Bu çalışma XAC ve AFP Ulusal Bilim ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi bağışları ile desteklenmiştir

1. Ekstraksiyon için Materyallerinin Hazırlanması <ol><li> Hücre Hazırlanması <ol><li> Deney öncesinde en az bir gün için asit ile tedavi edilen lameller üzerine Tohum doku kültürü hücreleri. Bu iki hücre hatları salgılanan protein güçlü üretim sergilemek ve iyi tanımlanmış bir ER sahip olarak biz, COS-7 veya U2OS kullanın. Yüksek ekstraksiyon verimi elde etmek için, hücrelerin deney gününde lamel confluency% 80 geçmemesi gerektiğini unutmayın. </li><li> Belirli bir eksojen mRNA araştırılmaktadır, hücreler transfeksiyon standart protokoller kullanılarak ilgilenilen geni ihtiva eden plasmidler ile tohumlama bir gün sonra, transfekte edilir. Hücreler daha sonra ekstre etmeden önce en azından 18 saat için mRNA ifade etmek için izin vardır. </li></ol></li><li> Çeviri İnhibitörleri ile Hücreleri Tedavisi <ol><li> ER ile mRNA&#39;ların dernek bakım sağlam ribozomların etkisini test etmek için, hücrelerin dernek bozabilir çeviri inhibitörleri ile tedavi edilebilirmRNA 11 ribozomların. </li><li> (4-metil-2 ,6-dinitroanilino -) - bu tür homoharringtonin (HHT), pactamycin ya da 2 gibi bir çeviri başlatma inhibitörü, aynı anda için meşgul ribozom izin verirken, N-methylpropionamide (mdmp), transkript ile ilişkilendirilmesi yeni ribozom önlemek Çeviri 12-14 tamamlayın. Memeli hücrelerinde en proteinler için çeviri oranı ne olursa olsun, kodon kullanım veya mRNA uzunluğu 15, ikinci başına 5 amino asit olduğu için, 30 dakikalık bir muamele 27,000 nükleotidler (proteinler için kodlama yapan sürece açık okuma çerçeveleri ile mesajların ribozom kapalı temizlemek gerekir ) 9,000 amino asitler sürece. </li><li> Böyle puromisin gibi İnhibitörleri doğmakta zincirin erken ejeksiyon teşvik etmek ve böylece polysomes 12 bozabilir. Ancak tamamen mRNA ile puromisin-tedavi ribozomların dernek bozmaya, EDTA gibi magnezyum şelatörlerin digitonin ekstraksiyon tamponu 11 eklenmelidir. </li> &lt;li&gt; Bu deneyde, hücreler 200 uM puromisin, 5 uM HHT, veya ekstraksiyon önce 30 dakika için kontrol aracı ile tedavi edilir. </li></ol></li><li> Digitonin Ekstraksiyon Tampon hazırlanması. Ücretsiz (yani sitoplazmik, non-ER-ilişkili) transkript engel olmadan ER-yerelleştirilmiş mRNA&#39;ların görselleştirmek için, biz seçici digitonin, 3β-hydroxysterols ile tercihen etkileşime bir steroid glikozit ile hücre geçirgenliği. Düşük konsantrasyonlarda, digitonin seçici &#39;leakiness&#39; 16 sebep plazma zar bölümleri permeabilizes. Aksine, kolesterol yoksul ER zarı ve çekirdek zarı, 16,17 değişmeden kalır. <ol><li> Digitonin (Sigma Aldrich) tozu% 5 ağırlık / hacim deiyonize su içinde çözülür ve bu stok çözelti küçük miktarlar halinde bölünüp edilir ve -20 ° C&#39;de saklanır Bizim tecrübelerimize göre, birden fazla donma-çözülme döngüleri çözünmüş digitonin verimini azaltır. </li><li> Bir stok solüsyonuCHO 10x tampon (1x çalışma çözeltisi konsantrasyon: 115 mM Kac, 25 mM HEPES pH 7.4, 2.5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 150 mM sakaroz), RNase içermeyen reaktiflerle hazırlanır ve -20 ° C&#39;de depolanır Bir çalışma çözeltisi (1 x tampon CHO) RNase içermeyen su ile stok çözelti seyreltilmesi ile hazırlanır ve 4 ° C&#39;de saklanır </li></ol></li></ol> 2. Digitonin Ekstraksiyon <ol><li> Ekstraksiyon Çözümleri hazırlanması <ol><li> Düz bir yüzeye sahip ısıtma bloğu ısıtılır ila 40 ° C ile ekstraksiyon sırasında bu sıcaklıkta tutulur. </li><li> RNase içermeyen bir çalışma düz bir yüzey oluşturmak için, ısıtma bloğu Parafilm M (Bemis Company, Inc) taze bir parça ile bir miktar su ve üste konan ile nemlendirilir. Parafilm levha ve ısıtma bloğu arasındaki hava kabarcıkları RNaz içermeyen eldiven ve Kimwipes (VWR) kullanılarak düzgünleştirilir. </li><li> 1x CHO tampon, bir su banyosu içinde inkübe edilerek 37 ° C&#39;ye kadar ısıtılır. </li><li> 6 oyuklu plakalar yıkamak için kullanılırve hücreler sabitleyin. 3 kuyuda her satırı bir kapak kayma için kullanılır. Satırdaki birinci iki kuyu için ısıtılmış CHO tampon, 2 ml ilave edilir. Son olarak da için, tespit çözelti 2 ml (PBS +% 4 paraformaldehit (Elektron Mikroskop Bilimleri)) ilave edilir. Hücreleri çıkarılması için hazır olana kadar Bu kaset 37 ° C inkübatör saklanabilir. </li><li> Digitonin ekstraksiyon çözeltisi hemen önce kullanmak için sıcak CHO tamponu ile% 0.025 için stok digitonin çözüm seyreltilmesi ile hazırlanır. Yine puromisin işlenmiş hücreleri için, ekstraksiyon tamponu ilave verimli ribozomların 11 bozmaya 20 mM EDTA içermelidir unutmayın. Ekstraksiyon çözeltisinden 100 ul damlaları çıkarma hemen önce, parafilm kaplı bir ısıtma bloğu üzerine yerleştirilir. </li></ol></li><li> Digitonin Ekstraksiyon ve Hücre Fiksasyon <ol><li> 37 ° C inkübatör gelen hücreleri çıkarın. </li><li> Ayıklama işlemi sırasında, lamelleri Jewler forsepsi yardımı ile işlenir. Ileforseps lamel pick up ve büyüme orta yıkamak için de içeren ikinci sonra birinci ve CHO tampon içine batırın. </li><li> Hızla bir Kimwipe ile lamel arka tarafı kapalı aşan tampon kapalı kurulayın ve hemen ekstraksiyon çözeltisi üzerine, aşağı bakacak lamel, hücre yan yerleştirin. </li><li> 10 saniye sonra, forseps ile lamel pick up ve hemen hücre yan sıra içeren% 4 paraformaldehid sabitleme tampon, yukarı bakacak, aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında, en az 15 dakika için sabitleştirici içinde örnek inkübe izin verin. </li></ol></li><li> Unextracted Kontrol Hücrelerinin hazırlanması. Bir unextracted kontrol numunesinin hazırlanması için iyi bir fikirdir, sitoplazma içinde mRNA toplam miktarını belirlemek için. <ol><li> Lamelleri üzerinde yetiştirilen hücreler digitonin ayıklama adım (2.2.3) atlanır olması dışında, (bakınız Bölüm 2.2) yukarıdaki gibi hazırlanır. </li><li> Tespit edildikten sonra, un-Ayıklanan hücreler PBS permeabilize gerekir +% 0.1 TritonX-100 oda sıcaklığında 15 dak. </li></ol></li></ol> 3. BALIK Boyama <ol><li> Floresan in situ hibridizasyon probları için tasarlama <ol><li> Ilgili bir mRNA sekansı bu gibi birincil RNAstructure 5.0 18 olarak RNA ikincil yapı tahmini yazılımı kullanılarak katlanır. MRNA kıvrımlar görsel önemli ikincil yapıların serbest yaklaşık 50 nükleotid belirlemek için değerlendirilir. </li><li> Bu bölgenin ters tamamlayıcı prob 5 &#39;ucu (Integrated DNA Technologies firmasından satın alınmıştır) bağlanmış bir Alexa546 florofor ile sentezlenir. </li><li> Prob -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir 100 uM&#39;lik bir stok konsantrasyonu RNase içermeyen su ile seyreltilir </li></ol></li><li> FISH probları ile Boyama <ol><li> Digitonin-Çıkartılan hücrelerinin daha fazla geçirgenliği gerektirmez, ancak,% 0.1 2 ml ile bu sabit örnekleri tedavi Not Triton X-100 ile seyreltilirPBS FISH boyamadan önce oda sıcaklığında 15 dakika için, bir arka plan sinyali azaltmaya yardımcı olur. </li><li> Slaytlar sonra herhangi bir kalıntı paraformaldehit veya Triton X-100 uzaklaştırmak için PBS ile iki kez yıkanır. </li><li> Hücreler daha sonra 1X sodyum sitrat tampon (150 mM NaCl ve 15 mM sodyum sitrat) içinde% 25 ile% 60 formamid ile iki kere yıkanır. Genel olarak, uzunluğu 50-60 nükleotid olan belirli FISH probları için,% 60 formamid kullanılır, ancak oligo (dT) FISH sonda ile poli (A) mRNA boyama için, formamid seviyesini% 25 düşürülür. </li><li> Boyanma oda hazırlamak için, 150 mm&#39;lik bir Petri kabı alt su ile kaplıdır ve parafilm bir parça su üzerinde yüzen edilir. Böylece su parafilm tabağın tabanına bağlı sağlayan, çanak fazla döndürerek çıkarılır. Hava kabarcıkları elle Kimwipes ile kaldırılır. </li><li> Her bir lamel lekeli edilebilmesi için, eşit üzerine çıkar FISH prob ihtiva eden bir çözelti hibridizasyon 100 ul damla pipetleboyama odasında afilm. Stok FISH probunun bir çalışma konsantrasyonu için hibridizasyon tamponu içinde% 25 ile% 60 formamid (1 x SSC, 100 mg / ml dekstran sülfat, 1 mg / ml maya tRNA, 5 mM vanadil ribozit kompleks,% 25-60 formamid) ile seyreltilir 0.2 uM. Formamid miktarı, kullanılan özel sonda için optimize edilmiş ve SSC yıkama tamponu içinde olduğu gibi aynı konsantrasyonda (adım 3.3.3 bakınız) mevcut olması gerektiğine dikkat edin. </li><li> Lamel bu gibi doku kültürü kuluçka makinesi gibi bir nemlendirilmiş bir oda içinde 37 ° C sıcaklıkta boyama oda içinde FISH çözelti üzerine hücre yan yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirilir ve 5-24 saat için kuluçkalanır. </li></ol></li><li> Lekeli örnekleri Çamaşır ve montaj <ol><li> Bir RNaz ücretsiz yıkama alanı hazırlamak için, böyle bir laboratuar tezgah olarak düz bir yüzey üzerine parafilm bir şerit, uzandı. Parafilm yüzeye ıslak, düz olduğundan emin olmak için, üstüne parafilm yerleştirin ve elle Kimwipes ile herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> Boyama odasıdırinkübatör çıkarıldı ve bir düz yüzey üzerine yerleştirilir. Lamelleri sonra her lamel kenarında FISH yıkama tamponu yaklaşık 500 ul pipetleme tarafından süzülüyor edilir. Çözüm kılcal hareket yoluyla lamel ve parafilm arasındaki çekilecektir. </li><li> Her bir lamel için, yıkama tamponu 1 ml (1 x SCC% 25-60 formamid, 3.3.3 adım bakınız) yıkama alan parafilm (adım 3.4.1) üzerine pipetle konulur. </li><li> Forseps kullanılarak, lamelleri boyama oda çıkarılır ve her bir yıkama tamponu damla üzerine yerleştirildi ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. Yıkama işlemi 3 kez tekrarlanır. </li><li> Cam slaytlar% 70 etanol ile yıkandı ve Kimwipes ile kurutulur. </li><li> Her lamel için, montaj çözümü (DAPI Fluoromount G, Güney Biotech) 25 ul slayt üzerine pipetle konulur. Bu çözüm 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), lekeleri DNA içerir ve çekirdeklerin görselleştirme sağlar unutmayın. </li><li> USIng forseps ile Kimwipes, lamel arka kurutulur ve aşırı FISH yıkama tamponu örnek kurutma olmadan kapalı bulanıklaşmıştır. Her lamel sonra montaj solüsyonu damla üzerine, aşağı bakacak hücre yan yerleştirilir. </li><li> Atlı sonra numuneler etiketlenir ve 4 mağaza olabilir ° C </li></ol></li></ol> 4. Görüntüleme ve Ölçülmesi <ol><li> Görüntüleme <ol><li> Bir Epifloresans mikroskop görüntüsü FISH boyama sonrasında hücreler için kullanılır. Transfekte hücre uygun kanal parlak floresan sinyal tarafından untransfected hücreleri ayırt edilebilirler. İdeal olarak, her bir alınan alanın aynı zamanda ölçümü için arka plan floresan belirlemek için kullanılmak üzere bir untransfected hücre içerir. </li><li> Için FISH ve DAPI kanalın her alanın görüntüleri elde edilir. Hücreler protein işaretleri ile birlikte-lekeli Ek olarak, eğer, immünofloresans kanalın bir görüntü de elde edilir. Digitonin çıkarma de kullanılabilir dikkat edinizER-bağlı ribozomlar ve protein 11 görselleştirmek için. </li><li> Alanlar arasındaki floresans yoğunlukları karşılaştırıldığında olabilir emin olmak için, her bir kanal için maruz kalma süresi deney her set için sabit kalmalıdır. </li><li> Yine farklı lamelleri üzerine hücreleri arasındaki floresan yoğunlukları mukayese edilebilir olmasını sağlamak için, FISH sinyal epiluminescence yoğunluğu veya çürüme gün-gün değişiklikleri görüntüleme tek bir oturuşta lamelleri her minimize edilmelidir. </li></ol></li><li> Niceleme. ER yerelleştirilmiş mRNA miktarını ölçmek için, Nikon NIS Eleman yazılımı kullanın. Bununla birlikte bu tür ImageJ gibi diğer görüntü analiz programı kullanılır. <ol><li> Nikon NIS ELEMANI görüntü analizi aracını kullanarak, hücre çevre ve çekirdek İlgi (ROI) ayrı Bölgesi olarak özetlenmiştir. </li><li> Her bir ROI, floresan yoğunluğu (I T total hücre yoğunluğu ve ben için N içinNükleer yoğunluk) ve alan (A T ve A N) kaydedildi ve bir excel elektronik tablo ihraç edilmektedir. </li><li> Her bir görüntü için, arka plan floresan yoğunluğunu (I B) olmayan bir transfekte edilmiş bir hücre yoğunluğu kayda tarafından belirlenir. Poli (A) mRNA düzeyleri analiz ediliyor ise, bir hücre serbest bölge seçilir. </li><li> ER toplam miktarı (ekstre hücreleri) ve sitoplazmik (unextracted hücreleri) floresan formül ile hesaplanır: [A T] [I T - I B] - [A N] [I N - I B] </li><li> Nükleer boyanma yoğunluğu de hesaplanır ve çeşitli tedaviler arasında iç kontrol olarak da kullanılabilir. Çekirdekler digitonin tedavi 17 veya ribozom bozulması 11 etkilenmez yana, nükleer mRNA miktarı bu tedavilerin her biri arasında sabit kalmalıdır. Aşağıdaki formül kullanılır nükleer floresans hesaplamak için: [A N] [I N - IB] </li><li> ER-hedefli olan sitoplazmik mRNA yüzde 30-40 unextracted hücreler (tekrar 4.2.4) elde edilen ortalama sitoplazmik floresans bölünmesiyle 30-40 çıkarılan hücrelerin ortalama ER floresans (Madde 4.2.4) alınarak hesaplanabilir . Bu ayıklanır ve unextracted hücreleri, hazırlanan lekeli ve paralel görüntülü önemlidir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Signal+recognition+protein+(SRP)+binds+to+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).</li><li>Walter, P., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+II.+Signal+recognition+protein+(SRP)+mediates+the+selective+binding+to+microsomal+membranes+of+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).</li><li>Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+homolog+of+SEC61p+and+SECYp+is+associated+with+ribosomes+and+nascent+polypeptides+during+translocation.">A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation.</a> Cell. 71, 489-503 (1992).</li><li>Grlich, D., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+translocation+into+proteoliposomes+reconstituted+from+purified+components+of+the+endoplasmic+reticulum+membrane.">Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane.</a> Cell. 75, 615-630 (1993).</li><li>Milcarek, C., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+polyribosomes+in+HeLa+cells:+association+of+polyadenylic+acid+with+membranes.">Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes.</a> J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).</li><li>Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+association+of+messenger+RNA+with+microsomal+membranes+in+human+diploid+fibroblasts.">Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts.</a> J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).</li><li>Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+association+of+messenger+RNA+labeled+in+the+presence+of+fluoroorotate+with+membranes+of+the+endoplasmic+reticulum+in+rat+liver.">Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver.</a> J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).</li><li>Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retention+of+mRNA+on+the+endoplasmic+reticulum+membranes+after+in+vivo+disassembly+of+polysomes+by+an+inhibitor+of+initiation.">Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation.</a> J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).</li><li>Kruppa, J., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+poly+A(+)+messenger+RNA+from+rat+liver+rough+microsomes+upon+disassembly+of+bound+polysomes.">Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes.</a> J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).</li><li>Adesnik, M., Maschio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+specific+classes+of+messenger+RNA+into+free+and+membrane-bound+polysomes.">Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes.</a> Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).</li><li>Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p180+Promotes+the+Ribosome-Independent+Localization+of+a+Subset+of+mRNA+to+the+Endoplasmic+Reticulum.">p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum.</a> PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).</li><li>Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+ribosome+functions.">Inhibitors of ribosome functions.</a> Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).</li><li>Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+translation+in+eukaryotic+systems+by+harringtonine.">Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine.</a> Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).</li><li>Weeks, D. P., Baxter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+peptide-chain+initiation+by+2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.">Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.</a> Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).</li><li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes.">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147, 789-802 (2011).</li><li>Lerner, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+and+translation+of+mRNAs+encoding+soluble+proteins+on+membrane-bound+ribosomes.">Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes.</a> RNA. 9, 1123-1137 (2003).</li><li>Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+protein+import+in+permeabilized+mammalian+cells+requires+soluble+cytoplasmic+factors.">Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors.</a> J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Lcuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+implications+of+mRNA+localization+pathways+in+cellular+organization.">Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).</li><li>Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mRNA+nuclear+export+kinetics+in+mammalian+cells+by+microinjection.">Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection.</a> J Vis Exp. 46, e2387 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Çeşitli Subselüler sitelere mRNA&#39;ların lokalizasyonu, mRNA localisation proteinler ile transkript etkileşimi aracılığıyla, bir hücre içi ve yerel gereksinimler nihai hedefe proteinlerin doğru sıralama için ve gen ekspresyonu ince ayar için önemli bir yaygın bir olgudur bölge 19,20. Tahlil kullanılarak burada açıklandığı gibi, bu salgı proteinleri kodlayan mRNA ribozom ya da çeviri varlığında veya yokluğunda, ER muhafaza edilebilir olup olmadığı...

Ökaryotlarda mRNA kodlama çeviri 3,4 sırasında ribozomlar ve translocons arasındaki doğrudan etkileşim yoluyla salgılanan ve membran proteinlerinin eş Çevrimsel sinyal tanıma parçacık 1,2 ER hedeflenebilir ve ER korunabilir. Ancak, mRNA hedefli ve ribozomlar veya çeviri birinin ER bağımsız üzerinde muhafaza edilip edilemeyeceğini çok yakın zamanlara kadar belli değildi. Önceki çalışmalar hücresel fraksiyonlama teknikleri kullanılarak ER ile çeviri bağımsız mRNA ilişki olup olmadığını değinmeye çalıştık. Sert kimyasal koşulların potansiyel hassas mRNA-ER dernek kesebileceği ER türetilmiş veziküller, ribozomların kesmek için gerekli olduğu için, bu çalışmalarda 5-8 delil sağlayan, sonuçsuz ve 9,10 karşı ribozomal bağımsız mRNA ER ankraj . Bu sorunları aşmak için bir proto geliştirdikcol yalıtmak ve görüntü ER bağlı mRNA&#39;ların için. Bu prosedür, aynı anda ER morfoloji ve ilişkili moleküllerin tüm koruyarak etkin bir şekilde hücre (ER-bağlı olmayan mRNA dahil), tüm içerik sitoplazmik kaldıran bir hafif çıkarma tedavi, içerir. Bu protokolü kullanarak biz mRNA&#39;ların bir alt hedef ve sonra bağımsız ribozomlar veya çeviri 11 ER muhafaza olduğunu göstermiştir.

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

Ökaryotlarda salgılanan ve membran proteinleri endoplazmik retikulum (ER) yüzeyine lokalizedir kodlamak haberci RNA&#39;lar (mRNA) çoğu. Bununla birlikte, bu mRNA&#39;ların görselleştirme zor olabilir. Bu mRNA yalnızca bir kısmını ER ilişkili olduğunda özellikle doğrudur ve bu organel kendi dağıtım olmayan hedefli (yani &quot;özgür&quot;) transkript tarafından engelleniyor. Aynı anda ER bütünlüğünü korurken ER-ilişkili mRNA izlemek için, biz, hücreler seçici olarak plazma zarının bir permeabilizes digitonin ekstraksiyon çözeltisi için kısa bir maruz kalma ile muamele edildiği bir yöntem geliştirilmiştir ve bu nedenle sitoplazmik içeriğini kaldırır adres . Bu yöntem in situ hibridizasyon (FISH) flüoresan ile birleştiğinde, biri açıkça floresan mikroskobu ile ER-bound mRNA&#39;ların oluşturulabiliyor. Bu protokol kullanılarak yığın poli (A) ya da spesifik mRNA transkriptleri için ya da ER-bağlantının derecesini tespit edilebilirve hatta sayılabilir. Bu süreç içinde bir mRNA ER etkileşimlerinin doğası araştırmak için bu testte kullanılabilir.

ER-ilişkili olan mRNA yüzdesi, plasental alkalin fosfataz (ALPP) ya da sitokrom P450-8B1 (CYP8B1) ya da digitonin ile ekstre edilmiş ve daha sonra çözülmüştür, ya da direkt olarak tespit edildi içeren plazmitler ile birlikte transfekte edilmiş COS-7 hücreleri belirlemek için (bkz. Şekil 1, karşılaştırın &quot;Ctrl Çıkarılan&quot; için &quot;Ctrl Unextracted&quot;). Nükleer olmayan floresan örnekleri ve ER-ilişkili mRNA fraksiyonu (Şekil 2) he...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells at JoVE.com

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Burada memeli doku kültürü hücrelerinde endoplazmik retikulum ilişkili mRNA&#39;ların görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan, ardından sitoplazmik boşaltılmaya digitonin ile birlikte plazma zarının geçirgenliği seçici içerir<em&gt; In situ</emYa da yığın poli (A) ya da spesifik mRNA transkriptleri tespit etmek için&gt; melezleme.

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

visualization-endoplasmic-reticulum-localized-mrnas-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Görüntüleme.  University of Toronto. Burada memeli doku kültürü hücrelerinde endoplazmik retikulum ilişkili mRNA'ların görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan, ardından sitoplazmik boşaltılmaya digitonin ile birlikte plazma zarının geçirgenliği seçici içerir In situ melezleme.

Video: Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Biyoloji

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized near the mitochondria. Support for this possibility is derived from recent studies, in which many mRNAs encoding mitochondrial proteins were shown to be localized to the mitochondria vicinity. Together with earlier demonstrations of ribosomes&#8217; association with the outer membrane, these results suggest a localized translation process. Such localized translation may improve import efficiency, provide unique regulation sites and minimize cases of ectopic expression. Diverse methods have been used to characterize the factors and elements that mediate localized translation. Standard among these is subcellular fractionation by differential centrifugation. This protocol has the advantage of isolation of mRNAs, ribosomes and proteins in a single procedure. These can then be characterized by various molecular and biochemical methods. Furthermore, transcriptomics and proteomics methods can be applied to the resulting material, thereby allow genome-wide insights. The utilization of yeast as a model organism for such studies has the advantages of speed, costs and simplicity. Furthermore, the advanced genetic tools and available deletion strains facilitate verification of candidate factors.

Many mRNAs encoding mitochondrial proteins are associated with the mitochondria outer membrane. We describe a subcellular fractionation procedure aimed at isolation of yeast mitochondria with its associated mRNAs and ribosomes. This protocol can be applied to cells grown under diverse conditions&#160;in order to reveal mechanisms of mRNA localization and localized translation near the mitochondria.

Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...