Bu çalışma Carraresi Vakfı ve MiND FoodS Hub ID: 1176436 tarafından finanse edildi. Tüm yazarlar COST Action CA16119 In vitro 3-D toplam hücre rehberliği ve zindeliği (CellFit) üyesidir.

Tüm çalışmalar Milano Üniversitesi Etik Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Tüm hayvan deneyleri, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. İnsan hücrelerinin sağlıklı yetişkin bireylerden izole edilmesi, Milano'daki Ospedale Maggiore Policlinico Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Çalışmamızdaki tüm yöntemler onaylanmış kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Cilt fibroblast izolasyonu
NOT: Aşağıda açıklanan tüm prosedürler, fare, domuz ve insan dahil olmak üzere farklı memeli türlerinden izole edilen fibroblastlara uygulanabilir. Murin hücreleri 7 haftalık erkek farelerden izole edildi ve yerel mezbahada domuz derisi dokusu toplandı. İnsan hücreleri, yazılı bilgilendirilmiş onamdan sonra yetişkin hastalardan izole edildi.
<ol><li>% 0.1 domuz jelatin çözeltisi hazırlayın.<ol>
<li>0.1 g domuz jelatini tartın ve 100 mL suda çözün. Jelatin çözeltisini kullanmadan önce otoklavlama yaparak sterilize edin.</li>
		<li>Hazırlanan çözeltinin 1,5 mL'si ilave edilerek 35 mm Petri kabını %0,1 domuz jelatini ile kaplayın. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yaklaşık 2-5 cm uzunluğundaki memeli (fare, domuz ve insan) cilt biyopsilerini kesin ve% 2 antibiyotik antimikotik çözeltisi içeren Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Saline (PBS) yerleştirin. Kullanana kadar + 4 °C'de saklayın. NOT: Biyopsi koleksiyonları mutabakat dahilinde ve Etik Kurul onayından sonra, belirlenen kılavuzlara uygun olarak yapılmalıdır.</li>
	<li>Toplanan biyopsileri,% 2 antibiyotik antimikotik çözelti içeren taze steril PBS'de üç kez kapsamlı bir şekilde yıkayın.</li>
	<li>Son yıkamadan biyopsileri toplayın ve steril bir 100 mm Petri kabına yerleştirin. Onları yaklaşık 2mm3 boyutunda parçalara ayırmak için steril bir neşter kullanın.</li>
	<li>2 saatlik inkübasyonun sonunda, 35 mm Petri kabından (adım 1.1.2'de tanımlanmıştır) fazla jelatin çözeltisini çıkarın ve steril bir cerrahi cımbız kullanarak, önceden kaplanmış her kültür kabına derhal 5-6 cilt parçası yerleştirin.</li>
	<li>Her birinin üzerine 100 μL fibroblast izolasyon ortamı damlacıkları (Tablo 1) ekleyerek parçaları ıslatın. % 5 CO 2 inkübatöründe 37 °C'de kültür. NOT: Ortamın buharlaşmasını önlemek için, 35 mm'lik Petri kabını steril su içeren 100 mm veya daha büyük bir Petri kabı içine yerleştirin. Her iki Petri kabını da kapattığınızdan emin olun.</li>
	<li>24 saatlik kültürden sonra, 35 mm kültür Petri kabındaki ortamın miktarını kontrol edin. Gerekirse, parçaları ıslak tutmak için 500 μL fibroblast izolasyon ortamı ekleyin.</li>
	<li>Ortamı dikkatlice çıkarın ve pipet kullanarak en az 2 günde bir kültürde bir yenileyin.</li>
	<li>Fibroblastlar 35 mm'lik Petri kabına (adım 1.5'te tanımlanmıştır) yerleştirilen cilt parçalarından büyümeye başladığında ve bir hücre tek katmanı oluşturmaya başladığında (genellikle 6 gün). 2 mL fibroblast izolasyon ortamında steril bir cerrahi cımbız ve kültür kullanarak cilt parçalarını çıkarın.</li>
	<li>Hücre tek katmanını 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde% 80 birleşene kadar kültürlemeye devam edin ve her gün ortamı yenileyin.</li>
</ol>2. Fibroblast primer hücre hattı kültürü
<ol><li>Fibroblastlar% 80 birleşime ulaştığında, fibroblast izolasyon ortamını dikkatlice çıkarın ve% 1 antibiyotik antimikotik çözelti içeren 3 mL PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.</li>
	<li>Hücre ayrılması için, kültür kabına 600 μL% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 3-5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Hücreler kültür kabından ayrılmaya başladığında tripsini nötralize etmek için 5.4 mL fibroblast kültür ortamı ekleyin (Tablo 1).</li>
	<li>Tekrarlanan ve nazik pipetleme ile hücreleri yerinden çıkarın. Yeni kültür tabaklarındaki (jelatinsiz) tabak hücreleri, geçiş oranını 1: 2 ile 1: 4 arasında tutar (büyüme hızına bağlı olarak). NOT: Santrifüjleme gerekli değildir.</li>
	<li>Hücreleri kültürde tutun ve her 2 günde bir,% 80 akıcılığa ulaşana ve onları geçene kadar ortamı değiştirin. NOT: Güçlü büyümeyi sürdürmek için fibroblastları haftada iki kez yayın.</li>
</ol>3. 5-aza-CR'ye fibroblast maruziyeti
<ol><li>Taze 1 mM 5-aza-CR stok çözeltisi hazırlayın.<ol>
<li>2.44 mg 5-aza-CR ağırlığında ve 10 mL DMEM yüksek glikozda çözün. Vorteks yaparak tozu yeniden askıya alın. Çözeltiyi 0,22 μm filtre ile sterilize edin. NOT: 5-aza-CR stok çözeltisi kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.</li>
		<li>1 mL fibroblast kültür ortamında 1 μL 5-aza-CR stok çözeltisini (3.1.1.) seyrelterek 5-aza-CR çalışma çözeltisi hazırlayın. NOT: 5-aza-CR çalışma çözeltisinin konsantrasyonu 1 μM 1,2,3,8,9'dur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Daha önce tarif edildiği gibi hücreleri tripsinize edin (2.1.-2.3.) ve hücreleri tekrar tekrar ve nazikçe pipetleyerek yerinden çıkarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu toplayın ve konik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında optik mikroskop altında bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın. 1 μM 5-aza-CR ile desteklenmiş 30 μL fibroblast kültür ortamında 4 x 104 hücre elde etmek için hücreleri yeniden askıya almak için gereken ortamın hacmini hesaplayın (bkz. adım 3.1.2.). NOT: Kullanılacak formül, belirli oda tipine bağlıdır. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61655/61655equ01v3.jpg">
</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 150 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve peleti 1 μM 5-aza-CR ile desteklenmiş fibroblast kültür ortamı ile yeniden askıya alın (bkz. adım 3.1.2.). Kullanılacak fibroblast kültür ortamının hacmi için bkz. adım 3.4. NOT: Negatif bir kontrol olarak, 5-aza-CR olmadan fibroblast kültür ortamında aynı konsantrasyondaki hücreleri askıya alın ve PTFE tozunda hücre kapsüllemesi ile devam edin (adım 4.1.-4.13.).</li>
</ol>4. PTFE mikrobiyoreaktörlerde fibroblast kapsüllemesi
<ol><li>Bir yatak üretmek için 35 mm'lik bir Petri kabını politetrafloroetilen (PTFE) tozu ile doldurun (Şekil 1A). NOT: Sıvı mermerin yapışmasını önlemek için 35 mm bakteriyoloji Petri tabakları kullanın. İnce bir hidrofobik ve gözenekli kabuk elde etmek için, ortalama parçacık boyutu 1 μm olan ve maksimum 2.0 NPIRI öğütme ile üretilen bir PTFE tozu kullanın. Bu, gaz geçirgen sıvı mermerlerin oluşturulmasına izin verir. Ayrıca, yarı saydam kaplama, hücre toplama işlemlerinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesini kolaylaştırır Daha büyük parçacık boyutu, yüksek buharlaşmaya, küresel şeklin deformitesine ve kaybına ve mikro-biyoreaktörlerin erken çözünmesine neden olabilecek yüksek polidispersiteye yol açar.</li>
	<li>4 x 104 hücre içeren 30 μL tek damlacığı (bkz. adım 3.4.- 3.5.) toz yatağına dağıtın (Şekil 1B).</li>
	<li>PFTE tozunun sıvı mermer mikro-biyoreaktör oluşturmak üzere sıvı damlasının yüzeyini tamamen kapladığından emin olmak için 35 mm'lik Petri kabını dairesel bir hareketle yavaşça döndürün (Şekil 1C).</li>
	<li>Mermerin çapını yerleştirmek için kenardan kesilmiş 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak sıvı mermer mikro-biyoreaktörünü alın (Şekil 1D,E). Stabilize etmek için sıvı mermer mikro-biyoreaktörü temiz bir bakteriyoloji Petri kabına yerleştirin (Şekil 1F). NOT: Ucun içindeki mermeri kavramak üzere bir sürtünme oluşturmak için, pipet uçlarını sıvı mermer çapından yaklaşık biraz daha az bir çapla kesin.</li>
	<li>Sıvı mermer mikro-biyoreaktörünü Petri kabından 96 kuyucuklu bir plakaya (bir mermer / kuyu) aktarın (Şekil 1G).</li>
	<li>Kuyunun kenarından yavaşça 100 μL ortam ekleyin. Mikro-biyoreaktör ortamın üzerinde yüzmeye başlar (Şekil 1H). NOT: Mikro-biyoreaktör, PTFE hidrofobikliğinin bozulması nedeniyle doğrudan sıvı temasında kırılır. Alternatif bir yaklaşım olarak, sıvı mermer mikro-biyoreaktörleri ayrı ayrı 35 mm'lik bir bakteriyoloji kültür kabına yerleştirilebilir. Bu durumda, sıvı mermerin buharlaşmasını önlemek için, mikro-biyoreaktörü içeren 35 mm'lik Petri kabı, daha önce steril su ile aliquoted edilmiş 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirilmelidir.</li>
	<li>Sıvı mermer mikro-biyoreaktörünü 37 °C'de 18 saat boyunca %5 CO 2 inkübatör 1,2,3,8,9'da inkübe edin. NOT: 1 μm'lik PTFE partikül boyutu, iç sıvı ile çevredeki ortam arasında optimum gaz alışverişi sağlayabilir.</li>
	<li>18 saat boyunca 5-aza-CR inkübasyonundan sonra, kenarda kesilmiş 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak sıvı mermer mikro-biyoreaktörü toplayın (bkz. adım 4.5).</li>
	<li>Mikro-biyoreaktörü yeni bir 35 mm bakteriyoloji Petri kabına yerleştirin (Şekil 1D-F).</li>
	<li>Sıvı mermeri delmek ve kırmak için bir iğne kullanın.</li>
	<li>Oluşan sferoidleri 200 μL pipet ucuyla, kenardan kesilmiş, stereomikroskop altında geri kazanın (Şekil 1I,J). NOT: PTFE'de kapsüllenmiş epigenetik olarak silinmiş hücreler 3D küresel bir yapı oluşturur (her sıvı mermerde bir agrega).</li>
	<li>5-aza-CR'ye yanıt olarak pluripotent durumun kazanımını değerlendirmek için, pluripotens ile ilişkili gen ekspresyonunun, OCT4, NANOG, REX1 ve SOX2'nin başlangıcını kalitatif PCR ile kontrol edin (Tablo 2).</li>
	<li>Aşağıda açıklandığı gibi protokolün ikinci adımına geçin.</li>
</ol>5. Epigenetik olarak silinmiş hücrelerin PTFE mikro-biyoreaktörlerinde kültür
<ol><li>Taze ESC kültür ortamı hazırlayın (Tablo 1).</li>
	<li>Organoidleri, 5-aza-CR artıklarını yıkamak için ESC ortamı içeren bir Petri kabına aktarın (bkz. adım 5.1.-5.2.).</li>
	<li>PTFE toz yatağı içeren yeni bir 35 mm bakteriyoloji Petri kabı hazırlayın (ayrıca bkz. adım 4.1.).</li>
	<li>30 μL ESC kültür ortamındaki bir damlacıkta, kenardan kesilmiş 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak toz yatağına tek bir organoid dağıtın (bkz. adım 4.9.; 5.3.).</li>
	<li>Yeni bir sıvı mermer mikrobiyoreaktör oluşturmak için 35 mm'lik Petri kabını dairesel bir hareketle yavaşça döndürün, 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak alın, kenardan kesin ve yeni oluşturulan mikro-biyoreaktörü 96 delikli bir plaka kuyusuna (bir mermer/kuyu) yerleştirin (bkz. adım 4.3.-4.6).</li>
	<li>Mikro-biyoreaktörleri yüzdürmek için, mermeri yavaşça yıkamak için kuyunun kenarından 100 μL ortam ekleyin (bkz. not 4.7.).</li>
	<li>Kültür sıvı mermer mikro-biyoreaktörleri 37 °C'de %5 CO2 inkübatörde gerektiği kadar bekletilir. 5.3.-5.7'de açıklanan prosedürü izleyerek ortamı her gün değiştirin. NOT: Bu yazıda 28 gün boyunca organoid kültürü ile elde edilen sonuçlar sunulmuştur. Ancak ihtiyaç duyulması halinde daha uzun kültür süresi yapılabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells.">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+pig+dermal+fibroblast+into+insulin+secreting+cells+by+a+brief+exposure+to+5-aza-cytidine.">Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).</li><li>Brevini, T. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+molecular+changes+of+human+granulosa+cells+exposed+to+5-azacytidine+and+addressed+toward+muscular+differentiation.">Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).</li><li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells.">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).</li><li>Tan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+tissue+engineering+and+regeneration+through+epigenetic+reprogramming+and+scaffold+manipulation.">Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation.</a> Scientific Reports. 5, 16333 (2015).</li><li>Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+conversion+of+adult+dog+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells.">Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).</li><li>Chandrakanthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-AB+and+5-Azacytidine+induce+conversion+of+somatic+cells+into+tissue-regenerative+multipotent+stem+cells.">PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).</li><li>Manzoni, E. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-azacytidine+affects+TET2+and+histone+transcription+and+reshapes+morphology+of+human+skin+fibroblasts.">5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts.</a> Scientific Reports. 6, 37017 (2016).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+erasing+and+pancreatic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+into+insulin-producing+cells+are+boosted+by+the+use+of+low-stiffness+substrate.">Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate.</a> Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+PTFE+micro-bioreactor+to+promote+3D+cell+rearrangement+and+maintain+high+plasticity+in+epigenetically+erased+fibroblasts.">Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).</li><li>Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+striated+muscle+cells+from+non-myoblast+precursors+following+5-azacytidine+treatment.">Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment.</a> Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).</li><li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1/2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine.">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li><li>Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Azacytidine,+DNA+methylation,+and+differentiation.">5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).</li><li>Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5-azacytidine+and+its+2'-deoxyderivative+on+cell+differentiation+and+DNA+methylation.">Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).</li><li>Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+inhibitor+5-Aza-2'-deoxycytidine+induces+reversible+genome-wide+DNA+damage+that+is+distinctly+influenced+by+DNA+methyltransferases+1+and+3B.">DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).</li><li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+direct+stem+cell+behaviour+in+development+and+regeneration.">Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).</li><li>Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+influences+of+mechanical+forces+on+cell+competition.">Multiple influences of mechanical forces on cell competition.</a> Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).</li><li>Yim, E. K., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+cell+signaling+in+stem+cell+differentiation.">Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 3 (5), 41 (2012).</li><li>Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+extracellular+forces+that+determine+cell+fate+and+maintenance.">Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance.</a> Development. 144 (23), 4261-4270 (2017).</li><li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+architecture:+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function.">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).</li><li>Streuli, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+mediates+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelia.">Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia.</a> The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).</li><li>Christman, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Azacytidine+and+5-aza-2[prime]-deoxycytidine+as+inhibitors+of+DNA+methylation:+mechanistic+studies+and+their+implications+for+cancer+therapy.">5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy.</a> Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).</li><li>Stresemann, C., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+action+of+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+azacytidine+and+decitabine.">Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine.</a> International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).</li><li>Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+in+vitro+maturation+of+sheep+oocytes+in+a+liquid+marble+microbioreactor.">A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).</li><li>Vadivelu, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+multiple+spheroid+model+of+olfactory+ensheathing+cells+using+floating+liquid+marbles.">Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles.</a> Scientific Reports. 5, 15083 (2015).</li><li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Marble+as+bioreactor+for+engineering+three-dimensional+toroid+tissues.">Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).</li><li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Marbles+as+bioreactors+for+the+study+of+three-dimensional+cell+interactions.">Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions.</a> Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).</li><li>Varelas, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAZ+controls+Smad+nucleocytoplasmic+shuttling+and+regulates+human+embryonic+stem-cell+self-renewal.">TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).</li><li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem/Progenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP/TAZ.">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li><li>Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+signaling-directed+YAP/TAZ+regulation+encourages+3D+spheroid+colony+formation+and+boosts+plasticity+of+parthenogenetic+stem+cells.">Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Son yıllarda, birkaç çalışma, ölümcül olarak farklılaşmış bir hücreyi daha az kararlı ve daha yüksek izin veren bir duruma geri döndürmek için stratejilerin geliştirilmesine odaklanmıştır. Burada açıklanan protokol, yetişkin olgun terminal olarak farklılaşmış hücrelerden başlayarak pluripotent hücrelerin üretilmesine ve uzun süreli bakımına izin verir. Yöntem, kimyasal epigenetik silme yoluyla elde edilen yüksek izin verilen bir durumun indüklenmesini ve ardından bir 3D kültür si...

Son on yıllarda, hücre bağlılığı ve farklılaşmasına doğru tek yönlü ilerleme kavramı tamamen gözden geçirildi. Hücre spesifikasyonunun tersine çevrilebileceği ve ölümcül olarak farklılaşmış bir hücrenin, farklı yöntemler kullanılarak daha az kararlı ve daha yüksek izin verilen bir duruma itilebileceği gösterilmiştir.
Önerilen çeşitli yöntemler arasında, en umut verici yöntemlerden biri, hücreleri kimyasal olarak indüklenen pluripotens olarak adlandırılan bir şeye indüklemek için kimyasal bileşiklerin kullanılmasını içerir. Bu yaklaşımda kullanılan küçük moleküller, yetişkin bir olgun hücrenin epigenetik imzasını etkileşime sokabilir ve değiştirebilir, herhangi bir transgenik ve / veya viral vektöre ihtiyaç duymaz, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Son zamanlarda yapılan çok sayıda çalışma, hipermetillenmiş genlerin11,12,13,14,15 reaktivasyonunu indükleyen spesifik biyokimyasal ve biyolojik uyaranlar sağlayarak hücreleri bir fenotipten diğerine geçirmenin mümkün olduğunu göstermiştir. Bu demetilasyon olayları, ölümcül olarak farklılaşmış hücrelerin ilkel bir progenitöre, multipotent veya yüksek plastisiteye / pluripotent bir hücreye dönüştürülmesine izin verir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Buna paralel olarak, birçok çalışma son zamanlarda mekanosensing ile ilgili ipuçlarının anlaşılmasına ve daha spesifik olarak, hücre plastisitesini ve / veya farklılaşmasını doğrudan etkilemek için mekanik kuvvetlerin kullanılması olasılığına odaklanmaktadır16,17,18,19. Gerçekten de, hücre dışı matrisin (ECM) hücre kaderinin kontrolünde önemli bir rol oynadığı açıkça gösterilmiştir. Özellikle, ECM tarafından üretilen biyomekanik ve biyofiziksel sinyaller, moleküler mekanizmaları ve sinyal yollarını doğrudan düzenleyerek hücre davranışını ve işlevlerini etkiler20,21. Bu son veriler, in vivo hücre mikro ortamını daha yakından taklit eden, hücre davranışını yönlendiren mekanik ve fiziksel uyaranları kopyalayan yeni 3D kültür sistemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır.
Burada, memeli pluripotent hücreleri üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren iki aşamalı bir protokolü açıklıyoruz. İlk adımda, hücreler demetilasyon molekülü 5-aza-sitidin (5-aza-CR) ile inkübe edilir. Bu ajan, doğrudan on-onbir translokasyon 2 (TET2) aracılı etki8,10 ve DNA metiltransferazların (DNMT) 22,23'ün dolaylı inhibisyonunun birleşik bir etkisi ile önemli bir küresel DNA demetilasyonunu indükleyebilir. Bu adım, pluripotens ile ilişkili gen ekspresyonunun daha sonra yeniden aktivasyonu ile epigenetik blokların uzaklaştırılmasını ve dolayısıyla bundan böyle "epigenetik olarak silinmiş hücreler" olarak adlandırılacak olan yüksek plastisiteli hücrelerin 1,2,3,8,10 üretilmesini indükler. İkinci adımda, hücreler bir 3B kültür sisteminde kapsüllenir. Bu amaçla, reaktif olmayan hidrofobik sentetik bileşik politetrafloroetilen (PTFE; 1 μm parçacık boyutuna sahip), geleneksel 2D kültür sistemlerinin kullanımıyla elde edilemeyen hücresel bir mikro ortamın oluşturulmasına izin veren mikro-biyoreaktör olarak kullanılır10. PTFE toz parçacıkları, hücrelerin yeniden askıya alındığı sıvı damlasının yüzeyine yapışır ve sıvı çekirdeği destek yüzeyinden izole ederken, iç sıvı ile çevredeki ortam arasında gaz değişimine izin verir24. Bu şekilde elde edilen ve "Sıvı Mermer" olarak da bilinen "PTFE mikro-biyoreaktör", hücreleri birbirleriyle serbestçe etkileşime girmeye teşvik eder, 3D hücre yeniden düzenlenmesini teşvik eder25,26,27 ve biyo-mekanosensing ile ilgili ipuçları10 olsa da, elde edilen yüksek plastisite durumunu genişletir ve istikrarlı bir şekilde korur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Azacytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2385</td>
			<td>5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4036</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Real-Time PCR</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4654</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41966052</td>
			<td>For fibroblast isolation and culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31885023</td>
			<td>For ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61021</td>
			<td>mRNA estraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td>For dish coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneAmp PCR System 2700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Global DNA Methylation ELISA Kit</td>
			<td>CELL BIOLABS</td>
			<td>STA-380</td>
			<td>Methylation study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7801</td>
			<td>Qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6264</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31550031</td>
			<td>For ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOVA glasstic slide 10 with grids</td>
			<td>Hycor Biomedical</td>
			<td>87144</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ APO Stereo Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>For organoid observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS 0.22 &#181;m pore filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>For solution sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3681</td>
			<td>mRNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51119000</td>
			<td>For ELISA plate reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>For cell observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Thermal Cycler 480</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(tetrafluoroethylene) 1 &#956;m particle size</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>430935</td>
			<td>For generating micro-bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>Genomic DNA estraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1728</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833902</td>
			<td>For fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td>For Fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900500</td>
			<td>Bacteriology petri dish for liquid marble culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924005</td>
			<td>For liquid marble culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td>For fibroblast dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15ml, 120x17mm, PS</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62553041</td>
			<td>For cell suspension centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a two-step strategy that combines epigenetic modification and biomechanical cues to generate mammalian pluripotent cells

Hücre fenotipi, her tekniğe özgü avantajlar ve sınırlamalar ile farklı yöntemlerle tersine çevrilebilir veya değiştirilebilir. Burada, memeli pluripotent hücreleri üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren yeni bir strateji açıklıyoruz. İki ana adım gereklidir. İlk adımda, yetişkin olgun (ölümcül olarak farklılaşmış) hücreler, onları pluripotent bir duruma sokmak için epigenetik silgi 5-aza-sitidine maruz bırakılır. Protokolün bu kısmı, hücre kaderini ve farklılaşmasını kontrol eden epigenetik mekanizmaların artan anlayışına dayanarak geliştirilmiştir ve hücre farklılaşmış durumunu silmek ve daha sonra geçici bir yüksek plastisite penceresine sürmek için epigenetik değiştiricinin kullanılmasını içerir.
İkinci adımda, silinen hücreler, elde edilen yüksek plastisiteyi genişletmek ve istikrarlı bir şekilde korumak için 3D hücre yeniden düzenlemesini teşvik etmek için Sıvı Mermerler olarak da bilinen politetrafloroetilen (PTFE) mikro-biyoreaktörlerde kapsüllenir. PTFE, reaktif olmayan hidrofobik sentetik bir bileşiktir ve kullanımı, geleneksel 2D kültür sistemlerinde elde edilemeyen hücresel bir mikro çevrenin oluşturulmasına izin verir. Bu sistem, biyo-mekanosensing ile ilgili ipuçları olsa da, pluripotensinin korunmasını teşvik eder ve artırır.
Burada açıklanan teknik prosedürler, yetişkin somatik hücrelerde yüksek plastisite durumunun indüksiyonuna ve korunmasına izin veren basit stratejilerdir. Protokol, test edilen tüm memeli türlerinde yüksek plastisiteli hücrelerin türetilmesine izin verdi. Gen transfeksiyonu kullanımını içermediğinden ve viral vektörlerden arındırılmış olduğundan, translasyonel tıp uygulamaları için dikkate değer bir teknolojik ilerlemeyi temsil edebilir. Ayrıca, mikro-biyoreaktör sistemi, in vitro olarak yüksek plastisiteli hücrelerin, yani ESC'ler, iPSC'ler, epigenetik olarak silinmiş hücreler ve MSC'ler gibi uzun vadeli kültürüne izin veren belirli bir mikro ortamı yeniden yaratarak kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerleme sağlar.

Mevcut protokol, yetişkin somatik hücrelerden memeli pluripotent hücreleri üretmek ve istikrarlı bir şekilde korumak için gerçekleştirilecek tüm adımları açıklamaktadır. Bu yöntem, fare, domuz ve insan olmak üzere farklı memeli türlerinden izole edilen fibroblastlarla başarılı olmuştur. Burada bildirilen temsili sonuçlar, menşe türlerinin sırasıyla tüm hücre hatlarından elde edilir.
Morfolojik analizler, demetilasyon ajanı 5-aza-CR ile 18 saatlik inkübasyondan ...

Watch this Scientific Journal Video about A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells at JoVE.com

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

a-two-step-strategy-that-combines-epigenetic-modification

Research

JoVE Journal

Biology

2.2K Görüntüleme.  Università degli Studi di Milano. Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Video: A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Biyoloji

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

ChIP-seq Denemeleri otomatikleştirme 10.000 HeLa Hücreleri üzerinde epigenetik Profilleri oluşturmak için

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...