Yazarlar kendi laboratuvarında filme sürecinde verdiği destekten ötürü profesörü Paul Kos ve LMPH, Antwerp Üniversitesi, Belçika teşekkür ederim. Bu çalışma Finlandiya projeleri Akademisi (272266 ve 282981 projeleri) ve Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlandiya tarafından finanse edildi. Yüksek Lisans Janni Kujala teknik katkıları kabul edilmektedir.

1. Bakteriler Büyüyen <ol><li> Ön-kültür, 220 rpm&#39;de (16-18 saat) çalkalanarak 37 ° C&#39;de bir triptik soya suyu (TSB) içinde, bir gece boyunca bakteri. </li><li> Taze TSB içinde (burada 1000 kat S. aureus için kullanılan bakteri büyüme oranına bağlı olarak) ve (o üstel büyüme ulaşmak için 37 ° C&#39;de ve 200 rpm&#39;de büyümesi optik izin ön kültür 100-1,000 kez seyreltilir 0.2 ve 0.6) arasında 595 nm (OD 595) yoğunluk. NOT: Bu adım suş spesifik optimizasyon gerektirir. </li></ol> 2. Biyofilm Oluşumu: Öncesi ve Sonrası pozlama <ol><li> (Bu mililitre başına yaklaşık 10 6 koloni oluşturan birim (CFU / ml) eşit) katlanarak büyüyen kültürün 100 kez seyreltilir. </li><li> Ön poz protokolü <ol><li> muamele edilmemiş kontrol örnekleri için, steril bir 96 mikro tepsinin bölmesi başına seyreltilmiş bakteri kültürü 200 ul ekle. </li><li> Bir test bileşiği veya bir kontrol 4 ul ekleAntibiyotik (50x stok çözelti) ve oyuk başına seyreltilmiş bakteri kültürü 196 ul. </li><li> 18 saat 200 rpm&#39;de bir plaka karıştırıcısı üzerinde 37 ° C &#39;de inkübe edin. Not: Burada 2 mm yörüngeye bir shaker kullanın. </li></ol></li><li> Maruziyet sonrası protokol <ol><li> Tüm örnekler için, steril bir 96 mikro tepsinin bölmesi başına seyreltilmiş bakteri kültürü 200 ul ekle. </li><li> 18 saat 200 rpm&#39;de bir plaka karıştırıcısı üzerinde 37 ° C &#39;de inkübe edin. Not: Burada 2 mm yörüngeye bir shaker kullanın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, biyofilm dokunmadan, dikkatle tüm planktonik çözüm çıkarın. </li><li> Bir test bileşiğinin ya da bir kontrol antibiyotik (50x stok çözelti) ve oyuk başına TSB 196 ul 4 ul ekle. </li><li> Ek bir 24 saat boyunca 200 rpm&#39;de bir plaka karıştırıcısı üzerinde 37 ° C &#39;de inkübe edin. Not: Burada 2 mm yörüngeye bir shaker kullanın. </li></ol></li></ol> 3. Resazurin Boyama ProtocoBiyofilmler Canlılık Değerlendirmesi l <ol><li> steril PBS içinde 0.1 mg / ml resazurin (0.4 mM) bir stok çözeltisi hazırlanır. ışığa maruz kalmaktan korunmuş steril Bu stok tutun ve 4 ° C&#39;de. </li><li> 20 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) içinde resazurin stok 1:50 seyreltin. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak ayrı, temiz 96-plaka için, hava kabarcıkları biyofilm dokunarak veya yaratmadan, dikkatlice (kuyularda biyofilm bırakarak) tüm planktonik çözüm aktarın. </li><li> kuyu başına 200 ul ekleyerek steril PBS ile bir kez biyofilm yıkayın ve dikkatli bir şekilde çok kanallı pipet kullanarak kaldırın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak biyofilm plakası kaynağı başına seyreltilmiş resazurin 200 ul ekle. </li><li> muamele edilmemiş biyofilm kontrol eşit pembe kadar yaklaşık 20 dakika çalkalanarak, oda sıcaklığında (RT) ve 200 rpm&#39;de, Karanlıkta inkübe edin. </li><li> at floresan ölçmekEXC = 560 nm ve λ em bir plaka okuyucu (üst okuma) ile 590 nm = λ. </li></ol> 4. Kristal Violet Boyama Protokolü Biyofilm Biyokütle Niceleme için Adım 3&#39;te aynı plaka kullanma <ol><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak kuyulardan dikkatlice resazurin leke çıkarın. </li><li> 15 dakika boyunca metanol içinde 200 ul biyofilm düzeltildi. </li><li> 10 dakika boyunca plaka hava kurumasını bekleyin. </li><li> dikkatli bir şekilde çok kanallı pipet kullanarak, kristal viyole çözeltisi (deiyonize su içinde seyreltildi hacim / hacim),% 0.02 190 ul ekle. pipetle sırasında leke kuyuların yanlarını dokunmaktan kaçının ve darbe-out tamamlamak için pipet basarak değil hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika için inkübe edilir. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, dikkatle leke çıkarın. </li><li> iyonu giderilmiş su (her seferinde ul 200) ile iki kez yıkanır. </li><li> Kuyular oda sıcaklığında 5 dakika kuruması ve geri kalan leke çözülür% 96 etanol ya da% 33 asetik asit içinde. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat için inkübe ve 595 nm&#39;de absorbans okundu. </li></ol> 5. Biyofilmler için aynı örnek Plate kullanılması Planktonik Bakteriler Üzerine Bakterisid Etkisinin Değerlendirilmesi <ol><li> 3.3 ile planktonik çözeltisi ile plakanın 595 nm&#39;de bulanıklık ölçün. </li><li> resazurin stokunun 10 ul ekleyerek başına kuyunun resazurin ile planktonik bakteri Leke. Pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> muamele edilmemiş kontroller eşit pembe kadar yaklaşık 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe. </li><li> Λ exc = 560 nm&#39;de floresan ölçmek ve λ em 590 nm =. </li></ol> Matris Kantifikasyon ve Biyofilmler Floresan Mikroskopi Görüntüleme 6. buğday tohumu Aglütinin Boyama <ol><li> matris ölçümü <ol><li> steril PBS WGA prob, 5 ug / ml solüsyonu hazırlayın. </li><li> Paralel örnek pla kullanınBu boyama te. kuyulardan planktonik çözüm çıkarın ve dikkatli bir şekilde biyofilm dokunmadan çok kanallı pipet kullanılarak, steril PBS (oyuk başına 200 ul) ile bir kez yıkanır. </li><li> iyi lekeli edilecek başına WGA solüsyonu 200 ul ekleyin. </li><li> 2 saat süreyle 4 ° C de karanlıkta o inkübe edin. </li><li> PBS, üç kez 200 ul ile kuyu yıkanarak bağlanmamış lekeyi. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca plaka kurumasını bekleyin. </li><li> Yuva başına 200 ul kullanılarak,% 33 asetik asit içinde ilişkili leke çözülür. </li><li> şerit kapakları ile kuyu Seal ve oda sıcaklığında 30 saniye ve 40 kHz için bir su banyosu sonikatör kullanarak ses dalgalarına maruz. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> sonication adımı yineleyin. kuyular Sonication adımlar arasında kapalı kalabilir. </li><li> Λ ex = 495 nm floresan ölçmek ve λ em bir plaka okuyucu (üst okuma) ile 520 nm =. </li></ol></li><li> Matrisi ile görselleştirmefloresan mikroskopi <ol><li> Adım 6.1.6 kadar yukarıdaki aynı protokolü kullanın. </li><li> Kurutma adımından sonra, bir FITC filtresi (ya da bir başka uygun yeşil uyarım filtre) kullanılarak bir floresans mikroskobu ile örnekleri görselleştirmek. </li></ol></li></ol> Floresan Mikroskopi ve Yeşil-to-kırmızı-oranı için Sinyal Niceleme (G / R) ile Görüntüleme Biyofilmler içinde 7. Boyama Canlı ve Ölü Hücreler <ol><li> Floresan mikroskobu ile görüntüleme <ol><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak, her bir prob (bir boyama canlı hücreler ve bir kullanıcı boyama ölü hücreleri) ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. </li><li> kuyulardan planktonik çözüm kaldırmak ve çok kanallı pipet kullanarak (oyuk başına 200 ul) steril PBS ile bir kez yıkanır. </li><li> Oyuk başına boyama solüsyonu 6 ul ekleyin. </li><li> 15 dakika karanlıkta plaka inkübe edin. </li><li> mikroskopi önce fazla sıvı m kaldırmakanually bir çok kanallı pipet kullanarak. </li><li> Örneğin bir FITC filtresi (yeşil floresan için, canlı hücreler) ya da bir TRITC filtresi (kırmızı floresan, ölü hücreler) kullanarak, bir floresan mikroskop kullanılarak görüntüler çekin. </li></ol></li><li> Yeşil-to-kırmızı flüoresans oranı olarak sinyal miktarının (G / R) <ol><li> adımlar 7.1.1 ve 7.1.2 ile aynı protokolü uygulayın. </li><li> Oyuk başına boyama çözeltisi 200 ul ilave edin ve karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe. </li><li> uyarma / emisyon dalga boyları yeşil ve kırmızı floresan 485/535 nm ve 485/635 sırasıyla (üst okuma) bir plaka okuyucu ile floresan ölçün. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+a+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Dufour, D., Leung, V., L&#233;vesque, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilm:+structure,+fuction,+and+antimicrobial+resistance.">Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance.</a> Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).</li><li>Donne, J., Dewilde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Challenging+World+of+Biofilm+Physiology.">The Challenging World of Biofilm Physiology.</a> Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).</li><li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+infections:+mechanisms+of+biofilm+maturation+and+detachment+as+critical+determinants+of+pathogenicity.">Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity.</a> Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).</li><li>Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+extra+hurdle+for+effective+antimicrobial.">Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial.</a> Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells.">Persister cells.</a> Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+strains+producing+high+levels+of+persister+cells+in+patients+with+cystic+fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis.</a> J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).</li><li>Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+biofilm+disinfectant+efficacy+tests.">Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests.</a> J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor.">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+assessment+of+a+laboratory+method+for+growing+biofilms.">Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms.</a> Microbiology. 151, 757-762 (2005).</li><li>Parker, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruggedness+and+reproducibility+of+the+MBEC+biofilm+disinfectant+efficacy+test.">Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test.</a> J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Calgary+Biofilm+Device:+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms.">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li><li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+susceptibility+testing+of+microbes+growing+on+peg+lids:+a+miniaturized+biofilm+model+for+high-throughput+screening.">Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening.</a> Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).</li><li>Konrat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bead+Assay+for+Biofilms:+A+Quick,+Easy+and+Robust+Method+for+Testing+Disinfectants.">The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants.</a> PLoS One. 11, e0157663 (2016).</li><li>Cragg, G. M., Newman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products:+A+continuing+source+of+novel+drug+leads.">Natural products: A continuing source of novel drug leads.</a> Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).</li><li>Sandberg, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pros+and+cons+of+using+resazurin+staining+for+quantification+of+viable+Staphylococcus+aureus+biofilms+in+a+screening+assay.">Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay.</a> J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).</li><li>Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+assay+based+on+resazurin+for+detection+of+activity+of+disinfectants+against+bacterial+biofilm.">Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).</li><li>Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates.">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).</li><li>Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+high+throughput+Alamar+blue+biofilm+susceptibility+assay+to+Staphylococcus+aureus+biofilms.">Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms.</a> Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).</li><li>Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+microtiter-plate+test+for+quantification+of+staphylococcal+biofilm+formation.">A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation.</a> J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).</li><li>Stiefel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+biofilm+removal+properly+assessed?+Comparison+of+different+quantification+methods+in+a+96-well+plate+system.">Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).</li><li>Sandberg, M., M&#228;&#228;tt&#228;nen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automating+a+96-well+microtitre+plate+model+for+Staphylococcus+aureus+biofilms:+an+approach+to+screening+of+natural+antimicrobial+compounds.">Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).</li><li>Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+lectinsorbent+assay+measures+N-acetyl-D-glucosamine+in+matrix+of+biofilm+produced+by+Staphylococcus+epidermidis.">Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis.</a> Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).</li><li>Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microplate+spectrofluorometric+assay+for+bacterial+biofilms.">A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).</li><li>Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+biofilm+matrix+measurements+with+biomass+and+viability+assays+in+susceptibility+assessments+of+antimicrobials+against+Staphylococcus+aureus+biofilms.">Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms.</a> J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).</li><li>Skogman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+antibacterial+and+anti-biofilm+activities+of+cinchona+alkaloid+derivatives+against+Staphylococcus+aureus).">Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus).</a> Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).</li><li>Fallarero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(+)-+Dehydroabietic+Acid,+an+Abietane-Type+Diterpene,+Inhibits+Staphylococcus+aureus+Biofilms+in+Vitro.">(+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro.</a> Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).</li><li>Manner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+derivatives+of+dehydroabietic+acid+target+planktonic+and+biofilm+bacteria+in+Staphylococcusaureus+and+effectively+disrupt+bacterial+membrane+integrity.">New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity.</a> Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).</li><li>Muller, G., Kramer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+index+of+antiseptic+agents+by+parallel+assessment+of+antimicrobial+activity+and+cellular+cytotoxicity.">Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity.</a> J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).</li><li>Tot&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+efficacy+of+various+antibiotics+on+matrix+and+viable+mass+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).</li><li>Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+plate+assay+for+assessment+of+Listeria+monocytogenes+biofilm+formation.">Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).</li><li>Li, X., Yan, Z., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+variation+of+biofilms+among+strains+in+natural+populations+of+Candida+albicans.">Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans.</a> Microbiolog. 149, 353-362 (2003).</li><li>Barbosa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+and+simple+micro+assay+for+sulfated+glycosaminoglycans+quantification+in+biological+extracts+and+its+use+in+skin+and+muscle+tissue+studies.">Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies.</a> Glycobiology. 13, 647-653 (2003).</li><li>Tot&#233;, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+colorimetric+microtitre+model+for+the+detection+of+Staphylococcus+aureus+biofilms.">A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms.</a> Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).</li><li>Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+intercellular+adhesin+in+biofilm:+structural+and+regulatory+aspects.">Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects.</a> Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).</li><li>Ausbacher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+biofilm+susceptibility+to+small+and+potent+beta(2,2)-amino+acid+derivatives.">Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives.</a> Biofouling. 30, 81-93 (2014).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Aynı anda canlılık, biyokütle ve biyofilm matrisi üzerinde bir bileşiğin etkisini ölçmek tek yöntem yoktur. Bu nedenle, tercih edilen birincil tarama aşamasında, üç uç noktası üzerinde bir etki tespit etmek için deneyler ile birleştirmek için bir ihtiyaç vardır. Resazurin, yalnızca redoks probun ilavesinden oluşan çok basit boyama protokolüdür. Ancak, resazurin ile biyofilm optimal inkübasyon süresi kuran bu testin başarısı için çok önemlidir. Bazılarında...

Bakteriler biyofilm en yaygın örneği olan iki çok farklı yaşam tarzları, planktonik ve sapsız, arasında geçiş yapabilirsiniz. Biyofilmlererde, bakteriler kendi ürettiği matrise 1 gömülü yapısal toplulukları oluştururlar. Bu kendi ürettiği matris bakteri ve dış çevre arasında bir bariyer olduğunu ve yakın tutarak, mikrobiyal hücreleri korur. biyofilm matrisin bileşimi ile ve hatta türler içinde değişir, ama daha çok lipopolisakaritler, hücre dışı DNA ve protein sıkı ağından oluşur. Matris zararlı maddelerin girişini engelleyerek fiziksel bir bariyer görevi görür, ama aynı zamanda dehidrasyon biyofilm korur ve hücre 2 kaçan besin önler. Biyofilmler, modern biyomedikal en zorlu konulardan biri olarak kabul edilir ve bunlar antibiyotik dayanıklı enfeksiyonlarda 3% 80&#39;i için ileri sürülen sorumludur. onlar dispnem, osmotik basınç, mekanik stres 4, ısı, UV radyasyonu 5, dezenfektanlar, antimikrobiyal ajanlar, ve ev sahibi bağışıklık sistemi 1: dış tehditlere karşı doğal olarak yüksek tolerans yatıyordu. Örneğin, bir biyofilm öldürmek için gerekli gerekli antimikrobiyel madde konsantrasyonu, planktonik bakterileri öldürmek için gerekene göre en fazla 1000 kat daha yüksek olduğu gösterilmiştir. bu daha yüksek tolerans açıklaması çok faktörlü olduğu görülmektedir. matris biyofilm içine antibiyotik penetrasyonu azaltan fiziksel bir engel oluşturur. Ayrıca, biyofilm içindeki hücrelerin fenotipik çeşitlidir; onlar yüzünden biyofilm 6 iç ve dış kısımları arasındaki oksijen, besin ve metabolitleri varolan degrade farklı metabolik durumları arasında geçiş. Dolayısıyla, bu tür çekirdek gibi bazı biyofilm bölgelerde, bakteri oksijen ve besin yoksun ve bir metabolik az aktif ya da tamamen atıl devlet içinde yaşamak <sup&gt; 7. Tamamen atıl hücreleri gibi persister hücreleri de ifade edilir ve geleneksel antimikrobiyal tedavi 8 duyarlı değildir. Nedenle, biyofilm esnekliği halihazırda, önerilen ve diğer henüz bilinmeyen mekanizmalarla bir kombinasyonundan ortaya olasıdır. Staphylococcus spp. Şiddetli, sık sık biyofilm ilgili, enfeksiyonlara 4 neden en sorunlu gram pozitif bakteriler arasında devam etmektedir. Tüm bakterilerin% 99&#39;a kadar daha baskın bakteri yaşam tarzı 3 yaparak, biyofilm içinde ilişkili olduğu ileri sürülmektedir. Ancak, şu anda mevcut antibiyotiklerin tüm tek hücreli (plankton) bakterilere karşı geliştirilmiştir. Şu ana kadar, bir molekül çok sınırlı repertuarı selektif olgun biyofilm üzerinde hareket edebilir bulunmaktadır. Bu durum, anti-biyofilm için arama yaparak daha belirgin bir yer işgal çağrısı edildiği ilaç keşfi bir ilerici paradigma kayması, tahrik vardır. Bir methodolog itibarenbiyofilm yöntemler sadece sınırlı sayıda standart koyucu kuruluşlar, kimyasal kütüphanelerin yüksek verimli tarama için geçerli özellikle geliştirilmiştir gibi nik perspektif bir ek zorluklar mevcuttur. (Sadece bir istisna dışında) Bütün standart deneyler biyofilm reaktörleri dayalı ve bu yöntemler genellikle erken evrede araştırma 9-12 sırasında kullanılamaz geniş çalışma hacimleri ve test edilecek bileşiklerin büyük miktarda gerektirir. Yalnızca mevcut standart bir tarama uygulanamaz deney ticari olarak temin edilebilen en az biyofilm ortadan konsantrasyonu (MBEC) Sistem 13-15 geliştirilmiş olan sözde Calgary Biyofilm cihazdır. Ancak, bu testin sınırlama biyofilm mandal yetiştirilen ve tüm bakteri türleri ya da aynı türün içindeki bile suşları değil bu cihazda biyofilm oluşturmak mümkün olmasıdır. Ayrıca, özellikle de doğal bileşiklerin keşfi uygulanabilir yöntemlerdirgerekli. Doğal ürünler Geçen yüzyılda üzerinde 16 antimikrobiyal ilaç keşfi yenilik için önemli bir kaynak olmuştur. Ayrıca persister hücrelere karşı etkili olabilir etki benzersiz mekanizmaları, yeni anti-biyofilm bileşikler sağlayabilir. Böylece, doğal ve doğadan ilham kütüphanelerin keşif umut verici ve benzersiz anti-biyofilm potansiyel üreten yüksek şansı var. Burada, Staphylococcus aureus biyofilm canlılığı, toplam biyokütle ve matris üzerinde etkilerini ölçmek için üç deneyleri kullanılarak anti-biyofilm bileşiklerin kimyasal taranması için geliştirilen testlerin bir platform deneysel ayrıntıları sunuyoruz. İlk deney biyofilm canlılığını ölçen ve resazurin boyama dayanır. Resazurin onun oksitlenmiş halde mavi ve floresan olmayan ve bakteri metabolik aktivitesi azalır zaman pembe, yüksek floresan resorufine dönüşen bir redoks leke olduğunu. Bu çok basit ve hızlı mBirincil gösterimleri 17-20 için müsait bu yöntemde. İkinci deney, kristal mor boyama dayalı olarak, toplam biyofilm kütlesi ölçer. Kristal viyole biyofilm 19,21-23 bakteri ve bakteri çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir leke olduğunu. Tahlil ucuz reaktif dayalı ve basit bir emme uç okuma vardır. Son olarak, üçüncü deney stafilokok biyofilm 24 matrisi içinde mevcut N-asetil-glukozamin (PNAG) poli- spesifik olarak bağlanan buğday tohumu agglutinin ile biyofilm (WGA), hücre-dışı polimerik madde (EPS) -Matris hedeflemektedir. WGA floresan yoğunluğu okuyucu 25 ile tespit edilebilen bir florofor ile konjuge edilir. Biz burada mantığını ve uygulama örnekleri de dahil olmak üzere, geliştirilen platformun detaylarını sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Resazurin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT90132&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD &lt;em&gt;BacLight&lt;/em&gt;&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>L7012</td><td>SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone soy agar</td><td>Lab M, Neogen</td><td>LAB011</td><td></td></tr><tr><td>Tryptine soy broth</td><td>Lab M, Neogen</td><td>LAB004</td><td></td></tr><tr><td>F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>161093</td><td></td></tr><tr><td>BRAND caps, strips of 8</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR781413-300EA</td><td></td></tr><tr><td>Branson CPX series ultrasonic bath</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z769428-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Multipipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop dispenser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biomek 3000</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Flash Multiplate reader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC&amp;nbsp;</td><td>25923</td><td></td></tr></tbody></table>

a platform of anti-biofilm assays suited to the exploration of natural compound libraries

Biyofilmler, modern biyomedikal en zorlu konulardan biri olarak kabul edilir, ve potansiyel antibiyotik dayanıklı enfeksiyonların% 80&#39;i sorumludur. Biyofilm multifaktöryeldir olduğu düşünülen kemoterapi için olağanüstü yüksek tolerans, göstermiştir. Örneğin, matris biyofilm içine antibiyotik penetrasyonu azaltan fiziksel bir engel oluşturur. Ayrıca, biyofilm içindeki hücrelerin fenotipik çeşitlidir. Büyük olasılıkla, biyofilm esnekliği bu ve diğer, henüz bilinmeyen mekanizmalarla bir kombinasyonundan kaynaklanır. Şu anda mevcut antibiyotiklerin tüm tek hücreleri (plankton) bakterilere karşı geliştirilmiştir. Bu nedenle, şimdiye kadar, bir molekül çok sınırlı repertuarı selektif olgun biyofilm üzerinde hareket edebilir bulunmaktadır. Bu durum, anti-biyofilm için arama yaparak daha belirgin bir yer işgal çağrısı edildiği ilaç keşfi bir ilerici paradigma kayması, tahrik vardır. Ek bir zorluk olmasıdırÇok biyofilm araştırma için standart yöntemler, kimyasal kütüphaneler büyük hacimli tarama için kullanılabileceğini özellikle sınırlı sayıda. Burada, kimyasal tarama için deneysel bir anti-biyofilm platformu sunulmuştur. Poli N-asetil-glukozamin, PNAG ait bir buğday tohumu agglutinin kullanarak biyofilm (resazurin boyama ile) canlılığı, (kristal viyole boyama ile) toplam biyokütle ve biyofilm matrisi (ölçmek için üç deneyleri kullanır, WGA-floresan tabanlı boyama , fraksiyon). Tüm deneyler modeli bakteriler gibi Staphylococcus aureus kullanılarak geliştirilmiştir. Platform primer tarama için de tanımlanan anti-biyofilm hit fonksiyonel karakterizasyonu için nasıl kullanılabileceğini örnekleri sunulmaktadır. Bu deneysel sekansı ölçülen son noktaları dayalı isabet sınıflandırılmasını sağlar. Ayrıca, özellikle kısa süreli kemoterapötik etkilerinin karşılaştırılması, uzun vadede, etki biçimleri hakkında bilgi sağlar. Bu nedenle, çok Adva olançeşitli biyomedikal uygulamalar için başlangıç ​​noktası hizmet verebilir yüksek kaliteli isabet bileşiklerinin hızlı belirlenmesi için ntageous.

Önerilen platformda, canlılık, biyokütle ve biyofilm matrisi üzerinde etkileri ölçülür. Çalışma dizisi (Şekil 1), bir örnek plakası aynı anda bakteriyel biyofilm canlılığı ve toplam biyofilm biyokütle üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kristal viyole ile resazurin ile ve daha sonra lekeli. Bu resazurin bir birinci boyama kristal mor plakalar arasında maksimum sinyal emme birimleri karşılaştırmak için kristal viyolet sonucu (p...

Watch this Scientific Journal Video about A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries at JoVE.com

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

Doğal Bileşik Kütüphaneleri Exploration uygundur Anti-biyofilm Tahliller Bir Platform

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

a-platform-anti-biofilm-assays-suited-to-exploration-natural-compound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.6K Görüntüleme.  University of Helsinki. Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects. 

Video: A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

İzleme Oluşumu ve Antifungal Duyarlılık Testi için 96 Şey microtiter Levha tabanlı Yöntemi Candida albicans Biyofilmler

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Biyomühendislik

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Biyofilm İlişkili Hedefleme<em&gt; Staphylococcus aureus</emKullanma&gt; Resazurin Tabanlı İlaç-duyarlılık Deneyi

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

Suyu Microdilution Vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Biyoloji

Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active compounds from plants are challenging because of the complex plant matrix and time-consuming isolation and identification procedures. Therefore, a stepwise approach for screening natural compounds from plants, including the isolation and identification of potentially active molecules, is presented. It includes the collection of the plant material; preparation and fractionation of crude extracts; chromatography and spectrometry (UHPLC-DAD-HRMS and NMR) approaches for analysis and compounds identification; bioassays (antimicrobial and antibiofilm activities; bacterial &#34;adhesion strength&#34; to the salivary pellicle and initial glucan matrix treated with selected treatments); and data analysis. The model is simple, reproducible, and allows high-throughput screening of multiple compounds, concentrations, and treatment steps can be consistently controlled. The data obtained provide the foundation for future studies, including formulations with the most active extracts and/or fractions, isolation of molecules, modeling molecules to specific targets in microbial cells and biofilms. For example, one target to control cariogenic biofilm is to inhibit the activity of Streptococcus mutans glucosyltransferases that synthesize the extracellular matrix&#8217; glucans. The inhibition of those enzymes prevents the biofilm build-up, decreasing its virulence.

Natural products represent promising starting points for the development of new drugs and therapeutic agents. However, due to the high chemical diversity, finding new therapeutic compounds from plants is a challenging and time-consuming task. We describe a simplified approach to identify antimicrobial and antibiofilm molecules from plant extracts and fractions.

Diş Çürüklerini Önlemek İçin Bitkilerin Özlerinden ve Fraksiyonlarından Yeni Antimikrobiyal ve Antibiyofilm Moleküllerini Tanımlamak için Sistematik Yaklaşım

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

A Solid Phase Adherence Assay to Assess Biofilm Formation

Source: Nickerson, K. P. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57322">Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018)
The video demonstrates a solid-phase adherence assay for assessing biofilm formation. In a multi-well plate, bacteria in bile salt-supplemented media adhere to solid surfaces, forming biofilms, which is confirmed by colorimetry through crystal violet staining and ethanol treatment.

Biyofilm oluşumunu değerlendirmek için bir katı faz uyum testi

1. Preparation of Reagents

	Bile salts medium: To prepare tryptic soy broth (TSB) containing 0.4% bile salts (weight/volume), resuspend 200 mg of bile ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünodiyagnostik

Özelleşmiş Analizleri

Detection of Biofilm Disassembly Through a Dispersion Assay

Record the OD600 values from the overnight biofilm plate on the plate reader by setting the control well as blank. Next, aspirate the culture medium using a vacuum line without disturbing the adherent population on the plastic surface. Gently wash the wells twice with 200 microliters of sterile PBS.
After washing with PBS at 130 microliters of the prewarmed PBS, PBS with glucose, PBS with bile salts, and PBS with bile salts and glucose to each of the three wells. Then incubate the plate at 37 degrees Celsius for 30 minutes. After 30 minutes, remove the plate from the incubator. Pipette the supernatant out to a fresh sterile 96-well plate.
Finally, prepare 1 to 10 serial dilutions of the supernatant with PBS in the 96-well plate or in a dilution block. Then use a multichannel pipette to transfer 5 microliters of each dilution on LB agar plates. Incubate the plates at 37 degrees Celsius overnight. The next day, count the number of colonies.

Doğal Bileşik Kütüphaneleri Exploration uygundur Anti-biyofilm Tahliller Bir Platform

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler