Bu çalışma, Sağlık ve George E. Hewitt Vakfı burs (AP) National Institutes of hibe ile desteklendi.

Jel elektroforezi Teknik not: işlemine başlamadan önce, protein örneklerinin hazır olması. Bu ilk adım sırasında, örnek proteinler denatüre poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) kullanarak molekül ağırlığına göre ayrılır. Protein örneği, 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;de ısıtılmış edildikten sonra Lityum Dodesil Sülfat (LDS) yüklü NuPAGE ® LDS örnek denatüre bir devlet arabellek polipeptidlerin korur . Güçlü indirgeyici ajan, ikincil ve üçüncül yapısı (DTT), disülfür bağları kırmak için kaldırmak için birlikte kullanılır. Buna ek olarak, örnek proteinleri negatif yüklü LDS kaplı hale gelir ve bu nedenle jel akrilamid örgü ile pozitif yüklü elektrot doğru hareket ettirin. Bu moleküler ağırlığı (kilo Dalton, kDa ölçülen) göre ayrılması sağlar. Numune hazırlama ve PAGE işlemi için detaylı adım adım protokolleri Invitrogen web sitesi 2 ya da NuPAGE teknik kılavuzu 3 olabilir Teknik ipuçları <ol><li> I) acrylamid jel konsantrasyonu (alt daha iyi çözünürlük ile sonuçlanan daha fazla akrilamid konsantrasyonu ile Invitrogen NuPAGE Bis-Tris süreksiz tampon sistemi, protein ve jel sonraki ayırma aralığı elektroforetik mobilite iki faktöre bağlıdır. molekül ağırlıklı proteinlerin) ve ii) çalışan tampon, MOPS veya MES sondaki iyon. Size ulaşmak istediğiniz ayırma aralığı için uygun kombinasyonu seçmek için, Jel Göç grafik 1 bakın. , Kuyu jel sayısı ve kalınlığı, hacim ve miktar sırasıyla, yük planı örnekleri bağlıdır. </li><li> Kuyulara jel örnekleri yüklediğinizde, en az bir şerit bir moleküler ağırlık marker (veya merdiven) ayrılmıştır. Bu protein standartları Birçok şirket ticari olarak mevcuttur ve genellikle göç takip için izin görünür bantlar oluşturacak şekilde tanımlı molekül ağırlıkları olan lekeli proteinlerin karışımından oluşur. Molekül ağırlıkları jel çözünürlüğü ile uyumlu bir dizi seçin. </li><li> Güzel ve hatta göç desen elde etmek için benzer bir örnek veya 1X LDS örnek tampon hacmi ile jel TÜM kuyu yükleme öneririz. </li></ol> Transfer Teknik Not: transferi adım başlamadan önce, transfer tamponu (% 10 metanol ile 1X) ve soğuk bir odaya 4 ° C ön-cool hazırlar. Proteinler antikor tespiti için erişilebilir hale getirmek için, onlar bir nitroselüloz membran üzerine jel electroblotting aktarılır. Protein bağlanma membran ve protein arasındaki hidrofobik etkileşimler, yanı sıra şarj etkileşimler üzerine kuruludur. (Poliviniliden florid (PVDF) membran de alternatif olarak kullanılabilir. Bu durumda, PVDF membran, metanol içinde kullanmadan önce en az 30 saniye öncesi ıslak olması gerekir.) Laboratuvar Invitrogen XCell II ile donatılmış olup olmadığını Bio-Rad Mini Trans-Blot Elektroforetik Transferi Hücre, ya da referanslar 2-3 transfer prosedürü ayrıntılı bir adım-adım protokolü referans 4 bulunabilir ™ Modül Blot. Bu sürecin bir sonucu olarak, proteinlerin ince bir yüzey tabakasının maruz kalan ve algılama için hazır. Protein jel membran transferi bütünlüğü ve genel etkinliği, geri dönüşümlü Ponceau G boya membran boyama ile kontrol edilebilir. Ponceau G boyama işlemi (isteğe bağlı): <ol><li> Proteinler aktardıktan sonra, bir kuluçka tepsi membran (proteinler yukarı bakacak şekilde) yerleştirin. </li><li> Membran kapak ve yavaşça sallanarak ile en az 30 saniye inkübe yeterli Ponceau G Boyama ekleyin. </li><li> Arka plan netleşene kadar, saf su ile membran durulayın. </li><li> 2-3 dakika distile su ile çalışan membran Destain. </li><li> Engelleme çözümü membran (aşağıya bakın) yerleştirin. </li></ol> Teknik ipuçları: <ol><li> Biz proteinler maruz edildiği örneklerin yan ve yönünü belirtmek için protein aktarmadan önce bir kalem ile membran etiketleme tavsiye ederiz. </li><li> Ponceau S boyama ve molekül ağırlığı belirteçleri Her iki farklı antikorları ile ortaya çıkan parçalar problama için transferinden sonra membran kesmek için kullanılan olabilir </li></ol> İmmuno: Teknik Not: Bu İmmuno işlem sadece bir kılavuz olarak verilmiştir. Optimizasyon her karınca için gerekli olabiliribody özel bilgiler piyasada bulunan antikorların çoğu veri-yaprak (örneğin, çalışma seyreltme, kuluçka süresi, vb.) bulunabilir. Hedef protein bu son işlemi sırasında, belirli bir antikor kullanarak tespit edecek ve film bir grup olarak görünecektir. Grubun yoğunluğu hedef protein mevcut miktarına bağlıdır ise grubun konumu, hedef proteinin moleküler ağırlığı bağlıdır. Tipik olarak, bu üç substeps sonra sağlanır: <ol><li> Engelleme: membran (zarının üzerinde yer alan aşırı alan bir çözelti genel bir protein ile kaplıdır) ile non-spesifik antikor etkileşimleri önlemek için. </li><li> Problama ilgi protein belirli bir tarafından tespit <a title="Primer antikor" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">birincil antikor</a> . Ilişkisiz primer antikor yıkanıp sonra, membran muhabiri ile bağlantılı farklı bir antikor maruz <a title="Enzim" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">enzim</a> , <a title="Horseradish peroksidaz" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">horseradish peroksidaz</a> (HRP). Bu ikincil primer antikor türlerinin belirli bir bölümünü (örneğin bir anti-tavşan ikincil antikor herhangi bir tavşan kaynaklı primer antikor bağlamak) karşı antikor yönlendirilir. </li><li> Algılama: Bir kemilüminesan ajan ikincil antikor HRP maruz kaldığında luminesce bir substrat olarak kullanılır. Bu reaksiyon ve probed protein miktarı ile orantılı olarak lüminesans üretir. Işık, daha sonra fotoğraf filmi tarafından tespit edilir. </li></ol> Genel bir adım-adım prosedürü aşağıda verilmiştir. Diğer ayrıntılı yordamlar ECL Plus, Western Blot Tayin Reaktifleri kullanım kılavuzu 5 ya da data-sheet en piyasada bulunan antikorlar ile birlikte bulunabilir. İnkübasyon süresi, antikor seyreltme, ve engelleme ve yıkama çözümleri ampirik olarak her bir antikor için optimize olması. İmmuno prosedürü: <ol><li> Tüm membran kapak PBS% 1 kazein engelleme çözümü yeterli hacimde kuluçka tarafından non-spesifik bağlanma engelleyin. Oda sıcaklığında en az 30 dakika süreyle bir rocker yerleştirin ya da geceleme 4 ° C </li><li> Membran birincil antikor (faiz protein için özel) ile inkübe edin. Primer antikor çözümü engelleme seyreltilmelidir. En antikorlar için, tam bağlama yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında 1-2 saat inkübasyondan sonra elde edilir. Alternatif olarak, sinyal gürültü oranı artırmak ° C inkübasyon adımı 4 gece gerçekleştirilen olabilir. </li><li> Solüsyonu (4 ° C ile -20 ° C tekrar tekrar kullanım için atmayın veya tutmak) çıkarın ve membran hızlı bir kez yıkayın. Daha sonra PBS ile 3x10 dakika iyice sallanarak oda sıcaklığında% 0.05 Tween 20 (PBST). </li><li> Membran çözümü engelleme seyreltilmiş bir HRP-coupled ikincil antikor ile inkübe edin. Primer antikor büyüdü türlerin IgG kısmı tanıyan bir antikor seçin. Inkübasyon yavaşça sallanarak altında oda sıcaklığında 1 saat süreyle yapılır. </li><li> Çözüm atın ve membran hızlı bir kez yıkayın. Sonra iyice sallanarak oda sıcaklığında PBST ile 3x10 dakika. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre kemilüminesan algılama geçin. Biz GE Healthcare (özel talimatlar için bkz: 5 referans) ECL Plus Western Blot Tayin Reaktifleri kullanın. </li><li> Saran wrap membran ya da bir otoradyografi kaset içine bir torba ve yer yerleştirin. Herhangi bir aşırı sıvı boşaltma ve tüm hava kabarcıkları kaldırmak için emin olun. </li><li> Karanlık bir odada membran fotoğraf filmi Açığa. 1 dakika maruz kalma süresi ile başlayın ve istenilen sinyal yoğunluğuna göre ayarlamak. </li></ol> Teknik ipuçları: <ol><li> , Non-spesifik bağlayıcı Engelleme bir protein çözelti membran koyarak elde edilir. Biz genellikle% 1 kazein, ancak <a title="Sığır serum albumini" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">sığır serum albumin</a> (~% 2 BSA) bir alternatif olarak kullanılabilir veya yağsız kuru süt (~% 5). </li><li> Tris-Tamponlu Salin (TBS), PBS yerine işlem boyunca kullanılabilir. Phosphospecific antikor ile membran prob planlıyorsanız TBS kullanmanızı öneririz. </li><li> Glow-in-the-koyu, otoradyografi kaset alt dokundunuz etiket (örneğin, Stratagene Glogos ® II Autorad Belirteçler) analiz adımı sırasında film ve sizin membran hizalamak için yardımcı olacaktır. </li></ol> Analiz Filmin maruz Şimdi, pratik açıdan değil, Batılıların bir güzel tek bir grup olarak protein ortaya koyduğunu fark edeceksiniz. Additional bantları da non-spesifik primer ve sekonder antikor bağlanma nedeniyle görünebilir. Bu arka plan sinyali İmmuno prosedürünü optimize ederek azaltılabilir. Buna ek olarak, uygun bir kontrol (örneğin, untransfected hücreleri, siRNA-tedavili hücrelerde, vb.) Antikor özgüllüğü ve membran hedef protein tam yerini belirlemek için faydalı olacaktır. Film membran lekeli standart protein bantları pozisyonu işaretlendikten sonra, her molekül ağırlığı günlük arsa bunlara karşılık gelen bağıl hareketlilik (x-ekseni) karşı protein standartları (y-ekseni). Bağıl hareketlilik (Rf) (jel ön) taşındı, protein uzaktan izleme boya veya düşük molekül ağırlıklı işaretleyici göre orijin noktası (jel üst) taşındı mesafe oranı için kullanılan bir terimdir . Regresyon hattının eğimi ve y kesişim noktası değerlerini elde etmek için standart eğri belirleyin. Hedef protein bilinmeyen molekül ağırlığı (boyut), Rf ve aşağıdaki denklemi kullanarak tahmin edilmektedir: log molekül ağırlığı = (eğim) (hedef protein hareketlilik veya Rf) + y kesişim (Ayrıntılı talimatlar için referans 6&#39;ya bakınız). İfade seviye yaklaşımları hedef proteinin yapısal bir protein (örneğin, tubulin veya aktin) ya da bu tür GAPDH gibi bir housekeeping gen ürünü bu grubun yoğunluğunu karşılaştırarak alınır. Bu sözde &quot;yükleme kontrolü&quot; örnekleri arasında değişmez ve belirli bir birincil antikor ile ortaya çıkar. Görüntü daha da göreli miktarda protein boyama, optik yoğunluk açısından sonuçları değerlendirmek ve ölçmek için dansitometrisi tarafından analiz edilebilir.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Migration+chart:+.">Gel Migration chart: .</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website.">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuPAGE+technical+guide.">NuPAGE technical guide.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+Manual,+Mini+Trans-Blot+Cell.">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction.">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis,+GE+Healthcare+Website.">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , .</li><li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai.">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li><li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3.">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li><li>Penna, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , .</li></ol>

Burada sunulan prosedür MES denatüre SAYFA Invitrogen NuPAGE Novex elektroforez sistemi kullanarak bir örnek olarak tampon çalışan bir Bis-Tris jel kullanıyor. Buna ek olarak, bu prekast jel sistemi denatüre veya non-denatüre koşullarının yanı sıra altında protein ayrılmasına izin molekül ağırlıkları geniş bir yelpazede (1-200 kDa Bis-Tris jeller için 36-400 kDa Tris-uygun Asetat jeller). Denemenizi bağlı olarak, burada açıklanan batı blot tekniği sadece bir bölümünü doğrudan jel boyama işlemleri (örneğ...

western blotting using the invitrogen nupage novex bis tris minigels

Western Blot (veya immün) araştırmacılar, bir proteinin ifade doğrulamak için izin veren bir standart laboratuvar prosedürü, farklı örnekleri protein mevcut bağıl miktarını belirlemek ve co-immunoprecipitation deneylerin sonuçlarını analiz. Bu yöntemde, bir hedef protein, doku homojenatından ya da özü belirli bir örnek belirli bir birincil antikor ile tespit edilir. SDS-PAGE denatüre kullanarak molekül ağırlığına göre protein ayırma sağlanır. Bir zar transferinden sonra, hedef protein belirli bir primer antikor ile probed ve kemilüminesans tarafından algılanır. Western-blot tekniği ilk açıklamasını bu yana, prekast jeller ve kullanıcı dostu donanımları dahil olmak üzere çeşitli gelişmeler, uğramıştır. Laboratuvarımızda, Invitrogen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez sistemi kullanmayı tercih var. Bu yenilikçi bir nötr pH, süreksiz SDS-PAGE, prekast mini-jel sistem. 8 ay ile 1 yıl arasında değişen pre-cast jeller daha uzun bir raf ömrü i) ii) 1 ile 400 kDa molekül ağırlıkları geniş bir ayırma aralığı türüne bağlı olarak: Bu sistem de dahil olmak üzere, geleneksel Laemmli tekniği üzerinde birçok avantaj sunar jel kullanılır;) ve iii çok yönlülük (akrilamid yüzdesi, jel tipi ve çalışan tamponun iyonik bileşimi aralık). Bu video makalede açıklanan prosedür Invitrogen NuPAGE elektroforez sistemi kullanarak bir western-blot gerçekleştirmek için nasıl bir örnek olarak,% 4-12 Bis-Tris degrade jeller ve MES tampon çalışan Bis-Tris süreksiz tampon sistemi kullanır. Laboratuvarımızda, biz bu batı-blot yöntemi kullanılarak çeşitli biyokimyasal uygulamalar için iyi ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels at JoVE.com

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Bu teknik makale Invitrogen gelen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez Mini Jel sistemi kullanarak standart bir western-blot prosedürü açıklamaktadır.

Batı Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels kullanarak Blot

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

western-blotting-using-the-invitrogen-nupage-novex-bis-tris-minigels

Research

JoVE Journal

Biology

36.9K Görüntüleme.  University of California, Irvine (UCI). Bu teknik makale Invitrogen gelen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez Mini Jel sistemi kullanarak standart bir western-blot prosedürü açıklamaktadır.

Video: Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

Endolenfatik Kanal obliterasyonu endolenfatik hidrops Cerrahi İndüksiyon

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Biyoloji

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Bir Fonksiyonlu Bis-Peptid Katı Faz Sentezi Metodolojisi &quot;Güvenlik&quot; Catch Kullanımı

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize&#39;a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black box&#34; because an experimentalist does not know if it has been performed successfully until the last of several steps. Moreover, the quality of western blot data is sometimes challenged due to a lack of effective quality control tools in place throughout the western blotting process. Here we describe the V3 western workflow, which applies stain-free technology to address the major concerns associated with the traditional western blot protocol. This workflow allows researchers: 1) to run a gel in about 20-30 min; 2) to visualize sample separation quality within 5 min after the gel run; 3) to transfer proteins in 3-10 min; 4) to verify transfer efficiency quantitatively; and most importantly 5) to validate changes in the level of the protein of interest using total protein loading control. This novel approach eliminates the need of stripping and reprobing the blot for housekeeping proteins such as &#946;-actin, &#946;-tubulin, GAPDH, etc. The V3 stain-free workflow makes the western blot process faster, transparent, more quantitative&#160;and reliable.

V3 workflow is a western blot procedure using stain-free gels. The stain-free technology allows researchers to visualize protein separation quality, to verify the transfer efficiency, and most importantly, to validate the change in the protein of interest using total protein quantification as a reliable loading control.

Batı Blotting'de Pratik, Kullanışlı ve Güvenilir Toplam Protein Yükleme Kontrolü için V3 Lekesiz İş Akışı

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

Town Batı Hızlı: Klasik Western Blot Analizi Üzerine Bir Çağdaş Büküm

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Sorun Giderme Stratejileri Modern Kantitatif Floresan Western Blot A Guide

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Dalga boyundaki ve Oksidatif Stres Kırmızı / yakın-kızılötesi ışık Terapisi şiddetler bir Range Etkilerinin Değerlendirilmesi için Yöntemi<em&gt; İn Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...