Bu çalışma Intramural Araştırma Bölümü, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklendi. S.H., Japonya Kamu-Özel Ortaklığı Öğrenci Yurtdışında Eğitim Programı tarafından desteklendi ve H.N. ve K.Y. Valor ve V Drug Overseas Training Scholarship tarafından desteklendi.

1. SDS-PAGE ve bir PVDF membran aktarın
<ol><li>Proteinleri göreli boyuta göre ayırmak için SDS-PAGE gerçekleştirin. NOT: Herhangi bir ticari veya ev yapımı jel sistemi iyidir. Lütfen üreticinin protokolüne uyun.</li>
	<li>Ayrılmış proteinleri bir jelden PVDF zarına aktarın. NOT: Yaygın transfer yöntemleri (yarı kuru veya ıslak transfer) uygundur. Lütfen üreticinin protokolüne uyun.</li>
</ol>2. PVDF membranlarının engellenmesi
<ol><li>Membranları oda sıcaklığında ajitasyon ile 1 saat boyunca uygun engelleme tamponlarında kuluçkaya yatırın. NOT: Birincil antikor ve algılama sistemine bağlı olarak uygun bir blokaj tamponu seçilmelidir. Örneğin, en tipik blokerler BSA, yağsız kuru süt, kazein ve ticari sentetik polimerlerdir. %0,1 Ara20 ile PBS ve/veya TBS en sık kullanılan arabelleklerdir. Bu engelleme adımı 4 °C'de bir gecede yapılabilir.</li>
</ol>3. Primer antikor ile inkübasyon
<ol><li>Damıtılmış su ile %10 immünoreaksiyon arttırıcı ajan-1 çözeltisi (IRE-1) hazırlayın. Girdap iyi.</li>
	<li>Seyreltilmiş primer antikoru% 10 IRE-1 ile hazırlayın. Hafifçe ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Daha büyük bir membran (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) kullanıyorsanız, 50 mL konik santrifüj tüplerine 8 mL antikor çözeltisi ekleyin. Daha küçük bir membran (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) kullanıyorsanız, 14 mL yuvarlak tabanlı polipropilen tüpe(Malzeme Tablası)3 mL antikor çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>PVDF membranını cımbızla alın ve engelleme solüsyonunu kısa bir süre boşaltın. PVDF zarını eldivenli parmaklarla bu tüpe yerleştirin ve tüm zarın tüpün duvarına yapıştığından emin olun. PVDF membran bir tüpe yerleştirildiğinde, başlangıçta jel ile içe doğru temas eden zarın "protein tarafı" ile yüzleşin. Kapağı sıkıca kapatın.</li>
	<li>50 mL'lik tüpü hibridizasyon fırını için bir cam şişeye yerleştirin. NOT: Bu inkübasyon için 14 mL tüp kullanıldığında, iç tüpü 50 mL tüpün ortasında tutmak için bir çift plastik halka tutucu kullanarak 50 mL'lik tüpe 14 mL'lik bir tüp yerleştirin.</li>
	<li>Hibridizasyon fırınını açın.</li>
	<li>Membranı en az 5 dakika boyunca 6 rpm dönüşle kuluçkaya yatırın. NOT: Membranın her zaman duvara yapıştığından ve (iç) tüpün membranı antikor çözeltisi ile eşit şekilde kaplayacak şekilde yatay olduğundan emin olun. Gerçek deneyden önce antikorun seyreltilmesini ve kuluçka süresini kalibre edin.</li>
</ol>4. Membran yıkama
<ol><li>Dönüşü durdurun.</li>
	<li>PVDF membranını cımbızla tüpten dikkatlice çıkarın ve membranı 50 mL PBS-T içeren bir kaba yerleştirin.</li>
	<li>Membranı PBS-T ile kısa bir süre durulayın.</li>
	<li>Zarı kabarmış su ile kabarcık görününe kadar durulayın. Bu antikorun çoğunluğunu çıkarmaktır.</li>
	<li>PVDF membranını kaptan 250 mL PBS-T içeren salata spinner'a aktarın.</li>
	<li>Süzgeç sepetini spinner'a yerleştirin. Kapağın güvenli bir şekilde takıldığından emin olun.</li>
	<li>Spinner'ı etkinleştirin ve yaklaşık 20-30 s boyunca çalıştırın.</li>
	<li>Çözeltiyi atın ve spinner'ın içini damıtılmış suyla kısa bir süre durulayın.</li>
	<li>Spinner'a tekrar 250 mL PBS-T ekleyin.</li>
	<li>4.6 ve 4.7 adımlarını yineleyin.</li>
</ol>5. İkincil antikor ile inkübasyon
<ol><li>Damıtılmış su ile %10 immünoreaksiyon arttırıcı ajan-2 çözeltisi (IRE-2) hazırlayın. Girdap iyi.</li>
	<li>Seyreltilmiş ikincil antikorun %10 IRE-2 ile hazırlanması. Hafifçe ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Adım 3.3'te belirtildiği gibi antikor çözeltisinin ve tüpün hacmini seçin.</li>
	<li>PVDF zarını cımbızla alın ve çözeltiyi kısaca boşaltın. 3.4. adımda belirtildiği gibi PVDF membranını tüpe yerleştirin.</li>
	<li>50 mL'lik tüpü hibridizasyon fırını için bir cam şişeye yerleştirin.</li>
	<li>Hibridizasyon fırınını açın.</li>
	<li>Membranı en az 5 dakika boyunca 6 rpm dönüşle kuluçkaya yatırın. Zarın her zaman duvara yapıştığından ve (iç) tüpün membranı antikor çözeltisi ile eşit şekilde kaplayacak şekilde yatay olduğundan emin olun. NOT: Gerçek denemeden önceki kuluçka süresini kalibre edin. İkincil antikor floresan konjuge edildiğinde, inkübasyonu karanlıkta gerçekleştirin.</li>
</ol>6. Membran yıkama
<ol><li>4.1 ile 4.10 arasında olan adımları izleyin.</li>
</ol>7. Görüntü alımı
<ol><li>Chemiluminescent algılama<ol>
<li>Düz bir yüzeye bir parça yarı nakil esnek film (10 cm x 15 cm) yerleştirin.</li>
		<li>Chemiluminescent substratının 2 bileşenini 5 mL'lik bir tüpte karıştırın.</li>
		<li>Karışık substratın 1,5 mL'sini hemen yarı nakil esnek filme aktarın ve üzerine PVDF zarını yerleştirin. Daha sonra, substrat çözeltisinin geri kalanını zara aktarın.</li>
		<li>PVDF membranı, yarı saydam esnek bir film üzerindeki karışık substrat ile 1 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>PVDF membranını cımbızla alın ve substrat çözeltisini kısa bir süre boşaltın.</li>
		<li>Membranı bir çift şeffaflık filmi arasına sıkıştırın.</li>
		<li>Görüntüyü chemiluminescent modu altında alın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Floresan algılama<ol>
<li>PVDF zarını cımbızla alın ve çözeltiyi kısaca boşaltın.</li>
		<li>Membranı bir çift şeffaflık filmi arasına sıkıştırın.</li>
		<li>Görüntüyü floresan modunda elde edin. NOT: Maksimum hassasiyet sağlamak için 7.1 ve 7.2 adımları görüntüleme makinesine yakın bir yerde yapılmalıdır.</li>
		<li>Arka plan sinyali yüksek olduğunda, 80-100 mL PBS-T içeren bir kapta yıkama adımı gerçekleştirin: birincil antikor için 3 kez 10 dakika durulayın ve ikincil antikor için 5 dakika durulayın. NOT: %10 IRE çözeltileri ile seyreltilmiş hem birincil hem de ikincil antikorlar hassasiyet kaybı olmadan 8-10 kata kadar kullanılabilir6. Çözelti 1 aya kadar 4 °C'de tutulmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+for+improving+Western+blot+analysis.">Methodological considerations for improving Western blot analysis.</a> Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+critical+factors+for+quantitative+immunoblotting.">An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting.</a> Science Signaling. 8 (371), (2015).</li><li>Schuck, P., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mass+transport+limitation+and+surface+heterogeneity+in+the+biophysical+characterization+of+macromolecular+binding+processes+by+SPR+biosensing.">The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing.</a> Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).</li><li>Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+Size-Associated+Diffusion+Constraints+for+Rapid+On-Surface+Bioassays+with+Nanoparticle+Probes.">Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes.</a> Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).</li><li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+but+not+Obsolete:+An+Enhanced+High+Speed+Immunoblot.">Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot.</a> Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Western+blotting":+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).</li><li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+and+analysis:+next+generation+Western+blotting+techniques.">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li><li>Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+EGF+receptor+signaling+dynamics+with+microwestern+arrays.">Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays.</a> Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).</li><li>Treindl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-based+western+for+high-throughput+cellular+signal+transduction+analyses.">A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses.</a> Nature Communications. 7, 12852 (2016).</li><li>Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+western+blot+assay+by+rotational+cyclic+draining+and+replenishing+procedure.">Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure.</a> Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+other+notable+protein+detection+methods+on+blots.">A brief review of other notable protein detection methods on blots.</a> Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).</li><li>Nagase, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+and+Sensitive+Detection+of+Glycosaminoglycan+Chains+with+Immunoblots.">Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.</a> Glycobiology. , (2020).</li></ol>

Yazarlar, bu makalenin içeriğiyle doğrudan ilgili rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Batı blotu, ~40 yıl önce7,8. O zamandan beri, teknik gelişmeye devam etti, sonraki yenilikler tekniğin hassasiyetini, hızını ve niceliğini geliştirdi2, 9,10,11,12,13. Burada sunulan gelişmiş ultra yüksek hızlı batı şişkinlik protokolü, mevcut teknik...

Batı lekesi (immünoblot olarak da bilinir), çok çeşitli bilimsel ve klinik disiplinlerde güçlü ve temel bir tekniktir. Bu teknik, proteinlerin varlığını, bağıl bolluğunu, bağıl moleküler kütlesini ve çeviri sonrası modifikasyonlarını incelemek için kullanılır1. Dijital görüntü analizi ile birlikte, bu yöntem proteinlerin bolluğunu ve protein modifikasyonlarını güvenilir bir şekilde analiz edebilir2. Batı lekesi rutin olarak yapılsa da zaman alan ve emek yoğun bir yöntemdir. Antikorun membranlarla uzun inkübasyonları gereklidir. Burada, duyarlılıktan ödün vermeden bu sınırlamanın üstesinden gelen kuluçka yönteminin bir değişikliğini açıklıyoruz.
Membran inkübasyonu sırasında, antikorlar çözelti içinde yüzerken, antijenler membran üzerinde hareketsiz hale getirilir. Yüksek benzeşimleri nedeniyle, antijene antikor bağlanma hızı, antikorların dökme çözeltiden zara yayılmasından daha hızlıdır. Bu, düşük konsantrasyonda bir "tükenme katmanı" oluşturur (Şekil 1). Bu teknikte uzun kuluçka sürelerinin ana faktörü olan pasif difüzyon yoluyla daha uzak antikorların zara ulaşması saatler alabilir. Bu etkiye toplu taşıma sınırlaması (MTL)3denir. Antikor içeren çözeltinin tekrar tekrar boşaltılması ve yenilenmesinin tükenme tabakasını bozabileceği ve MTL4'ünüstesinden gelebileceği önerilmiştir. Burada, geleneksel bir batı blotting protokolünde MTL'nin etkisini azaltmak ve gerekli kuluçka süresini kısaltmak için bu döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) kavramını uygulayan benzersiz bir teknik tasarladık.
Algılama hassasiyetini kısa bir kuluçka süresiyle korumak için, antijen-antikor reaksiyonunu hızlandıran ve böylece sinyal-gürültü oranını artıran bir immünoreaksiyon arttırıcı teknoloji kullandık5. Piyasada bulunan birçok immünoreaksiyon arttırıcı madde (IRE) 2 bileşenden oluşur (Çözüm 1 ve 2, bkz. Malzeme Tablosu). IRE'nin tescilli bileşimi veya etki mekanizması açıklanmadı, ancak daha önce IRE'nin katı faz bağlama testlerinde antijen ve antikor arasındaki ayrışma sabitini azalttığını bulduk, bu da artan benzeşimin en azından kısmen IRE6'nınarttırıcı etkisinden sorumlu olduğunu gösteriyor. CDR'nin IRE ile kombinasyonu, hassasiyettan ödün vermeden tüm prosedür süresini azaltan ultra yüksek hızlı bir batı blotting protokolü verir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apollo Transparency Film for Laser Printers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure Imaging System 600</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Azure 600</td>
			<td>Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>NKB-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARNATION Instant Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Carnation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from sheep</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9310V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from donkey</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9340V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYBAID Micro-4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>seracare</td>
			<td>5430-0049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#223; actin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>927-40100</td>
			<td>Blocking Buffer for fluorescent detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OXO Salad Spinner</td>
			<td>OXO</td>
			<td>32480V2B</td>
			<td>Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm Sealing Film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M PM996</td>
			<td>semi-transparent flexible film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepared in a machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-6X His tag antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology

Batı lekesi (immünoblot olarak da bilinir) biyomedikal araştırmalar için kurallı bir yöntemdir. Genellikle belirli proteinlerin bağıl boyutunu ve bolluğunu ve çeviri sonrası protein modifikasyonlarını belirlemek için kullanılır. Bu teknik zengin bir geçmişe sahiptir ve sadeliği nedeniyle yaygın kullanımda kalır. Bununla birlikte, batı şişkinlik prosedürünün tamamlanması saatler, hatta günler alır ve kritik bir darboğaz, verimini sınırlayan uzun kuluçka süreleridir. Bu inkübasyon adımları, antikorların toplu çözeltiden membran üzerindeki hareketsiz antijenlere kadar yavaşça yayılması nedeniyle gereklidir: zarın yakınındaki antikor konsantrasyonu, toplu konsantrasyondan çok daha düşüktür. Burada, antikor çözeltisinin döngüsel drenajı ve yenilenmesi (CDR) yoluyla antijen bağlanmasını iyileştirerek bu kuluçka aralıklarını önemli ölçüde azaltan bir yenilik sunuyoruz. Ayrıca tahlil hassasiyetini korumak için bir immünoreaksiyon arttırıcı teknoloji kullandık. CDR yönteminin ticari bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile kombinasyonu çıkış sinyalini artırdı ve antikor inkübasyon süresini önemli ölçüde azalttı. Elde edilen ultra yüksek hızlı batı lekesi, hassasiyet kaybı olmadan 20 dakikada gerçekleştirilebilir. Bu yöntem hem chemiluminescent hem de floresan tespiti kullanılarak batı lekelerine uygulanabilir. Bu basit protokol, araştırmacıların birçok örnekte protein ekspresyonunun analizini daha iyi keşfetmelerini sağlar.

Bu örnek, CDR yönteminin batı blot üzerindeki immünoenhancing teknolojisi ile birlikte etkinliğini göstermektedir. Statik inkübasyon, PVDF membranlarının antikor çözeltisi ile inkübe edildiği yarı saydam esnek bir film üzerinde yapılırken, CDR inkübasyonu membranları ve antikor çözeltisini (Film) içeren tüpleri döndürerek hibridizasyon fırınında yapıldı. Şekil 2'de batı lekelerinde chemiluminescent tespiti için gerekli olan antijen ve antikor miktarları gö...

Watch this Scientific Journal Video about Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology at JoVE.com

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra yüksek hızlı batı şişkinlik tekniği, bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile birlikte döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) teknolojisi ile antijen-antikor bağlama kinetiğinin iyileştirilmesi ile geliştirilmiştir.

İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

ultra-high-speed-western-blot-using-immunoreaction-enhancing

Research

JoVE Journal

Biochemistry

5.8K Görüntüleme.  National Institutes of Health. Ultra yüksek hızlı batı şişkinlik tekniği, bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile birlikte döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) teknolojisi ile antijen-antikor bağlama kinetiğinin iyileştirilmesi ile geliştirilmiştir.

Video: Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biyokimya

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western blotting protocol was optimized and suitable for the analysis of small numbers of HSCs (500 - 15,000 cells). Phenotypic HSCs were purified, accurately counted, and directly lysed in Laemmli sample buffer. Lysates containing equal numbers of cells were analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the blot was prepared and processed following standard Western blotting protocols. Using this protocol, 2,000 - 5,000 HSCs can be routinely analyzed, and in some cases data can be obtained from as few as 500 cells, compared to the 20,000 to 40,000 cells reported in most publications. This protocol should be generally applicable to other hematopoietic cells, and enables the routine analysis of small numbers of cells using standard laboratory procedures.

A standard Western blotting protocol was optimized for analyzing as few as 500 hematopoietic stem or progenitor cells. Optimization involves careful handling of the cell sample, limiting transfers between tubes, and directly lysing the cells in Laemmli sample buffer.

Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and tissue level significantly hampers the progress in proteomic research. Results derived from currently available immunoblot techniques are also relative, preventing any efforts to combine independent studies with a large-scale analysis of protein samples. In this study, we demonstrate the process of quantitative dot blot analysis (QDB) to achieve absolute quantification in a high throughput format. Using a commercially available protein standard, we are able to determine the absolute content of capping actin protein, gelsolin-like (CAPG) in protein samples prepared from three different mouse tissues (kidney, spleen, and prostate) together with a detailed explanation of the experimental details. We propose the QDB analysis as a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method of absolute quantification of individual proteins at the cellular and tissue level. This method will substantially aid biomarker validation and pathway verification in various areas of biological and biomedical research.

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Here we demonstrate a detailed process of quantitative dot blot analysis (QDB) by determining the absolute content of a targeted protein, capping actin protein, gelsolin-like (CAPG), in three different mouse tissues. We demonstrate a high throughput, convenient, quantitative immunoblot technique for biomarker validation at the cellular and tissue level.

Yüksek işlem hacmi, mutlak nicel nokta kullanarak doku düzeyleri, seçili bir Protein içeriği tayini Blot Analizi (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

Sağlam dokulara ve standart nicel Western Blot kullanarak geliştirme boyunca Protein düzeylerinin karşılaştırılması

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal transduction, metabolism, and development. These metabolites perform this regulatory activity by binding to proteins, thereby changing protein conformation, catalytic activity, and/or interactions. The method described here uses affinity chromatography coupled to mass spectrometry or Western blotting to identify proteins that interact with inositol phosphates or phosphoinositides. Inositol phosphates or phosphoinositides are chemically tagged with biotin, which is then captured via streptavidin conjugated to agarose or magnetic beads. Proteins are isolated by their affinity of binding to the metabolite, then eluted and identified by mass spectrometry or Western blotting. The method has a simple workflow that is sensitive, non-radioactive, liposome-free, and customizable, supporting the analysis of protein and metabolite interaction with precision. This approach can be used in label-free or in amino acid-labelled quantitative mass spectrometry methods to identify protein-metabolite interactions in complex biological samples or using purified proteins. This protocol is optimized for the analysis of proteins from Trypanosoma brucei, but it can be adapted to related protozoan parasites, yeast or mammalian cells.

This protocol focuses on the identification of proteins that bind to inositol phosphates or phosphoinositides. It uses affinity chromatography with biotinylated inositol phosphates or phosphoinositides that are immobilized via streptavidin to agarose or magnetic beads. Inositol phosphate or phosphoinositide binding proteins are identified by Western blotting or mass spectrometry.

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. Biomolecules such as proteins, carbohydrates, vitamins, fatty acids, nucleic acids, and enzymes are fundamental building blocks of living beings; they assemble into complex networks in biosystems to synchronize a myriad of life events. Proteins typically utilize complex interactome networks to carry out their functions; hence it is mandatory to evaluate such interactions to unravel their importance in cells at both cellular and organism levels. Toward this goal, we introduce a rapidly emerging technology, field-effect biosensing (FEB), to determine specific biomolecular interactions. FEB is a benchtop, label-free, and reliable biomolecular detection technique to determine specific interactions and uses high-quality electronic-based biosensors. The FEB technology can monitor interactions in the nanomolar range due to the biocompatible nanomaterials used on its biosensor surface. As a proof of concept, the protein-protein interaction (PPI) between heat shock protein 90 (Hsp90) and cell division cycle 37 (Cdc37) was elucidated. Hsp90 is an ATP-dependent molecular chaperone that plays an essential role in the folding, stability, maturation, and quality control of many proteins, thereby regulating multiple vital cellular functions. Cdc37 is regarded as a protein kinase-specific molecular chaperone, as it specifically recognizes and recruits protein kinases to Hsp90 to regulate their downstream signal transduction pathways. As such, Cdc37 is considered a co-chaperone of Hsp90. The chaperone-kinase pathway (Hsp90/Cdc37 complex) is hyper-activated in multiple malignancies promoting cellular growth; therefore, it is a potential target for cancer therapy. The present study demonstrates the efficiency of FEB technology using the Hsp90/Cdc37 model system. FEB detected a strong PPI between the two proteins (KD values of 0.014 &#181;M, 0.053 &#181;M, and 0.072 &#181;M in three independent experiments). In summary, FEB is a label-free and cost-effective PPI detection platform, which offers fast and accurate measurements.

Field-effect biosensing (FEB) is a label-free technique for detecting biomolecular interactions. It measures the electric current through the graphene biosensor to which the binding targets are immobilized. The FEB technology was used to evaluate biomolecular interactions between Hsp90 and Cdc37 and a strong interaction between the two proteins was detected.

Moleküler Chaperone Hsp90 ve İstemci Protein Kinaz Cdc37 Arasındaki Biyomoleküler Etkileşimi Alan Etkili Biyosensing Teknolojisini Kullanarak Keşfetmek

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers of multi-layered samples. This removal of layers prior to plunge freezing can aid in reducing sample thickness to a level suitable for cryo-EM data collection, improving sample flatness, and facilitating image processing. The peel-blot technique allows for the separation of multilamellar membranes into single layers, of layered 2D crystals into individual crystals, and of stacked, sheet-like structures of soluble proteins to likewise be separated into single layers. The high sample thickness of these types of samples frequently poses insurmountable problems for cryo-EM data collection and cryo-EM image processing, especially when the microscope stage must be tilted for data collection. Furthermore, grids of high concentrations of any of these samples can be prepared for efficient data collection since sample concentration prior to grid preparation can be increased and the peel-blot technique adjusted to result in a dense distribution of single-layered specimen.

The peel-blot technique is a cryo-EM grid preparation method that allows for the separation of multilayered and concentrated biological samples into single layers to reduce thickness, increase sample concentration, and facilitate image processing.

Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively in the neuron and is essential for the proper functioning of Cl- homeostasis and consequently functional GABAergic inhibition. Failure in proper regulation of KCC2 is deleterious and has been associated with the prevalence of several neurological diseases, including epilepsy. There has been considerable progress with regard to understanding the mechanisms involved in the regulation of KCC2, accredited to the development of techniques that enable researchers to study its functions and activities; either via direct (assessing kinase regulatory sites phosphorylation) or indirect (observing and monitoring GABA activity) investigations. Here, the protocol highlights how to investigate KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites - Thr906 and Thr1007- using western blotting technique. There are other classic methods used to directly measure KCC2 activity, such as rubidium ion and thallium ion uptake assay. Further techniques such as patch-clamp-electrophysiology are used to measure GABA activity; hence, indirectly reflecting activated and/or inactivated KCC2 as informed by the assessment of intracellular chloride ion homeostasis. A few of these additional techniques will be briefly discussed in this manuscript.

The present protocol highlights the application of western blotting technique to study the functions and activities of neuronal K-Cl co-transporter KCC2. The protocol describes the investigation of KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites Thr906/1007 via western blotting. Also, additional methods to confirm KCC2 activity are briefly highlighted in this text.

Western Blotting Kullanarak Nöronal K-Cl Co-Transporter KCC2'nin Fonksiyonlarının ve Aktivitelerinin İncelenmesi

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...