Bu protokol, kuş üremeslerindeki fizyolojik rollerinin daha fazla araştırılması için kuş yumurtalarından perivitelline membran sublayerlerini örneklemek için adım adım bir prosedür sağlar. Perivitelline membranının örneklemesi, yapısal ve moleküler hasarları sınırlamak için her adımda optimize edilmiştir. Protokol derinlemesine proteomik için daha da geliştirilmiştir.
Perivitelline tabakasını veya PL'yi taze döşenmiş bir unfertilize yumurtadan örnekleyerek başlayın. Yumurtayı kırın ve yumurta sarısını beyazdan ayırmak için bir yumurta ayırıcı kullanın. Chalazae'yi küçük makasla çıkarın ve şeffaf ama görünür bir yapı olarak görünen yapışık albüminleri çıkarmak için sarısını bir filtre kağıdının üzerine yuvarlayın.
Sarısını daha önce dört santigrat dereceye kadar soğutulmuş pH sekizde 10 milimolar Tris HCL içeren bir kristalizeye batırın ve künt makas kullanarak bir santimetrelik bir bölge içindeki germinal diskin üzerindeki PL alanını çıkarın. PL'yi tamponun içindeki küçük makasla yırtın, ardından yırtılan PL'nin iki kenarını asalarla tutun ve yumurta sarısını soyun. PL'yi 10 milimolar Tris HCL'lik banyolarda yumurta sarısı izine rastlanana kadar birkaç kez durulayın.
PL'nin temiz, beyaz ve tamponda yüzdür olduğundan emin olun. Alt katman ayırma için PL'yi işleyin veya doğrudan biyokimyasal analizlere geçin. OPL ve IPL'yi ayırmak için, tüm numuneyi 10 milimolar Tris HCL ve 50 milimolar sodyum klorürle dolu plastik bir Petri kabına bakan OPL ile yayın ve mümkün olduğunca az kırışıklıkla düz bir şekilde koruyun.
Yalnızca OPL'ye bağlı kalan chalazae'nin konumunu belirleyin. Daha sonra tüm PL'i küçük makasla yaklaşık ikiye üç santimetrelik parçalar halinde kesin. İki katmanı, bir diseksiyon mikroskobu altında ultra hassas uçlu apselerle mekanik olarak ayırın.
Elde eden IPL ve OPL örneklerini bir sonraki kullanıma kadar mikro tüplerde negatif 80 santigrat derecede ayrı ayrı saklayın. Birincil protein çözünürlüğünü gerçekleştirmek için, kalan suyu çıkarmak için IPL ve OPL örneklerini ayrı ayrı dondurun, ardından her numuneden yaklaşık bir miligram kesin ve sızıntıya dayanıklı bir vida kapağı ile temiz bir mikro tüpün içine yerleştirin. Kalan numuneleri eksi 20 veya negatif 80 santigrat derecede uzun süreli depolama için sıkıca kapalı tüplerde tutun.
Her bir liyofilize sublayer'ın bir miligramını pH yedi ve 500 milimolar sodyum klorürde 400 mikrolitre 50 milimolar Tris ile karıştırın. Yapıları mikro parçacıklara parçalamak ve protein çözünürlüğünü kolaylaştırmak için 30 Hertz'de beş dakika boyunca iki kez bir mikser değirmeni kullanın. Numunelerin 400 mikrolitresini iki temiz mikro tüp halinde toplayın.
Numuneleri elektroforez için hazırlamak için, her 400 mikroliter numunesine 5X SDS-PAGE numune tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca 100 santigrat dereceye ısıtın. %4-20 gradyan SDS poliakrilamid jelin her şeridine en fazla 20 mikrogram protein yükleyin ve 120 voltta elektroforezi gerçekleştirin. Elektroforezden sonra, jeli cam plakalardan çıkarın ve 30 dakika boyunca Coomassie Brilliant Blue çözeltisi ile lekeleyin, ardından jel arka planı açık mavi görünene kadar% 50 su,% 40 etanol ve% 10 asetik asitten oluşan bir çözelti ile lekeyi kaldırın.
Jeli, leke çözme ve yeniden nemlendirme için deiyonize su içeren bir Petri kabına aktarın. Proteinler şeffaf bir arka plana sahip mavi bantlar olarak görünmelidir. PL, minimum protein kaybına ve optimum alt katman ayrımına izin vermek için çeşitli tamponlara maruz kaldı.
Çeşitli Tris konsantrasyonlarında, pH ve sodyum klorür konsantrasyonlarında salınan protein burada gösterilmiştir. Ortaya çıkan iki alt katman diseksiyon mikroskobu altında gözlendi. IPL yarı saydamken, OPL yoğun, bulutlu ve beyazımsıdır.
Ayırmadan sonra, OPL ve IPL bağımsız olarak liyofilize edildi ve protein içerikleri mekanik taşlama, anionik deterjan, azaltıcı madde ve kaynama kombinasyonu kullanılarak tamamen çözüldü. Örnekler bir poliakrilamid jel üzerinde farklı elektroforetik profiller sergiledi. Bu protokolü denerken, alt katmanların ayrılmasının prosedürün kritik bir adımı olduğunu ve minimum tuz konsantrasyonu içeren bir arabellekte dürbün mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.
İlgili fizyolojik fonksiyonlarını daha da aydınlatmak için perivitelline membran sublayer örnekleri elektronik mikroskopi kullanılarak histolojik karakterizasyon ve görüntüleme tahlilleri ve hücre göçü kullanılarak fonksiyonel çalışmalar için analiz edilebilir.
