Bu yöntem, fare bilateral kortikal bölgelerde nöral aktivitenin uzun bir süre in vivo için kaydedilmesini ve sayısallaştırılmasını sağlar. İki foton tekniği uzun bir süre boyunca büyük veya dağınık nöronal popülasyonda aynı anda aktivite tespit avantajı vardır. Bu tekniğin etkileri yaşayan beynin farklı bölgelerinde tanımlanmış nöronal popülasyonlarda aktivite kalıplarının araştırılması doğru genişletilmiş.
İşleme başlamadan 12 saat önce optik pencereleri %70 etanolle 50 derecede ısıtın. Optik pencere yuvarlak beş milimetre çapında üst kapak cam ve yuvarlak üç milimetre çapında kapak cam içeren bir alt kısmı oluşur. Isınma kuluçka sonunda, anestezi 20-25 gram 1 1/2 için 2 1/2 aylık Thy1 GCaMP6s fare ayak ucutu yanıt eksikliği onaylamak ve hayvanın gözlerine merhem uygulayın.
Fareyi steril bir perdeyle kaplı bir ısıtma yastığına yerleştirin ve farelerin başını sabitlemesi için baş tutucu bir adaptör kullanın. Kafa derisinin çoğunu çift kenarlı bir jiletle tıraş edin ve maruz kalan cildi sıralı steril alkol hazırlama pedleri ve povidon-iyot solüsyonu scrubs ile temizleyin. Sonra kafatasının sağ tarafında kafa derisi bir dikdörtgen iki üç milimetre kesilmiş yapmak için bir makas kullanın.
Pamuklu bir bez kullanarak, çapı üç milimetreden daha büyük bir pozlama alanı oluşturmak için bir kenara deri itin ve yavaşça kafatasına bağlı bağ dokusu kaldırmak için künt bir mikrocerrahi bıçak kullanın. Bir diş matkap ile, yavaşça S1 alanı etrafında üç milimetre çapında daire işaretleyin. Kafatasının sol tarafında benzer bir daire yaptıktan sonra, bir diş çimentosu uygulaması için bir temel sağlamak için kemiğin her iki tarafına siyanoakrilat superglue ince bir tabaka uygulayın.
Bir diseksiyon mikroskobu altında, yumuşak bir kenar oluşturmak için Kafatasının sağ tarafında dairesel bir oluk inceltmek için yüksek hızlı bir mikro matkap kullanın, gerektiği gibi bir vakum ile kemik enkaz aspire. Yaklaşık 2/3 kemik derinliği elde edildikten sonra, dairesel bir kemik flebi çevredeki kafatasından tamamen serbest bırakılına kadar kemiğin kalan 1/3'ü yavaşça ve dikkatlice inceltin. Durayı ortaya çıkarmak için dairesel kemik parçasını yavaşça ve dikkatlice çıkarmak için 5/45'lik bir çift forceps kullanın ve pial damarlara zarar vermemeye özen gösterin.
Aynı şekilde kafatasının sol tarafında bir kemik flep çıkardıktan sonra, steril salin ile kafatasının sağ tarafı için optik pencere durulayın ve stereo mikroskop altında kusurları kontrol edin. Kafatası ve craniotomized açılış içinde alt kısmı üzerinde duran pencerenin üst kısmı ile craniotomi bölgesi üzerinde optik pencere yükleyin, dura üzerinde istirahat, beyin omurilik sıvısı varlığında. Kafatası için optik pencere kenarının üst kısmını mühürlemek için siyanoakrilat superglue kullanın.
Tutkal kuruduğunda, cam kenarına siyah diş çimentosu uygulayın, maruz kafatasının sağ tarafının geri kalanı, ve ışık engellemek için yara marjları. Sonra sol optik pencereyi yükleyin ve hayvan tam recumbency kadar izleme ile kurtarmak için izin verin. İşlemden 7 ila 10 gün sonra, anestezialtındaki hayvanı iki foton mikroskobun altında bir ısıtma yastığı üzerinde baş tutma adaptörüne yerleştirin ve optik pencerenin ve kafatasının sağ tarafının mikroskopun optik eksenine dik olarak yönlendirilmelerine dikkat edin.
Dört kat büyütmede parlak alan aydınlatması kullanarak kafatası penceresinin ilk referans haritası görüntüsünü elde edin. Aynı ilgi alanının birden fazla görüntüsünü aldıktan sonra, sol yarımküredeki S1 bölgesindeki kalsiyum dinamiklerini görüntüleyin ve kafatasının her iki tarafındaki her bir ilgi bölgesinden floresan değişiklikleri hesaplayın. Bu temsili görüntülerde, egfp ifade eden bir fare nin içindeki dendritler ve bir kan damarı optik pencerenin kurulmasından bir gün sonra S1 bölgesinin ikinci katmanında farklı derinliklerde görselleştirildi.
Z-projeksiyon görüntüleri optik pencere implantasyonundan sonra birinci ve yedinci günlerde çekildi, bu da deneysel dönemde dendritik dalların ve dikenlerin son derece kararlı bir sayı ve yerini gösterdi. Thy1 GCaMP6s transgenik farelerde hücre içi kalsiyum geçici ölçümü, pia'nın 500 mikrometre altında bulunan spontan kalsiyum aktivitesi ve tabaka beş piramidal nöronların popülasyonlarının sayısallaştırılmasına ve zaman içinde ortalama spontan yanıt sayısının hesaplanmasına olanak sağlar. Hem kafatası penceresi hazırlama hem de in vivo iki foton lu kalsiyum görüntüleme teknikleri konusunda eğitilmiş bir araştırmacı, kafatasının her iki tarafında ki 100 ila 200 nöronun kayıtlarını günde bir ila iki hayvanda elde edebilmelidir.
Kafatasının her iki tarafında açık bir optik pencere ile, yöntem in vivo uzun süreli ve istikrarlı kalsiyum görüntüleme için simetrik memeli beyin bölgeleri arasında nöral aktivitenin kaydedilmesini sağlar. Bu yöntem aynı zamanda periferik veya merkezi sinir sistemi tek taraflı yaralanma sonrası kortikal aktivite ve plastisite çalışma için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, Thy1 GCaMP6s transgenik farelerde iki foton mikroskobu kullanarak kalsiyum dinamiklerini ölçmek için ikili kranial pencerelerin nasıl yerleştirilebildiğini iyi anlamalısınız.
