Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Intramurale Forschung, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, unterstützt. S.H. wurde vom Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program unterstützt, und H.N. und K.Y. waren von Valor und V Drug Overseas Training Scholarship.

1. SDS-PAGE und Übertragung auf eine PVDF-Membran
<ol><li>Führen Sie SDS-PAGE aus, um Proteine basierend auf der relativen Größe zu trennen. HINWEIS: Jedes kommerzielle oder hausgemachte Gelsystem ist in Ordnung. Bitte folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.</li>
	<li>Übertragen Sie getrennte Proteine von einem Gel auf eine PVDF-Membran. HINWEIS: Häufige Übertragungsmethoden (halbtrockener oder nasser Transfer) sind geeignet. Bitte folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.</li>
</ol>2. Blockierung von PVDF-Membranen
<ol><li>Inkubieren Sie die Membranen in geeigneten Blockierpuffern für 1 h mit Rührung bei Raumtemperatur. HINWEIS: Abhängig vom primären Antikörper und Detektionssystem sollte ein geeigneter Blockierpuffer ausgewählt werden. Die typischsten Blocker sind beispielsweise BSA, fettfreie Trockenmilch, Casein und kommerzielle synthetische Polymere. PBS und/oder TBS mit 0,1% Tween20 sind die am häufigsten verwendeten Puffer. Dieser Sperrschritt kann über Nacht bei 4 °C erfolgen.</li>
</ol>3. Inkubation mit primärem Antikörper
<ol><li>Bereiten Sie 10% Immunreaktions-Verbesserungsmittel-1-Lösung (IRE-1) mit destilliertem Wasser vor. Wirbel gut.</li>
	<li>Bereiten Sie den verdünnten Primärantikörper mit 10% IRE-1 vor. Mischen Sie es sanft und gründlich.</li>
	<li>Bei Verwendung einer größeren Membran (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) 8 ml der Antikörperlösung in 50 ml konische Zentrifugenrohre geben. Bei Verwendung einer kleineren Membran (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) 3 ml der Antikörperlösung in 14 ml rundboden-Polypropylenrohr(Materialtabelle)geben.</li>
	<li>Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und entleeren Sie die Blockierlösung kurz. Setzen Sie die PVDF-Membran mit gehandicapten Fingern in dieses Rohr ein und stellen Sie sicher, dass die gesamte Membran an der Rohrwand haftet. Wenn die PVDF-Membran in eine Röhre eingeführt wird, stellen Sie sich der "Proteinseite" der Membran, die ursprünglich mit dem Gel nach innen in Berührung kam. Schließen Sie die Kappe fest.</li>
	<li>Legen Sie das 50 ml-Rohr für den Hybridisierungsofen in eine Glasflasche ein. HINWEIS: Wenn 14 ml Rohre für diese Inkubation verwendet werden, legen Sie ein 14 ml Rohr in das 50 ml Rohr ein, mit einem Paar Kunststoffringhalter, um das Innenrohr in der Mitte des 50 ml Rohres zu halten.</li>
	<li>Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit 6 Rpm-Drehung für mindestens 5 min. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Membran jederzeit an der Wand haftet und dass das (innere) Rohr horizontal ist, um die Membran gleichmäßig mit der Antikörperlösung zu bedecken. Kalibrieren Sie die Verdünnung des Antikörpers und die Inkubationszeit vor dem eigentlichen Experiment.</li>
</ol>4. Membranwäsche
<ol><li>Beenden Sie die Drehung.</li>
	<li>Entfernen Sie die PVDF-Membran vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Rohr und legen Sie die Membran in einen Behälter mit 50 ml PBS-T.</li>
	<li>Spülen Sie die Membran kurz mit PBS-T.</li>
	<li>Spülen Sie die Membran im Behälter mit destilliertem Wasser, bis keine Blasen auftreten. Dadurch wird der Großteil des Antikörpers entfernt.</li>
	<li>Übertragen Sie die PVDF-Membran aus dem Behälter auf den Salatspinner, der 250 ml PBS-T enthält.</li>
	<li>Legen Sie den Siebkorb in den Spinner. Stellen Sie sicher, dass der Deckel sicher aufgesetzt wurde.</li>
	<li>Aktivieren Sie den Spinner und führen Sie ihn für ca. 20-30 s aus.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie das Innere des Spinners kurz mit destilliertem Wasser ab.</li>
	<li>Fügen Sie 250 ml PBS-T wieder in den Spinner ein.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.6 und 4.7.</li>
</ol>5. Inkubation mit dem sekundären Antikörper
<ol><li>Bereiten Sie 10% Immunreaktionsverbesserungsmittel-2-Lösung (IRE-2) mit destilliertem Wasser vor. Wirbel gut.</li>
	<li>Bereiten Sie den verdünnten Sekundärantikörper mit 10% IRE-2 vor. Mischen Sie es sanft und gründlich.</li>
	<li>Wählen Sie das Volumen der Antikörperlösung und des Rohres gemäß Schritt 3.3 aus.</li>
	<li>Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und lassen Sie die Lösung kurz abtropfen. Setzen Sie die PVDF-Membran gemäß Schritt 3.4 in das Rohr ein.</li>
	<li>Legen Sie das 50 ml-Rohr für den Hybridisierungsofen in eine Glasflasche ein.</li>
	<li>Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit 6 Rpm-Drehung für mindestens 5 min. Stellen Sie sicher, dass die Membran jederzeit an der Wand haftet und dass das (innere) Rohr horizontal ist, um die Membran gleichmäßig mit der Antikörperlösung zu bedecken. HINWEIS: Kalibrieren Sie die Inkubationszeit vor dem eigentlichen Experiment. Wenn der sekundäre Antikörper fluoreszierend konjugiert ist, führen Sie die Inkubation im Dunkeln durch.</li>
</ol>6. Membranwäsche
<ol><li>Folgen Sie den Schritten 4.1 bis 4.10.</li>
</ol>7. Bildaufnahme
<ol><li>Chemilumineszenz-Erkennung<ol>
<li>Legen Sie ein Stück halbtransplantierender flexibler Folie (10 cm x 15 cm) auf eine flache Oberfläche.</li>
		<li>Mischen Sie 2 Komponenten des chemilumineszierenden Substrats in einem 5 ml Rohr.</li>
		<li>1,5 ml des Mischsubstrats sofort auf die halbtransplantierbare flexible Folie übertragen und die PVDF-Membran darauf legen. Dann übertragen Sie den Rest der Substratlösung auf die Membran.</li>
		<li>Inkubieren Sie die PVDF-Membran mit dem gemischten Substrat auf einer halbtransparenten flexiblen Folie für 1 min.</li>
		<li>Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und entleeren Sie die Substratlösung kurz.</li>
		<li>Sandwich die Membran zwischen einem Paar Von-Transparenz-Filme.</li>
		<li>Erfassen Sie das Bild im chemilumineszierenden Modus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fluoreszierende Detektion<ol>
<li>Nehmen Sie die PVDF-Membran mit einer Pinzette auf und lassen Sie die Lösung kurz abtropfen.</li>
		<li>Sandwich die Membran zwischen einem Paar Von-Transparenz-Filme.</li>
		<li>Erfassen Sie das Bild im Fluoreszenzmodus. HINWEIS: Die Schritte 7.1 und 7.2 sollten in unmittelbarer Nähe zur Bildverarbeitungsmaschine durchgeführt werden, um eine maximale Empfindlichkeit zu gewährleisten.</li>
		<li>Wenn das Hintergrundsignal hoch ist, führen Sie einen Waschschritt in einem Behälter mit 80-100 ml PBS-T durch: 10 min Spülen 3 mal für den primären Antikörper und 5 min Spülung 6 mal für den sekundären Antikörper. HINWEIS: Sowohl primäre als auch sekundäre Antikörper, die mit 10% IRE-Lösungen verdünnt werden, können bis zu 8-10-mal ohne Verlust derEmpfindlichkeit6 verwendet werden. Die Lösung sollte bis zu einem Monat bei 4 °C aufbewahrt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+for+improving+Western+blot+analysis.">Methodological considerations for improving Western blot analysis.</a> Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+critical+factors+for+quantitative+immunoblotting.">An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting.</a> Science Signaling. 8 (371), (2015).</li><li>Schuck, P., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mass+transport+limitation+and+surface+heterogeneity+in+the+biophysical+characterization+of+macromolecular+binding+processes+by+SPR+biosensing.">The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing.</a> Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).</li><li>Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+Size-Associated+Diffusion+Constraints+for+Rapid+On-Surface+Bioassays+with+Nanoparticle+Probes.">Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes.</a> Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).</li><li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+but+not+Obsolete:+An+Enhanced+High+Speed+Immunoblot.">Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot.</a> Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Western+blotting":+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).</li><li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+and+analysis:+next+generation+Western+blotting+techniques.">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li><li>Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+EGF+receptor+signaling+dynamics+with+microwestern+arrays.">Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays.</a> Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).</li><li>Treindl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-based+western+for+high-throughput+cellular+signal+transduction+analyses.">A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses.</a> Nature Communications. 7, 12852 (2016).</li><li>Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+western+blot+assay+by+rotational+cyclic+draining+and+replenishing+procedure.">Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure.</a> Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+other+notable+protein+detection+methods+on+blots.">A brief review of other notable protein detection methods on blots.</a> Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).</li><li>Nagase, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+and+Sensitive+Detection+of+Glycosaminoglycan+Chains+with+Immunoblots.">Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.</a> Glycobiology. , (2020).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen für den Inhalt dieses Artikels für unmittelbar relevant erklärt.

Western Blot ist eine weit verbreitete analytische Technik zum Nachweis spezifischer Proteine, die vor 40 Jahren entwickelt wurde7,8. Seitdem hat sich die Technik weiterentwickelt, mit nachfolgenden Innovationen zur Verbesserung der Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Quantifizierung der Technik2,9,10,11,12...

Ein western blot (auch bekannt als Immunoblot) ist eine leistungsstarke und grundlegende Technik in einer breiten Palette von wissenschaftlichen und klinischen Disziplinen. Diese Technik wird verwendet, um das Vorhandensein, die relative Häufigkeit, die relative Molekularmasse und posttranslationale Modifikationen von Proteinen1zu untersuchen. In Kombination mit der digitalen Bildanalyse kann diese Methode zuverlässig die Fülle von Proteinen und Proteinmodifikationen analysieren2. Obwohl Western Blot routinemäßig durchgeführt wird, ist es eine zeitaufwändige und arbeitsintensive Methode. Lange Inkubationen des Antikörpers mit Membranen sind erforderlich. Hier beschreiben wir eine Modifikation der Inkubationsmethode, die diese Einschränkung überwindet, ohne die Empfindlichkeit zu opfern.
Während der Inkubation der Membran schwimmen Antikörper in Lösung, während Antigene auf der Membran immobilisiert werden. Aufgrund ihrer hohen Affinität ist die Rate der Antikörperbindung an das Antigen schneller als die Diffusion von Antikörpern aus der Massenlösung zur Membran. Dadurch entsteht eine "Erschöpfungsschicht" mit geringer Konzentration (Abbildung 1). Es kann Stunden dauern, bis weiter entfernte Antikörper die Membran über passive Diffusion erreichen, was der Hauptfaktor für lange Inkubationszeiten in dieser Technik ist. Dieser Effekt wird als Massentransportbegrenzung (MTL)3bezeichnet. Es wurde vorgeschlagen, dass das wiederholte Entleeren und Auffüllen der antikörperhaltigen Lösung die Erschöpfungsschicht stören und MTL4überwinden kann. Hier haben wir eine einzigartige Technik entwickelt, die dieses cyclic Draining and Replenishing (CDR) Konzept implementiert, um die Wirkung von MTL in einem traditionellen westlichen Blotting-Protokoll zu verringern und die erforderliche Inkubationszeit zu verkürzen.
Um die Detektionsempfindlichkeit mit einer kurzen Inkubationszeit aufrechtzuerhalten, haben wir eine Immunreaktionsverbesserungstechnologie verwendet, die die Antigen-Antikörper-Reaktion beschleunigt und dadurch das Signal-Rausch-Verhältnis5verbessert. Viele kommerziell erhältliche Immunreaktions-Verbesserungsmittel (IRE) bestehen aus 2 Komponenten (Lösung 1 und 2, siehe Materialtabelle). Die proprietäre Zusammensetzung oder der Wirkmechanismus von IRE wurde nicht offenbart, aber wir haben zuvor festgestellt, dass IRE die Dissoziationskonstante zwischen Antigen und Antikörper in festen Phasenbindungstests verringerte, was darauf hindeutet, dass eine erhöhte Affinität zumindest teilweise für die verstärkende Wirkung von IRE6verantwortlich ist. Die Kombination von CDR und IRE ergibt ein ultrahochschnelles Western-Blotting-Protokoll, das die gesamte Prozesszeit reduziert, ohne die Empfindlichkeit zu opfern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apollo Transparency Film for Laser Printers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure Imaging System 600</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Azure 600</td>
			<td>Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>NKB-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARNATION Instant Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Carnation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from sheep</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9310V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from donkey</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9340V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYBAID Micro-4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>seracare</td>
			<td>5430-0049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#223; actin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>927-40100</td>
			<td>Blocking Buffer for fluorescent detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OXO Salad Spinner</td>
			<td>OXO</td>
			<td>32480V2B</td>
			<td>Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm Sealing Film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M PM996</td>
			<td>semi-transparent flexible film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepared in a machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-6X His tag antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology

Ein Westlicher Blot (auch als Immunoblot bekannt) ist eine kanonische Methode für die biomedizinische Forschung. Es wird häufig verwendet, um die relative Größe und Fülle von spezifischen Proteinen sowie post-translationale Proteinmodifikationen zu bestimmen. Diese Technik hat eine reiche Geschichte und bleibt in weit verbreiteter Verwendung aufgrund seiner Einfachheit. Das westliche Blotting-Verfahren dauert jedoch bekanntlich Stunden, sogar Tage, mit einem kritischen Engpass, die langen Inkubationszeiten sind, die seinen Durchsatz begrenzen. Diese Inkubationsschritte sind aufgrund der langsamen Diffusion von Antikörpern aus der Bulk-Lösung zu den immobilisierten Antigenen auf der Membran erforderlich: Die Antikörperkonzentration in der Nähe der Membran ist viel niedriger als die Massenkonzentration. Hier präsentieren wir eine Innovation, die diese Inkubationsintervalle drastisch reduziert, indem die Antigenbindung durch zyklisches Ablassen und Auffüllen (CDR) der Antikörperlösung verbessert wird. Wir haben auch eine Immunreaktions-Verbesserungstechnologie verwendet, um die Empfindlichkeit des Assays zu erhalten. Eine Kombination der CDR-Methode mit einem kommerziellen Immunreaktionsmittel steigerte das Ausgangssignal und reduzierte die Inkubationszeit des Antikörpers erheblich. Der resultierende Ultra-High-Speed-Western-Blot kann in 20 Minuten ohne Verlust der Empfindlichkeit erreicht werden. Diese Methode kann auf westliche Flecken angewendet werden, indem sowohl chemilumineszierender als auch fluoreszierender Nachweis verwendet wird. Dieses einfache Protokoll ermöglicht es Forschern, die Analyse der Proteinexpression in vielen Proben besser zu untersuchen.

Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit der CDR-Methode zusammen mit der immunverstärkenden Technologie auf Western Blot. Die statische Inkubation erfolgte auf einem halbtransparenten flexiblen Film, bei dem PVDF-Membranen mit der Antikörperlösung inkubiert wurden, während die CDR-Inkubation in einem Hybridisierungsofen durch rotierende Rohre erfolgte, die die Membranen und die Antikörperlösung enthielten (Movie). Abbildung 2 zeigte Mengen an Antigen und Antikörpern, die für ...

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Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Eine Ultra-High-Speed-Western-Blotting-Technik wird entwickelt, indem die Kinetik der Antigen-Antikörper-Bindung durch zyklische Entwässerungs- und Auffüllungstechnologie (CDR) in Verbindung mit einem Immunreaktions-Verbesserungsmittel verbessert wird.

Ultra-High-Speed Western Blot mit Immunoreaction Enhancing Technology

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

ultra-high-speed-western-blot-using-immunoreaction-enhancing

Research

JoVE Journal

Biochemistry

5.8K Aufrufe.  National Institutes of Health. Eine Ultra-High-Speed-Western-Blotting-Technik wird entwickelt, indem die Kinetik der Antigen-Antikörper-Bindung durch zyklische Entwässerungs- und Auffüllungstechnologie (CDR) in Verbindung mit einem Immunreaktions-Verbesserungsmittel verbessert wird.

Serie: Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western blotting protocol was optimized and suitable for the analysis of small numbers of HSCs (500 - 15,000 cells). Phenotypic HSCs were purified, accurately counted, and directly lysed in Laemmli sample buffer. Lysates containing equal numbers of cells were analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the blot was prepared and processed following standard Western blotting protocols. Using this protocol, 2,000 - 5,000 HSCs can be routinely analyzed, and in some cases data can be obtained from as few as 500 cells, compared to the 20,000 to 40,000 cells reported in most publications. This protocol should be generally applicable to other hematopoietic cells, and enables the routine analysis of small numbers of cells using standard laboratory procedures.

A standard Western blotting protocol was optimized for analyzing as few as 500 hematopoietic stem or progenitor cells. Optimization involves careful handling of the cell sample, limiting transfers between tubes, and directly lysing the cells in Laemmli sample buffer.

Ein Western-Blot-Protokoll für eine kleine Zahl von Hämatopoetischen Stammzellen

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and tissue level significantly hampers the progress in proteomic research. Results derived from currently available immunoblot techniques are also relative, preventing any efforts to combine independent studies with a large-scale analysis of protein samples. In this study, we demonstrate the process of quantitative dot blot analysis (QDB) to achieve absolute quantification in a high throughput format. Using a commercially available protein standard, we are able to determine the absolute content of capping actin protein, gelsolin-like (CAPG) in protein samples prepared from three different mouse tissues (kidney, spleen, and prostate) together with a detailed explanation of the experimental details. We propose the QDB analysis as a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method of absolute quantification of individual proteins at the cellular and tissue level. This method will substantially aid biomarker validation and pathway verification in various areas of biological and biomedical research.

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Here we demonstrate a detailed process of quantitative dot blot analysis (QDB) by determining the absolute content of a targeted protein, capping actin protein, gelsolin-like (CAPG), in three different mouse tissues. We demonstrate a high throughput, convenient, quantitative immunoblot technique for biomarker validation at the cellular and tissue level.

Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal transduction, metabolism, and development. These metabolites perform this regulatory activity by binding to proteins, thereby changing protein conformation, catalytic activity, and/or interactions. The method described here uses affinity chromatography coupled to mass spectrometry or Western blotting to identify proteins that interact with inositol phosphates or phosphoinositides. Inositol phosphates or phosphoinositides are chemically tagged with biotin, which is then captured via streptavidin conjugated to agarose or magnetic beads. Proteins are isolated by their affinity of binding to the metabolite, then eluted and identified by mass spectrometry or Western blotting. The method has a simple workflow that is sensitive, non-radioactive, liposome-free, and customizable, supporting the analysis of protein and metabolite interaction with precision. This approach can be used in label-free or in amino acid-labelled quantitative mass spectrometry methods to identify protein-metabolite interactions in complex biological samples or using purified proteins. This protocol is optimized for the analysis of proteins from Trypanosoma brucei, but it can be adapted to related protozoan parasites, yeast or mammalian cells.

This protocol focuses on the identification of proteins that bind to inositol phosphates or phosphoinositides. It uses affinity chromatography with biotinylated inositol phosphates or phosphoinositides that are immobilized via streptavidin to agarose or magnetic beads. Inositol phosphate or phosphoinositide binding proteins are identified by Western blotting or mass spectrometry.

Identifizierung von Inositolphosphat oder Phosphoinositid-Wechselwirkungsproteinen durch Affinitätschromatographie gekoppelt an Western Blot oder Massenspektrometrie

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. Biomolecules such as proteins, carbohydrates, vitamins, fatty acids, nucleic acids, and enzymes are fundamental building blocks of living beings; they assemble into complex networks in biosystems to synchronize a myriad of life events. Proteins typically utilize complex interactome networks to carry out their functions; hence it is mandatory to evaluate such interactions to unravel their importance in cells at both cellular and organism levels. Toward this goal, we introduce a rapidly emerging technology, field-effect biosensing (FEB), to determine specific biomolecular interactions. FEB is a benchtop, label-free, and reliable biomolecular detection technique to determine specific interactions and uses high-quality electronic-based biosensors. The FEB technology can monitor interactions in the nanomolar range due to the biocompatible nanomaterials used on its biosensor surface. As a proof of concept, the protein-protein interaction (PPI) between heat shock protein 90 (Hsp90) and cell division cycle 37 (Cdc37) was elucidated. Hsp90 is an ATP-dependent molecular chaperone that plays an essential role in the folding, stability, maturation, and quality control of many proteins, thereby regulating multiple vital cellular functions. Cdc37 is regarded as a protein kinase-specific molecular chaperone, as it specifically recognizes and recruits protein kinases to Hsp90 to regulate their downstream signal transduction pathways. As such, Cdc37 is considered a co-chaperone of Hsp90. The chaperone-kinase pathway (Hsp90/Cdc37 complex) is hyper-activated in multiple malignancies promoting cellular growth; therefore, it is a potential target for cancer therapy. The present study demonstrates the efficiency of FEB technology using the Hsp90/Cdc37 model system. FEB detected a strong PPI between the two proteins (KD values of 0.014 &#181;M, 0.053 &#181;M, and 0.072 &#181;M in three independent experiments). In summary, FEB is a label-free and cost-effective PPI detection platform, which offers fast and accurate measurements.

Field-effect biosensing (FEB) is a label-free technique for detecting biomolecular interactions. It measures the electric current through the graphene biosensor to which the binding targets are immobilized. The FEB technology was used to evaluate biomolecular interactions between Hsp90 and Cdc37 and a strong interaction between the two proteins was detected.

Erforschung der biomolekularen Interaktion zwischen dem molekularen Chaperon Hsp90 und seiner Client-Proteinkinase Cdc37 unter Verwendung der Feldeffekt-Biosensortechnologie

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers of multi-layered samples. This removal of layers prior to plunge freezing can aid in reducing sample thickness to a level suitable for cryo-EM data collection, improving sample flatness, and facilitating image processing. The peel-blot technique allows for the separation of multilamellar membranes into single layers, of layered 2D crystals into individual crystals, and of stacked, sheet-like structures of soluble proteins to likewise be separated into single layers. The high sample thickness of these types of samples frequently poses insurmountable problems for cryo-EM data collection and cryo-EM image processing, especially when the microscope stage must be tilted for data collection. Furthermore, grids of high concentrations of any of these samples can be prepared for efficient data collection since sample concentration prior to grid preparation can be increased and the peel-blot technique adjusted to result in a dense distribution of single-layered specimen.

The peel-blot technique is a cryo-EM grid preparation method that allows for the separation of multilayered and concentrated biological samples into single layers to reduce thickness, increase sample concentration, and facilitate image processing.

Die Peel-Blot-Technik: Eine Kryo-EM-Probenvorbereitungsmethode zur Trennung einzelner Schichten von mehrschichtigen oder konzentrierten biologischen Proben

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively in the neuron and is essential for the proper functioning of Cl- homeostasis and consequently functional GABAergic inhibition. Failure in proper regulation of KCC2 is deleterious and has been associated with the prevalence of several neurological diseases, including epilepsy. There has been considerable progress with regard to understanding the mechanisms involved in the regulation of KCC2, accredited to the development of techniques that enable researchers to study its functions and activities; either via direct (assessing kinase regulatory sites phosphorylation) or indirect (observing and monitoring GABA activity) investigations. Here, the protocol highlights how to investigate KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites - Thr906 and Thr1007- using western blotting technique. There are other classic methods used to directly measure KCC2 activity, such as rubidium ion and thallium ion uptake assay. Further techniques such as patch-clamp-electrophysiology are used to measure GABA activity; hence, indirectly reflecting activated and/or inactivated KCC2 as informed by the assessment of intracellular chloride ion homeostasis. A few of these additional techniques will be briefly discussed in this manuscript.

The present protocol highlights the application of western blotting technique to study the functions and activities of neuronal K-Cl co-transporter KCC2. The protocol describes the investigation of KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites Thr906/1007 via western blotting. Also, additional methods to confirm KCC2 activity are briefly highlighted in this text.

Untersuchung der Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 mittels Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...