Terapötiklerin ve taşıyıcılarının taşıma özelliklerinin karakterizasyonu etkili biyolojik yanıtları sağlamak için çok önemlidir. Bu yöntemler, negatif yüklü dokuları hedeflemek için en iyi şekilde şarj edilen uyuşturucu taşıyıcılarının tasarlanmasına yardımcı dır. Bu tekniklerin en büyük avantajı, doku yoluyla solute taşıma karakterize in vitro deneyler bir dizi in vivo terapötik etkinliğini daha iyi tahmin etmek için yeteneğidir.
Kıkırdak hastalıkları, osteoartrit gibi, yoğun avasküler kıkırdak matris nüfuz ilaçların yetersizliği nedeniyle tedavi edilmezse kalır, prolog terapötik etkinliği prolog ilaç taşıyıcıları gerektiren. Üç milimetre çapındaki, bir milimetre kalınlığındaki kıkırdak ekstranında fazla PBS'yi nazikçe çıkarmak için hassas bir görev silme kullanarak başlayın. Hızlı bir şekilde her explant ıslak ağırlığı kaydetmek için bir denge kullanın ve hemen dehidratasyon önlemek için bir PBS banyo içine explants yerleştirin.
Daha sonra, 96 kuyulu bir plakanın iç kuyularına her biri için 300 mikrolitre taze hazırlanmış, 30 mikromolar floresan olarak etiketlenmiş katyonik peptid taşıyıcı çözeltisi ekleyin ve çözeltinin her kuyuya bir ekstrüzyon eklemek için bir spatula kullanın. Çevredeki kuyuların her birini 300 mikrolitre PBS ile doldurun ve tabağı bir kapakla kapatın. Buharlaşmayı en aza indirmek için plakanın kenarlarını esnek bir filmle kapatın ve plakayı 15 milimetrelik bir yörüngeyle dakikada 50 devirde 24 saat boyunca 37 derece lik bir kuvözde çalkalayıcıya yerleştirin.
Kuluçka sonunda, her kuyudan ayrı polipropilen tüpler içine denge banyosu aktarın ve standart bir eğri oluşturmak için stok 30 mikromolar katyonik peptid taşıyıcı çözeltiseri seyreltme yapmak. Daha sonra, her çözeltinin 200 mikrolitresini ve standartını siyah 96 kuyulu bir plakanın ayrı kuyularına aktarın ve floresan etiketin uyarma ve emisyon dalga boylarına göre her numune nin ve standardın floresan okumalarını elde edin. Bir kıkırdak ekstrüzyon içinde katyonik peptit taşıyıcı penetrasyon derinliğini belirlemek için, altı milimetre çapında kesmek için bir neşter kullanın, yarım milimetre kalınlığında kıkırdak ekstrüzyon ve proteus inhibitörü takviyeli PBS ile ortaya çıkan yarım disk parçaları nemlendirmek.
Özel olarak tasarlanmış tek boyutlu bir taşıma odasının kuyunun ortasına epoksi uygulayın ve ekstronun yüzeysel tarafı odanın yukarı tarafına bakacak şekilde kuyu içinde bir yarım disk ekstronu emniyete alın. Kıkırdağın difüzyon yüzey alanı ile teması önlemek için kuyudan herhangi bir fazla tutkal çıkarın ve ekstrplant her iki tarafına proteaz inhibitörü takviyeli PBS 80 mikrolitre ekleyin. Pipet sıvı yukarı ve aşağı diğer tarafa sızıntı olup yok kontrol etmek için explant bir tarafında.
Sızıntı yoksa, proteaz inhibitörü takviyeli PBS'yi yukarı taraftan 30 mikromolar floresan etiketli katyonik peptit taşıyıcı çözeltisi ile değiştirin ve taşıma odasını dikkatlice hücre kültürü yemeğine yerleştirin. Katyonik peptit taşıyıcı çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için yemeğin tabanını PBS ile kapatın. Yukarı ve aşağı odalarından gelen çözümler arasında doğrudan temas olmamasına dikkat etmek.
15 milimetrelik bir yörünge ile oda sıcaklığında dört veya 24 saat ve dakikada 50 devir için parçacık sedimantasyon sınırlamak için bir shaker üzerinde kapalı çanak yerleştirin. Kuluçka sonunda, eksplantları hazneden çıkarın ve her ekstronun merkezinden yaklaşık 100 mikron kalınlığında dilimler kesin. Bir cam slayt ve bir kapak kayma arasında explant her dilim yerleştirin ve taze proteaz inhibitörü takviyeli PBS ile dilimleri nemlendirin.
Kaydırağı konfokal mikroskobun aşamasına sabitleyin ve dilimin tam kalınlığı boyunca 10X büyütme de bir Z-yığın floresan görüntü elde edin. Resim dosyasını ve resim J'yi açın, Resim'i tıklatın ve açılır menüden Yığınlar ve Z Projesi'ni seçin. Ardından, dilim numaralarını birden son dilime ve Projeksiyon Türü'nün altına girdikten sonra ortalama yoğunluğu seçin ve Tamam'ı tıklatın.
Non-denge katyonik peptid taşıyıcı kıkırdak difüzyon oranını değerlendirmek için, taşıma odasının her yarısını monte, bir büyük kauçuk conta dahil etmek, bir polimetilmetakrilat eklemek, ve küçük bir kauçuk conta. Bir kıkırdak ekstrüzyon kalınlığını ölçün, sonra yukarı oda bakan yüzeysel yüzey ve montaj tamamlamak için birlikte iki yarısı sandviç ile plastik eklemek kuyularında explant yerleştirin. Proteaz inhibitörü takviyeli iki mililitre ile upstream odası doldurmadan önce sıkıca birlikte yarım vida için bir anahtar kullanın.
Yukarı daki odadan sızıntı olup yok. Herhangi bir sızıntı tespit edilirse, proteaz inhibitörü takviyeli iki mililitre ile aşağı odası doldurun. Hem yukarı hem de aşağı odacıklara tek bir mini karıştırma çubuğu ekleyin ve odayı spektrofotometreden gelen lazer inakış odasının merkezine doğru odaklanmış olacak şekilde hizalanmış bir karıştırma plakası üzerine yerleştirin.
Spektrofotometrenin aşağı çekme odasının arkasındaki sinyal alıcısı kısmıyla, en az beş dakika boyunca kararlı, gerçek zamanlı aşağı floresan emisyon okumaları toplayın. Kararlı bir okuma elde ettikten sonra, üç mikromolar son banyo konsantrasyonuna upstream odasına floresan etiketli katyonik peptid taşıyıcı stok çözeltisi önceden hesaplanmış bir hacim ekleyin ve solute taşıma eğim sürekli bir artış ulaşmak için izin verirken aşağı floresan sinyali izlemek. Sabit bir duruma ulaşıldıktan sonra, 20 mikrolitre çözeltiyi akıntı odasından bir ani test için aşağı akış odasına aktarın ve gerçek zamanlı aşağı floresan okumalarını toplayın.
Çok yüksek bir pozitif yük, taşıyıcı kıkırdak matrisinin negatif yüklü agrega gruplarına çok güçlü bağlanan gibi yüzeysel bölgeye solute penetrasyon sınırlandıracaktır. Tersine, zayıf ve geri dönüşümlü yük etkileşimlerinden yararlanabilen taşıyıcılar derin doku bölgesine nüfuz eder. Ancak, en iyi şekilde şarj edilen bir ilaç taşıyıcısı sadece dokunun derin bölgelerine nüfuz etmekle kalmamış, aynı zamanda gösterildiği gibi denge banyosu ve doku ıslak ağırlığının floresan ölçümleri kullanılarak belirlenebilen yüksek bir doku içi alımını da gösterecektir.
Non-denge difüzyon taşıma deneyleri giderek artan eğim ile oluşturulan bir veri eğrisi neden. Eğrinin ilk bölümü, solute matris bağlama etkileşimleri oluşurgibi kıkırdak yoluyla solute difüzyon temsil eder. Solutes aşağı odasına ulaştığında, floresan okumaları zamanla arttıkça eğrinin eğimi artar.
Eğrinin bu ikinci bölümü daha sonra sabit bir eğime ulaşır ve sabit durum difüzyonu temsil emzilir. Eğrinin sabit durum kısmına çizilen teğet sel bir çizginin X-keseği, sabit durum difüzyonuna veya tau lag'ine ulaşmanın gereken zamanı gösterir. Akıntının yukarısından aşağı odaya çözelti transferinden sonra floresan da bir ani artış gözlenir ve bu noktada floresan yoğunluğu konsantrasyonu ilişkilendirmek için stabilize floresan yoğunluğu kullanılabilir.
Temsili etkili diffusivity ve istikrarlı durum difüzyon değerleri daha sonra, belirtildiği gibi hesaplanabilir. Sabit durum difüzörünün, tüm şarj tabanlı bağlama alanlarının işgal edilmesi sonucunda etkili diffusivity'den iki büyüklük sırası olduğunu unutmayın. Bu nedenle, bu noktada, difüzyon aynı boyutta KiK'ler arasında benzer sabit durum difüzyon değerleri ile sonuçlanan, yük değil boyuta dayanır.
Kıkırdak morfolojisi ve çözelti konsantrasyonundaki değişiklikleri önlemek ve doğru ve tekrarlanabilir veri toplamayı sağlamak için eksplant hidrasyonunu koruyun ve deney boyunca çözelti buharlaşmasını en aza indirin. En iyi ücret ilaç taşıyıcı tasarımı nı takiben, çeşitli konjugasyon teknikleri gelişmiş doku hedefleme için ilaç değiştirmek ve biyolojik etkinliğinin değerlendirilmesini kolaylaştırmak için kullanılabilir.
