Ce travail a été financé par la Fondation Carraresi et MiND FoodS Hub ID: 1176436. Tous les auteurs sont membres de l’action COST CA16119 In vitro 3-D total cell guidance and fitness (CellFit).

Toutes les études ont été examinées et approuvées par le Comité d’éthique de l’Université de Milan. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publié par les National Institutes of Health (NIH) des États-Unis. L’isolement des cellules humaines d’individus adultes en bonne santé a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Ospedale Maggiore Policlinico, Milano. Toutes les méthodes de notre étude ont été réalisées conformément aux directives approuvées.
1. Isolement des fibroblastes cutanés
REMARQUE: Toutes les procédures décrites ci-dessous peuvent être appliquées à des fibroblastes isolés de différentes espèces de mammifères, y compris la souris, le porc et l’homme. Des cellules murines ont été isolées sur des souris mâles âgées de 7 semaines et des tissus cutanés porcins ont été prélevés à l’abattoir local. Des cellules humaines ont été isolées de patients adultes, après consentement éclairé écrit.
<ol><li>Préparer une solution de gélatine porcine à 0,1%.<ol>
<li>Peser 0,1 g de gélatine porcine et la dissoudre dans 100 mL d’eau. Stériliser la solution de gélatine par autoclavage avant utilisation.</li>
		<li>Enduire la boîte de Petri de 35 mm de gélatine porcine à 0,1% en ajoutant 1,5 mL de la solution préparée. Incuber pendant 2 h à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coupez des biopsies cutanées de mammifères (souris, porcins et humains) d’environ 2 à 5 cm de long et placez-les dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de Dulbecco contenant 2% de solution antibiotique antimycotique. Conserver à + 4 °C jusqu’à utilisation. NOTE: Les prélèvements de biopsie doivent être effectués en accord et après approbation du comité d’éthique, conformément aux lignes directrices établies.</li>
	<li>Lavez abondamment les biopsies prélevées trois fois dans du PBS stérile frais contenant 2% de solution antibiotique antimycotique.</li>
	<li>Prélever les biopsies du dernier lavage et les placer dans une boîte de Petri stérile de 100 mm. Utilisez un scalpel stérile pour les couper en morceaux d’environ 2 mm3 .</li>
	<li>À la fin de 2 h d’incubation, retirer l’excès de solution de gélatine de la boîte de Petri de 35 mm (décrite à l’étape 1.1.2) et, à l’aide d’une pince chirurgicale stérile, placer immédiatement 5 à 6 fragments de peau dans chaque boîte de culture pré-enduite.</li>
	<li>Mouiller les fragments en ajoutant 100 μL de gouttelettes de milieu isolant de fibroblastes (tableau 1) sur chacun d’eux. Culture à 37 °C dans un incubateur àCO 2 à 5 %. REMARQUE: Pour empêcher l’évaporation du milieu, placez la boîte de Petri de 35 mm dans une boîte de Petri de 100 mm ou plus contenant de l’eau stérile. Assurez-vous de boucher les deux boîtes de Pétri.</li>
	<li>Après 24 h de culture, vérifiez la quantité du milieu dans la boîte de Petri de culture de 35 mm. Si nécessaire, ajoutez 500 μL de milieu d’isolement des fibroblastes pour garder les fragments humides.</li>
	<li>Retirez soigneusement le milieu et rafraîchissez-le au moins tous les 2 jours de culture à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Lorsque les fibroblastes commencent à se développer à partir des fragments de peau placés dans la boîte de Petri de 35 mm (décrite à l’étape 1.5.) et commencent à former une monocouche cellulaire (généralement 6 jours). Enlever les morceaux de peau à l’aide d’une pince chirurgicale stérile et les cultiver dans 2 mL de milieu isolant fibroblastique.</li>
	<li>Continuer à cultiver la monocouche cellulaire à 37 °C dans un incubateur à 5 % deCO2 jusqu’à 80 % de confluence et rafraîchir le milieu tous les deux jours.</li>
</ol>2. Culture de lignées cellulaires primaires de fibroblastes
<ol><li>Lorsque les fibroblastes atteignent 80% de confluence, retirez soigneusement le milieu d’isolement des fibroblastes et lavez les cellules trois fois avec 3 mL de PBS contenant 1% de solution antibiotique antimycotique.</li>
	<li>Pour le détachement cellulaire, ajouter 600 μL de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % dans la boîte de culture et incuber à 37 °C pendant 3 à 5 min.</li>
	<li>Ajouter 5,4 mL de milieu de culture de fibroblastes pour neutraliser la trypsine lorsque les cellules commencent à se détacher de la boîte de culture (tableau 1).</li>
	<li>Déloger les cellules par pipetage répété et doux. Cellules de plaque dans de nouveaux plats de culture (sans gélatine), en maintenant le rapport de passage entre 1:2 et 1:4 (selon le taux de croissance). REMARQUE: La centrifugation n’est pas nécessaire.</li>
	<li>Maintenir les cellules en culture et changer de milieu tous les 2 jours, jusqu’à ce qu’elles aient atteint 80% de confluence et les passent. REMARQUE: Propager les fibroblastes deux fois par semaine pour maintenir une croissance vigoureuse.</li>
</ol>3. Exposition aux fibroblastes au 5-aza-CR
<ol><li>Préparer une solution mère fraîche de 1 mM 5-aza-CR.<ol>
<li>Peser 2,44 mg de 5-aza-CR et le dissoudre dans 10 mL de glucose élevé DMEM. Resuspendez la poudre par vortex. Stériliser la solution avec un filtre de 0,22 μm. REMARQUE: La solution mère de 5-aza-CR doit être préparée immédiatement avant utilisation.</li>
		<li>Préparer la solution de travail 5-aza-CR en diluant 1 μL de solution mère 5-aza-CR (3.1.1.) dans 1 mL de milieu de culture de fibroblastes. REMARQUE: La concentration de la solution de travail 5-aza-CR est de 1 μM 1,2,3,8,9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trypsiniser les cellules comme décrit précédemment (2.1.-2.3.) et déloger les cellules en les piquant de manière répétée et douce.</li>
	<li>Recueillir la suspension cellulaire et la transférer dans un tube conique.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage sous un microscope optique à température ambiante. Calculer le volume de milieu nécessaire pour remettre en suspension les cellules afin d’obtenir 4 x 104 cellules dans 30 μL de milieu de culture de fibroblastes complété par 1 μM de 5-aza-CR (voir étape 3.1.2.). REMARQUE: La formule à utiliser dépend du type spécifique de chambre. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61655/61655equ01v3.jpg">
</li>
	<li>Centrifuger la suspension de la cellule à 150 x g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille avec le milieu de culture de fibroblastes complété par 1 μM de 5-aza-CR (voir étape 3.1.2.). Pour le volume du milieu de culture de fibroblastes à utiliser, voir l’étape 3.4. REMARQUE: Comme témoin négatif, remettre en suspension les cellules à la même concentration dans un milieu de culture de fibroblastes sans 5-aza-CR et procéder à l’encapsulation cellulaire dans de la poudre de PTFE (étape 4.1.-4.13.).</li>
</ol>4. Encapsulation des fibroblastes dans des micro-bioréacteurs en PTFE
<ol><li>Remplir une boîte de Petri de 35 mm avec de la poudre de polytétrafluoroéthylène (PTFE) pour produire un lit (Figure 1A). REMARQUE: Utilisez des boîtes de Petri bactériologiques de 35 mm pour éviter l’adhérence du marbre liquide. Afin d’obtenir une fine coquille hydrophobe et poreuse, utilisez une poudre de PTFE d’une taille moyenne de particules de 1 μm et produite avec un broyage maximal de 2,0 NPIRI. Cela permet la création de billes liquides perméables au gaz. En outre, le revêtement translucide facilite l’observation des processus d’agrégation cellulaire en temps réel Une plus grande taille des particules conduit à une polydispersité élevée qui peut provoquer une évaporation élevée, une déformation et une perte de la forme sphérique, ainsi que la dissolution prématurée des micro-bioréacteurs.</li>
	<li>Distribuer 30 μL de gouttelette simple contenant 4 x 104 cellules (voir étapes 3.4.- 3.5.) sur le lit de poudre (Figure 1B).</li>
	<li>Faites pivoter doucement la boîte de Petri de 35 mm dans un mouvement circulaire pour vous assurer que la poudre PFTE recouvre entièrement la surface de la goutte liquide pour former un micro-bioréacteur en marbre liquide (Figure 1C).</li>
	<li>Récupérez le micro-bioréacteur en marbre liquide à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL, coupée sur le bord, pour s’adapter au diamètre du marbre (Figure 1D,E). Plaquer le micro-bioréacteur en marbre liquide sur une boîte de Petri bactériologique propre pour le stabiliser (Figure 1F). REMARQUE: Pour créer un frottement pour saisir le marbre à l’intérieur de la pointe, coupez les embouts de la pipette d’un diamètre environ légèrement inférieur au diamètre du marbre liquide.</li>
	<li>Transférer le micro-bioréacteur en marbre liquide de la boîte de Petri dans une plaque de 96 puits (une bille/puits) (Figure 1G).</li>
	<li>Ajouter lentement 100 μL de milieu à partir de la marge du puits. Le micro-bioréacteur commence à flotter sur le support (Figure 1H). REMARQUE: Le micro-bioréacteur se brise en contact direct avec le liquide, en raison de la perturbation de l’hydrophobicité du PTFE. Comme approche alternative, les micro-bioréacteurs en marbre liquide peuvent être placés individuellement dans une boîte de culture bactériologique de 35 mm. Dans ce cas, afin d’éviter l’évaporation du marbre liquide, la boîte de Petri de 35 mm contenant le micro-bioréacteur doit être insérée dans une boîte de Petri de 100 mm, préalablement alicitée avec de l’eau stérile</li>
	<li>Incuber un micro-bioréacteur en marbre liquide pendant 18 h à 37 °C dans un incubateurà CO 2 à 5 % 1,2,3,8,9. REMARQUE: La taille des particules de PTFE de 1 μm peut assurer un échange gazeux optimal entre le liquide intérieur et l’environnement environnant.</li>
	<li>Après une incubation de 5-aza-CR pendant 18 h, prélever le micro-bioréacteur en marbre liquide à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL coupée sur le bord (voir étape 4.5).</li>
	<li>Placez le micro-bioréacteur dans une nouvelle boîte de Petri bactériologique de 35 mm (Figure 1D-F).</li>
	<li>Utilisez une aiguille pour percer le marbre liquide et le casser.</li>
	<li>Récupérer les sphéroïdes formés à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, coupés au bord, sous un stéréomicroscope (Figure 1I,J). REMARQUE: Les cellules épigénétiquement effacées encapsulées dans du PTFE forment une structure sphérique 3D (un agrégat dans chaque marbre liquide).</li>
	<li>Pour évaluer l’acquisition de l’état pluripotent en réponse au 5-aza-CR, vérifiez l’apparition de l’expression génique liée à la pluripotence, OCT4, NANOG, REX1 et SOX2, par PCR qualitative (tableau 2).</li>
	<li>Passez à la deuxième étape du protocole comme décrit ci-dessous.</li>
</ol>5. Culture dans des micro-bioréacteurs en PTFE de cellules épigénétiquement effacées
<ol><li>Préparer un milieu de culture ESC frais (tableau 1).</li>
	<li>Transférer des organoïdes dans une boîte de Petri contenant un milieu ESC pour le lavage des résidus de 5-aza-CR (voir étapes 5.1.-5.2.).</li>
	<li>Préparez une nouvelle boîte de Petri bactériologique de 35 mm contenant du lit de poudre de PTFE (voir aussi l’étape 4.1.).</li>
	<li>Distribuer un seul organoïde dans une gouttelette de milieu de culture ESC de 30 μL sur le lit de poudre à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, coupée au bord (voir étapes 4.9.; 5.3.).</li>
	<li>Faites pivoter doucement la boîte de Petri de 35 mm dans un mouvement circulaire pour former un nouveau micro-bioréacteur en marbre liquide, ramassez-la à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL, coupez-la sur le bord et placez le micro-bioréacteur nouvellement formé dans un puits de plaque de 96 puits (un marbre / puits) (voir les étapes 4.3.-4.6.).</li>
	<li>Pour faire flotter les micro-bioréacteurs, ajouter 100 μL de milieu à partir de la marge du puits pour baigner lentement le marbre (voir note 4.7.).</li>
	<li>Cultivez des micro-bioréacteurs en marbre liquide à 37 °C dans un incubateur àCO 2 à 5 % aussi longtemps que nécessaire. Changez de support tous les deux jours, en suivant la procédure décrite aux points 5.3.-5.7. NOTE: Dans le présent manuscrit, les résultats obtenus avec la culture d’organoïdes pendant 28 jours sont fournis. Cependant, si nécessaire, une période de culture plus longue peut être effectuée.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells.">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+pig+dermal+fibroblast+into+insulin+secreting+cells+by+a+brief+exposure+to+5-aza-cytidine.">Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).</li><li>Brevini, T. A. 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L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+conversion+of+adult+dog+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells.">Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).</li><li>Chandrakanthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-AB+and+5-Azacytidine+induce+conversion+of+somatic+cells+into+tissue-regenerative+multipotent+stem+cells.">PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).</li><li>Manzoni, E. F. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+multiple+spheroid+model+of+olfactory+ensheathing+cells+using+floating+liquid+marbles.">Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles.</a> Scientific Reports. 5, 15083 (2015).</li><li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Marble+as+bioreactor+for+engineering+three-dimensional+toroid+tissues.">Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).</li><li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Marbles+as+bioreactors+for+the+study+of+three-dimensional+cell+interactions.">Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions.</a> Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).</li><li>Varelas, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAZ+controls+Smad+nucleocytoplasmic+shuttling+and+regulates+human+embryonic+stem-cell+self-renewal.">TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).</li><li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem/Progenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP/TAZ.">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li><li>Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+signaling-directed+YAP/TAZ+regulation+encourages+3D+spheroid+colony+formation+and+boosts+plasticity+of+parthenogenetic+stem+cells.">Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Au cours des dernières décennies, plusieurs études se sont concentrées sur le développement de stratégies pour ramener une cellule différenciée en phase terminale vers un état permissif moins engagé et plus élevé. Le protocole décrit ici permet la génération et le maintien à long terme de cellules pluripotentes à partir de cellules matures matures différenciées en phase terminale. La méthode combine deux étapes indépendantes qui impliquent l’induction d’un état permissif élevé qui est obtenu ...

Au cours des dernières décennies, le concept largement accepté de progression unidirectionnelle vers l’engagement et la différenciation cellulaires a été complètement révisé. Il a été démontré que la spécification cellulaire peut être inversée et qu’une cellule différenciée en phase terminale peut être poussée vers un état permissif moins engagé et plus élevé, en utilisant différentes méthodes.
Parmi les nombreuses méthodes proposées, l’une des plus prometteuses consiste à utiliser des composés chimiques pour induire les cellules dans une pluripotence dite induite chimiquement. Les petites molécules utilisées dans cette approche sont capables d’interagir et de modifier la signature épigénétique d’une cellule mature adulte, évitant ainsi le besoin de tout vecteur transgénique et/ou viral 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . De nombreuses études ont récemment montré qu’il est possible de passer de cellules d’un phénotype à un autre en fournissant des stimuli biochimiques et biologiques spécifiques qui induisent la réactivation des gènes hyperméthylés 11,12,13,14,15. Ces événements de déméthylation permettent la conversion de cellules différenciées en phase terminale en un progéniteur primitif, une cellule multipotente ou une cellule à haute plasticité/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Parallèlement, de nombreuses études se sont récemment concentrées sur la compréhension des indices liés à la mécanosension et, plus spécifiquement, sur la possibilité d’utiliser des forces mécaniques pour influencer directement la plasticité cellulaire et/ou la différenciation 16,17,18,19. En effet, il a été clairement démontré que la matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle clé dans le contrôle du devenir cellulaire. En particulier, les signaux biomécaniques et biophysiques produits par l’ECM régulent directement les mécanismes moléculaires et les voies de signalisation, influençant le comportement et les fonctions cellulaires20,21. Ces données récentes ont ouvert la voie au développement de nouveaux systèmes de culture 3D qui imitent plus étroitement le microenvironnement cellulaire in vivo, reproduisant des stimuli mécaniques et physiques qui déterminent le comportement cellulaire.
Nous décrivons ici un protocole en deux étapes qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension, pour générer des cellules pluripotentes de mammifères. Dans la première étape, les cellules sont incubées avec la molécule déméthylante 5-aza-cytidine (5-aza-CR). Cet agent est capable d’induire une déméthylation globale significative de l’ADN grâce à un effet combiné de l’action 8,10 médiée par la translocation directedix-onze (TET2) et de l’inhibition indirecte des ADN méthyltransférases (DNMT)22,23. Cette étape induit l’élimination des blocs épigénétiques avec une réactivation ultérieure de l’expression génique liée à la pluripotence et, par conséquent, la génération de cellules à haute plasticité 1,2,3,8,10, ci-après dénommées « cellules épigénétiquement effacées ». Dans la deuxième étape, les cellules sont encapsulées dans un système de culture 3D. À cette fin, le composé synthétique hydrophobe non réactif polytétrafluoroéthylène (PTFE; avec une taille de particule de 1 μm) est utilisé comme micro-bioréacteur, ce qui permet la création d’un microenvironnement cellulaire irréalisable grâce à l’utilisation de systèmes de culture 2D traditionnels10. Les particules de poudre de PTFE adhèrent à la surface de la goutte de liquide dans laquelle les cellules sont remises en suspension et isolent le noyau liquide de la surface de support, tout en permettant l’échange de gaz entre le liquide intérieur et l’environnement environnant24. Le « micro-bioréacteur PTFE » ainsi obtenu, également connu sous le nom de « marbre liquide », encourage les cellules à interagir librement les unes avec les autres, favorisant le réarrangement cellulaire 3D 25,26,27, et étend et maintient de manière stable l’état de plasticité élevé acquis grâce à des indices liés à la biomécanosension10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Azacytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2385</td>
			<td>5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4036</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Real-Time PCR</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4654</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41966052</td>
			<td>For fibroblast isolation and culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31885023</td>
			<td>For ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61021</td>
			<td>mRNA estraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td>For dish coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneAmp PCR System 2700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Global DNA Methylation ELISA Kit</td>
			<td>CELL BIOLABS</td>
			<td>STA-380</td>
			<td>Methylation study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7801</td>
			<td>Qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6264</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31550031</td>
			<td>For ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOVA glasstic slide 10 with grids</td>
			<td>Hycor Biomedical</td>
			<td>87144</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ APO Stereo Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>For organoid observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS 0.22 &#181;m pore filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>For solution sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3681</td>
			<td>mRNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51119000</td>
			<td>For ELISA plate reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>For cell observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Thermal Cycler 480</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(tetrafluoroethylene) 1 &#956;m particle size</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>430935</td>
			<td>For generating micro-bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>Genomic DNA estraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1728</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833902</td>
			<td>For fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td>For Fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900500</td>
			<td>Bacteriology petri dish for liquid marble culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924005</td>
			<td>For liquid marble culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td>For fibroblast dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15ml, 120x17mm, PS</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62553041</td>
			<td>For cell suspension centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a two-step strategy that combines epigenetic modification and biomechanical cues to generate mammalian pluripotent cells

Le phénotype cellulaire peut être inversé ou modifié avec différentes méthodes, avec des avantages et des limites spécifiques à chaque technique. Nous décrivons ici une nouvelle stratégie qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension, pour générer des cellules pluripotentes de mammifères. Deux étapes principales sont nécessaires. Dans un premier temps, les cellules matures adultes (différenciées en phase terminale) sont exposées à la gomme épigénétique 5-aza-cytidine pour les conduire dans un état pluripotent. Cette partie du protocole a été développée, basée sur la compréhension croissante des mécanismes épigénétiques contrôlant le devenir et la différenciation cellulaires, et implique l’utilisation du modificateur épigénétique pour effacer l’état différencié cellulaire, puis conduire dans une fenêtre transitoire de haute plasticité.
Dans la deuxième étape, les cellules effacées sont encapsulées dans des micro-bioréacteurs en polytétrafluoroéthylène (PTFE), également connus sous le nom de marbres liquides, pour favoriser le réarrangement cellulaire 3D afin d’étendre et de maintenir de manière stable la haute plasticité acquise. Le PTFE est un composé synthétique hydrophobe non réactif et son utilisation permet la création d’un microenvironnement cellulaire, ce qui ne peut être réalisé dans les systèmes de culture 2D traditionnels. Ce système encourage et stimule le maintien de la pluripotence grâce à des indices liés à la biomécanosension.
Les procédures techniques décrites ici sont des stratégies simples pour permettre l’induction et le maintien d’un état de plasticité élevé dans les cellules somatiques adultes. Le protocole a permis la dérivation de cellules à haute plasticité chez toutes les espèces de mammifères testées. Comme il n’implique pas l’utilisation de la transfection de gènes et qu’il est exempt de vecteurs viraux, il peut représenter une avancée technologique notable pour les applications de médecine translationnelle. En outre, le système de micro-bioréacteur fournit une avancée notable dans la technologie organoïde des cellules souches en recréant in vitro un micro-environnement spécifique qui permet la culture à long terme de cellules à haute plasticité, à savoir en tant que CSE, csi, cellules épigénétiquement effacées et CSM.

Le présent protocole décrit toutes les étapes à effectuer pour générer et maintenir de manière stable les cellules pluripotentes de mammifères à partir de cellules somatiques adultes. Cette méthode a été couronnée de succès avec des fibroblastes isolés de différentes espèces de mammifères, à savoir la souris, le porc et l’homme. Les résultats représentatifs rapportés ici sont obtenus à partir de toutes les lignées cellulaires, indépendamment de l’espèce d’origine.
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A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Nous présentons ici une méthode qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension pour générer efficacement des cellules pluripotentes de mammifères, sans avoir besoin de transfection de gènes ou de vecteurs rétroviraux. Cette stratégie est donc prometteuse pour la médecine translationnelle et représente une avancée notable dans la technologie des organoïdes de cellules souches.

Une stratégie en deux étapes qui combine la modification épigénétique et les indices biomécaniques pour générer des cellules pluripotentes de mammifères

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

a-two-step-strategy-that-combines-epigenetic-modification

Research

JoVE Journal

Biology

2.2K vues.  Università degli Studi di Milano. Nous présentons ici une méthode qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension pour générer efficacement des cellules pluripotentes de mammifères, sans avoir besoin de transfection de gènes ou de vecteurs rétroviraux. Cette stratégie est donc prometteuse pour la médecine translationnelle et représente une avancée notable dans la technologie des organoïdes de cellules souches.

Vidéo: A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinisation et Repiquage des cellules de mammifères

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Recherche

Biologie

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l&#39;expression génique dans les cellules humaines Activé

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

TPS-Sa purification: A deux pas d&#39;affinité Protocole Purification Cédant longs protéines purifiées

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Isolement des hépatocytes humains par un deux-étape collagénase procédure de perfusion

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Inverser levure système à deux hybrides pour identifier les mammifères Nuclear Receptor résidus qui interagissent avec des ligands et / ou antagonistes

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

Automatisation expériences ChIP-seq pour générer des profils épigénétiques sur 10 000 cellules HeLa

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...