklilik postsinaptik yapıların hızlı ve son derece lokalize aktivasyon indüksiyon olduğunu. Bu, bir omurga bölgesinin hemen yakınında ya da kafes bileşiklerin flaş fotoliz dendritlerin glutamat glutamat agonistleri ve hızlı yerel uygulanması ile elde edilebilir. Flaş potoliz değil mekanik Dama yokge doku, hareket eserler ücretsiz ve bununla ilgili sorular soruşturma için (örneğin, yerel kalsiyum sinyalizasyonu) kuruldu. Uncaging spot çapı xy düzleminde 1,5 um idi. Uncaging hem dikenleri bir dikenli dendrit kaynaklı sodyum sinyalleri yakın ve ana dendrit. Sinyalleri Uncaging noktaya en yakın dikenler büyük olma eğilimi ise, ana dendrit amplitüdleri ve omurgaları daha uzakta hala Uncaging noktasının hemen yakınında kişilerce oldukça benzerdi. Uncaging içeri doğru akımlar amplitüdünün artış sırasında 300 milisaniye boyunca uygulandı. Uncaged glutamat daha uzakta Uncaging yerden dendritik bölgelere ve dikenler üzerinde İyonotropik glutamat reseptörleri ve sodyum akışını aktive aynı dönemde dokuda yayılmış olabilir. Hücre banyo çözümü aracılığıyla uygulanan kafesli bileşiklerin photolysis için UV lazer kullanılarak oluşur içsel bir sorun&#39;İç filtreleme&#39; olduğunu. Çünkü kafesin yüksek emme oranı, UV ışığı uyarım siteye 20,21 için hedeften yol boyunca güçlü zayıflatılmaktadır. Bunu önlemek için bir uygun yol, sadece, ayrıca en az bir kafes için gerekli bileşik miktarını azaltır uyarı bölgesinden, sınırlıdır kafes yerel bir perfüzyon. UV lazer tarama aracılı Uncaging, yakın enfraruj, iki foton ile karşılaştırıldığında, 22 Uncaging stimülasyon doğruluğu z ekseni artar çünkü esas olarak, uzaysal olarak daha hassas. Diğer taraftan nedeniyle, iki foton uyarılması ile birlikte kullanılan bir yüksek kafesli bileşik konsantrasyonu ya da çok yüksek olmak üzere, potansiyel olarak fototoksik ışık yoğunlukları gereken daha uzun dalga boyları için yaygın olarak kullanılan kafeslerin küçük kesitine. Ayrıca, iki foton Uncaging ekipman çok daha yüksek bir yatırım gerektirir; diğerlerinin yanı sıra, ek bir kızılötesi lazer artı gerekli olan optik bileşenler ihtiyaç vardır. SBFI ve MNI-glutamat ikisi de aynı dalga boyu aralığında uyarılabilir bulunmaktadır. Bu, flaş Uncaging ve / veya kızılötesi ışın ile glutamat sürekli uncaging ile SBFI ağartılmasında sonuçlanan UV Uncaging lazer ve SBFI veya kızılötesi görüntüleme lazer ve MNI-glutamat istenmeyen bir ara bağımlılığı yol açabilir. Şekil 6C&#39;de gösterildiği gibi Ne var ki, tek başına veya çoklu foton görüntüleme ile, UV flaş bizim deney koşulları altında, bu karşılıklı etkilere neden olmuştur. Burada açıklanan benzer UV flaş sistemler, pek çok diğer laboratuarlarda rutin olarak kullanılır ve nispeten kolay herhangi mevcut bir foton görüntüleme mikroskop içine dahil edilebilir. Bu fotoliz için lazer ışını görüş alanında serbestçe konumlandırılabilir avantajını sunmaktadır. Buna ek olarak, sistem bir deney sırasında, görüş alanı sırasıyla lazer ışınının hızlı ve otomatik yeniden konumlandırılması ve serbest hacmi, sağlar. OuR modifikasyon kolaylaştırır ve görüntüleme yazılımı çerçeveleri örtüşecek görüntüleme ve Uncaging çerçeveleri ayarlamak üzere iş görmektedirler, böylece Uncaging noktasının doğru konumlandırma artırır. Birlikte ele alındığında, glutamat UV ışık kaynaklı uncaging için modifiye edilmiş bir prosedür ile birlikte dendrit ve merkezi nöron dikenler tam hücre patch-clamp ve çoklu foton sodyum görüntüleme, doku glutamat reseptörlerinin, güvenilir ve fokal aktivasyonunu sağlar. Böylece, sağlam doku nöronların uyarıcı sinirsel iletimin ve postsinaptik sodyum sinyallerin özelliklerini analiz etmek için hizmet edebilir.

Bu tür çoklu foton mikroskopi gibi hafif mikroskobik tekniklerindeki son gelişmeler, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip sağlam doku beyin hücrelerinin morfolojik ve fizyolojik parametrelerin çalışma sağlamıştır. Elektrofizyoloji ile birlikte, bu teknikler artık yaygın yani ince dendritler ve dendritik dikenler, küçük subselüler bölümlerinde nöronlar üzerinde etkinlik ile ilgili elektrik sinyalleri yanı sıra eşlik eden kalsiyum sinyalleri analiz etmek için kullanılır. Kalsiyum geçici ek olarak, sinaptik etkinliği de dendrit ve omurga içinde sodyum sinyalleri uyarır özellikleri büyük oranda araştırılmamıştır. Bu tür sinyaller [Na +] önemli boya ağartma veya foto-hasarı 1,2 vermeden uzun süre i Transientlerin on-line ölçüm sağlar hücre içi sodyum iki-foton görüntüleme ([Na +] i) ile analiz edilebilir. [Na +] i görüntüleme için </&gt; alt sadece birkaç kimyasal gösterge boya maddeleri, örneğin korona Yeşil veya Asante Sodyum yeşil 3,4 mevcuttur. Na görüntüleme için en yaygın biçimde kullanılan flüoresan prob sodyum bağlayıcı benzofuran izoftalat (SBFI) &#39;dir. Bu iyi bilinen kalsiyuma duyarlı boya Fura-2&#39;ye benzer bir oran ölçer, UV ile uyarılmış ve boya (örneğin, 5,6), birçok hücre tipinde, geleneksel Na görüntüleme için kullanılmıştır. Heyecan verici boya ve floresan toplama farklı olasılıklar vardır. Yüksek temporal çözünürlük (yani yüksek görüntüleme kare hızı) mekansal bilgi ile birlikte gerekiyorsa, SBFI yüksek hızlı şarj ile tespit ksenon ark lambasından veya yüksek güç ışık yayan diyot (LED) cihaz ve emisyon ile heyecanlı olabilir -coupled cihaz (CCD) kamera 7,8. Derin doku, maksimal uzamsal çözünürlük için, çoklu foton lazer tarama mikroskobu tercih 9 yöntemdir. Nispeten düşük kuantum efficie(- 2 mM 0.5) ve keskin bir mikroelektrot 10 veya yama pipet 1 ile SBFI membran geçirmeyen biçiminin doğrudan yükleme SBFI arasında ncy nispeten yüksek boya konsantrasyonları gerektirir. SBFI kullanarak, kemirgen hipokampus akut doku dilimleri yapılan önceki çalışmaları ağırlıklı olarak 1,2 reseptörleri İyonotropik NMDA ile sodyum akını kaynaklanır CA1 piramidal nöronların dendrit ve dikenler etkinlik ile ilgili sodyum transientler gösterdi. Daha ayrıntılı olarak, yerel sodyum sinyallerin özelliklerinin çalışma için, reseptör agonistlerinin uygulanması ile postsinaptik reseptör özgü aktivasyon tercih edilen bir çok uygun bir yöntemdir. Presinaptik aktivite ve verici salınımını taklit etmek, uygulama nispeten kısa olması ve yerel uyarımı sağlamak için odaklı olmalıdır. Ancak bu, sağlam dokularda oldukça zor olduğu kanıtlanmıştır. Ince uçlu bir pipet kullanarak reseptör agonistlerinin lokal basınç uygulanması çok odak ap sağlarkatmer, ama (böyle bir dendrit ve dendritik dikenler gibi örneğin) ilgi yapısının hareketini üretmek için potansiyel risk barındıran ve böylece yüksek çözünürlüklü görüntüleme engellemektedir. Nöro-aktif maddelerin iyontoforez uygunluğu elektrik durumuna bağlıdır ve yüksek akım genlikleri, hem de hücresel eserler üretebilir. Bu engelleri aşmak için bir yol fotoğraf aktive bileşiklerin ve bunların flaş photolysis istihdam olduğunu. Temel olarak iki farklı prensipler kafesli maddeler foto-aktivasyon için kullanılır: 12 ile birlikte lazer tarama modülleri kullanılarak I) &#39;in geniş alan flaş fotoliz ve 11 II)&#39; fokal Uncaging. Geniş alan flaş potoliz ilgi geniş bölgelerini aktive etmek için kullanılır iken, örneğin bütün bir hücre, odak Uncaging özellikle küçük hücresel bölmeleri uyarmak için kullanılır. Bu çalışmada biz tüm hücre yama-kelepçe ve çok p bir prosedür göstermekDokuda, glutamat reseptörlerinin, güvenilir ve fokal hareketliliğe olanak tanıyan glutamat UV ışık kaynaklı uncaging, modifiye edilmiş bir prosedür ile birlikte dendrit ve merkezi nöron dikenler hoton sodyum görüntüleme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:239px;">Hadrware/Software Component</td>
			<td style="width:231px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:183px;">Type</td>
			<td style="width:487px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1405059</td>
			<td>75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>ProgRes MF</td>
			<td>IR-DIC compatible camera</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>Huygens Pofessional X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fiber optic spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>USB 4000</td>
			<td>Miniature fiber optic spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Filter tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cenrifugal filter, 0.2 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging software</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR beam power controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR laser</td>
			<td>SpectraPhysics</td>
			<td>Mai-Tai VF-N1S</td>
			<td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR power monitor</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Micromanipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>PCS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Microscope/Imaging System</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>BX51WI/FV300</td>
			<td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">ND filter wheel</td>
			<td>Newport</td>
			<td>50Q04AV.2</td>
			<td>UV fused silica, optical density 0.05-2.0</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Objective</td>
			<td>Nikon Instruments Europe</td>
			<td>NIR Apo 60x/1.0w</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>NPI Electronic</td>
			<td>PDES-DXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80 LA-BK</td>
			<td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell driver</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M302-RM</td>
			<td>High voltage differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>LS6ZM2</td>
			<td>ALMgF2-coated BeCu blades</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter driver</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>Uniblitz VCM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Slicer / Vibratome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Uncaging software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser&#160;</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-355/10</td>
			<td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser scanning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA 40</td>
			<td>Galvanometric scanning system</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Name of Compound</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CNQX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">SBFI K+ Salt</td>
			<td>Teflabs</td>
			<td>OO32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">NMI-caged-L-Glutamate</td>
			<td>Torcis</td>
			<td>1490</td>
			<td>Caged glutamatereleased upon UV absobtion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

Çoklu foton floresan mikroskopi yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip sağlam doku beyin hücrelerinin morfolojik ve fizyolojik parametrelerin analizini sağladı. Elektrofizyoloji ile birlikte, yaygın olarak dendrit ve dendritik dikenler gibi küçük subselüler bölümlerinde etkinlik ile ilgili kalsiyum sinyalleri incelemek için kullanılır. Kalsiyum geçici ek olarak, sinaptik etkinliği de postsinaptik sodyum sinyalleri, sadece marjinal anlaşılmalıdır ki özelliklerini neden olur. Burada, merkezi nöronların hücre mikro etki kombine tam hücre patch-kelepçesi ve çoklu foton sodyum görüntüleme için bir yöntem tarif eder. Ayrıca, doku, glutamat reseptörlerinin, güvenilir ve fokal hareketliliğe olanak tanıyan, ultra viyole (UV) ışığı-glutamat kaynaklı uncaging için modifiye edilmiş bir prosedürü getirmektedir. Bu amaçla, tam-hücre kayıtları cornu ammonis alt bölüm 1 (CA1) akut doku dilimleri piramidal nöronlar üzerinde gerçekleştirilmiştirFare hippocampusu. Nöronlar yama pipet ile sodyum duyarlı floresan boya SBFI ile dolu, ve SBFI çoklu foton uyarma dendritler ve komşu dikenler görselleştirme sağlanmıştır. UV yol açtığı fokal uncaging oluşturmak için, ışık yoğunluğu, UV ışın Uncaging etkilenen hacmi, ışının pozisyonu ile kafesli bileşik konsantrasyonuna dahil olmak üzere birçok parametre olarak test edilmiş ve optimize edilmiştir. Bizim sonuçlar kafesli glutamat (MNI-Glutamat) ile yerel perfüzyon ve dendritler ve dikenler içe akımlar ve sodyum geçici onun odak UV-Uncaging sonuç gösterebilir. Bir zaman ve içeri doğru akımlar ve sodyum sinyalleri hem genlik Uncaging palsın süresi ile ilişkilidir. Ayrıca, sonuçlar, bu yolun da sodyum girmesi aracılık ettiğini gösteren hücre içi sinyaller sodyum iyonotropik glutamat reseptörleri için bloker varlığında bloke olduğunu göstermektedir. Özetle, bizim yöntem için güvenilir bir araç sağlarsağlam beyin dokusunda fokal reseptör aktivasyonu tarafından uyarılan hücre içi sodyum sinyallerinin incelenmesi.

Bu çalışmada, akut fare hipokampal doku dilimleri CA1 piramidal nöronlarda natriyuma bağlı floresan boya SBFI Hücresel sodyum dinamiklerinin çoklu foton mikroskopi için bir prosedürü göstermektedir. Ayrıca, nöro-aktif bileşiklerin lazer tarama-tabanlı uncaging (örneğin kafesli glutamat) ve hücresel mikro-etki hedefleyen onun kesin olan bu görüntüleme tekniği birleştirmek için nasıl gösterir. Yama pipet ile SBFI ile olan yükleme, nöronlar ince dendrit ve çoklu foton uyarılması kullanılarak bitişik dikenler (Şekil 6 A, B, D ve Şekil 7A) dahil olmak üzere bütün hücre görselleştirme sağladı. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil 6. Sodyum sinyaller ve kafesli glutamat flaş photolysis tarafından uyarılan sinaptik akımlar. (A) Maximyama pipet (PP) üzerinden SBFI yüklü bir CA1 piramidal nöron al projeksiyon görüntüsü. Kutusu B. LP büyütülmüş olarak gösterilen alan kafesli glutamat yerel perfüzyon için pipet konumunu ve yönünü gösterir gösterir. (B) bitişik dendritik dikenler ile dendritlerin optik bölümleri bir yığının Yüksek güç maksimum projeksiyon. Optik kesit yığınları z hizalama ve dekonvulasyon uygulandı. Kırmızı çapraz Uncaging ışınının hedef bölgeyi gösterir. Turuncu noktalı çizgi floresans emisyon kaydedildiği ilgi bölgesini belirlemektedir. (Sarı flaş ile gösterilir) kafesli glutamat flaş photolysis oluşturduğu akım (alt satır) içeri Sodyum sinyali (üst sıra) ve somatik: kutusu Sol D. (C) büyütülmüş olarak gösterilen bölgeyi gösterir. Kırmızı çizgi, deneysel verilerin bir uyumu temsil eder. Gri alan dönemini temsil eden Uncaging flaş (300 içindekafesli glutamat ile ön-perfüzyon olmadan, aynı UV flaş ne SBFI emisyonunda bir değişiklik, ne de içe doğru bir akım uyarılmış (D) Sol:. msn) Sağ SBFI floresan görüntüleme engel. dendrit ve bitişik Yüksek güç imajını yanı sıra B&#39;de tarif gibi, ters gri değerleri ile aynı görüntüyü spines. Noktalı çizgiler, floresans emisyon kaydedildiği ilgi olduğu bölgeleri belirtmektedir. Kırmızı çapraz Uncaging kirişin lokalizasyonu gösterir Sağ:. Kafesli glutamat UV-flaş photolysis tarafından uyarılan Sodyum transientler. Mavi iz: dendritin sodyum sinyalleri; kırmızı iz: Uncaging noktaya bitişik üç diken yanıtı ortalama; yeşil iz: uzak üç diken yanıtı ortalama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonu için lütfen buraya tıklayın.</a> Kafesli yerel perfüzyon sonraglutamat, bir dendrit yakın UV flaş uygulanması Hücre içi sodyum konsantrasyonu (Şekil 6C, D ve Şekil 7B) bir artışla, SBFI floresan emisyonunda bir düşme gözlendi. Aynı zamanda, içeri doğru akım soma (Şekil 6C ve Şekil 7B) kaydedildi. UV flaş süresini artırmak sistemi de dinamik aralığı içinde ve Uncaging ne de hücresel tepkiler de doymuş olduğunu olduğunu göstermektedir, her iki akım ve sodyum sinyalleri (veri gösterilmemiştir) içeri doğru ortaya genliklerini artmasına neden. Kafesli glutamat ile önceden perfüze değil dilimleri aynı ya da daha uzun bir süre için bir UV flaş uygulanması, bu sinyaller glutamat uncaging (Şekil 6C) bağlı olduğunu gösteren, SBFI floresan veya içeri doğru akımlar ortaya değişiklik olmadı. Ayrıca, bu sonuçlar imaging- ve Uncaging bileşenlerin herhangi bir bağımlılık u görülmektedir olduğunu göstermektedirBizim deneysel koşullar nder. Sodyum sinyaller de dendritik dikenler (Şekil 6D) tespit edilebilir. Biz sadece glutamat uncaging tek bir omurga hareketini elde girişimi yoktu iken, genlik zirve dikenler daha uzakta ana dendrit (Şekil 6D) gibi hemen hemen aynı floresan değişiklikler göstermesine karşın, Uncaging yakın nokta dikenler biraz daha yüksek olma eğilimindeydi. Son olarak, glutamat uncaging yanıt dendritler ve dikenler içine sodyum girmesi için yolu okudu. Bu amaçla, sırasıyla AMPA- ve NMDA alt tipi, sodyum geçirgen iyonotropik glutamat reseptörleri için selektif blokerler oldukları, CNQX ve APV yararlanılmıştır. Sonuçlarımız, glutamat ile indüklenen hücre içi sinyal ve sodyum ortaya çıkardı somatik akımlar bu bloke edicilerin (Şekil 7B) mevcudiyetinde ihmal olduğunu göstermektedir. Bloker yıkama-out sırasında, sinyalleri yeniden kazandırılır. Bu tha gösteriyorglutamat t Uncaging hücre içi sodyum geçici ve içe akımları sonuçlanan, dendritler ve dikenler içine sodyum akını aracılık CA1 piramidal nöronlar üzerinde İyonotropik glutamat reseptörleri aktive. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> Uyarılmış sodyum sinyalleri ve içe akımları Şekil 7. Farmakolojik profili. Soma bağlı (A) yama pipet (PP) ile SBFI dolu CA1 piramidal nöron (B) Sol:. Sodyum geçici ve bir dendrit kafesli glutamat foto-aktivasyonu ile tetiklenen bedensel akımı ve bağlı dikenleri Merkezi:. Ile Perfüzyon İyonotropik glutamat reseptör blokerleri CNKX ve APV sodyum sinyali ve uncaging tarafından uyarılan içe akımını hem inhibe Sağ:. bloker yıkama-out sırasında sinyalleri geri yüklenir. Kırmızı çizgi Temsilci Vekilideneysel verilerin bir uyum ts. Gri alan Uncaging flaş (300 msn) SBFI floresan görüntüleme tıkalı olduğu dönemi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonu için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons at JoVE.com

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Bu tam hücre patch-kelepçesi ve fare beyin, akut doku dilimleri dendrit ve hipokampal nöronlar dikenler Hücre içi sodyum transient çoklu foton görüntüleme ile, nöro-aktif bileşiklerin fokal UV uyarımlı foto-aktivasyon kombinasyonunu tarif eder.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K Görüntüleme.  Heinrich Heine University Düsseldorf.  Bu tam hücre patch-kelepçesi ve fare beyin, akut doku dilimleri dendrit ve hipokampal nöronlar dikenler Hücre içi sodyum transient çoklu foton görüntüleme ile, nöro-aktif bileşiklerin fokal UV uyarımlı foto-aktivasyon kombinasyonunu tarif eder. 

Video: Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Gerilim duyarlı Boyalar ile Yengeç Stomatogastric Ganglion Nöronlar Optik Görüntüleme

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Nörobilim

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Hücre içi Kaydı, Duyu Alan Haritalama ve Sülük de Kültüre Belirlenen Nöronlar Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Astrositik Transporter Akımlar bir Dekonvolüsyon Analizi ile Glutamat Gümrükleme gün Dersin türetilmesi

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Odak Radyolojik Geciktiricisinin Erişkin Hipotalamus nöron Fonksiyonel Sorgulama

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon ile Burun Biyopsi Kombine yoluyla elde Koku Nöronlar: Mental Bozuklukların Tedavi Tepki Eğitim Bir Potansiyel Yaklaşım

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

Nöronlar 3-D Görüntüleme ve Analiz Enfekte<em&gt; İn Vivo</em&gt; Ile<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to study the molecular composition of membranes produced a significant decline in its use. Recently, there has been a major revival in freeze-fracture electron microscopy thanks to the development of effective ways to reveal integral membrane proteins by immunogold labeling. One of these methods is known as detergent-solubilized Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL).
The combination of the FRIL technique with optogenetics allows a correlated analysis of the structural and functional properties of central synapses. Using this approach it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their respective expression of a tagged channelrhodopsin and specific molecular markers. The distinctive appearance of the postsynaptic membrane specialization of glutamatergic synapses further allows, upon labeling of ionotropic glutamate receptors, to quantify and analyze the intrasynaptic distribution of these receptors. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to prepare paired replicas and how to immunolabel them. We will also discuss the caveats and limitations of the FRIL technique, in particular those associated with potential sampling biases. The high reproducibility and versatility of the FRIL technique, when combined with optogenetics, offers a very powerful approach for the characterization of different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.
Here, we provide an example how this approach was used to gain insights into structure-function relationships of excitatory synapses at neurons of the intercalated cell masses of the mouse amygdala. In particular, we have investigated the expression of ionotropic glutamate receptors at identified inputs originated from the thalamic posterior intralaminar and medial geniculate nuclei. These synapses were shown to relay sensory information relevant for fear learning and to undergo plastic changes upon fear conditioning.

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Beyin Dilimlerinde ve Birincil Hücre Kültüründe Piramidal Nöronların Balistik Etiketlemesi

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...