Dr. Swathi Arur'a (MD Anderson Kanser Merkezi) let-60(n1046)sağladığı için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. David Reiner'a (Houston'daki Texas A&M Sağlık Bilimleri Merkezi Biyobilimler ve Teknoloji Enstitüsü) lin-1 suşu için teşekkür ederiz. Son olarak, Dr. Danielle Garsin'e ve laboratuvarına (Teksas Üniversitesi, McGovern Tıp Fakültesi) bazı reaktifleri sağladıkları için teşekkür ederiz. Bazı solucan suşları, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır. Bu Araştırma, Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü (CPRIT) tarafından JF Hancock'a RP200047 hibesi ile desteklendi.

1. Nematod büyüme ortamı (NGM) plaka hazırlama
<ol><li>2 L Erlenmeyer şişesinde bulunan 970 mL deiyonize suya 2,5 g pepton ve 3 g NaCl ekleyin. İçeriği manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak karıştırın. Daha sonra, şişeye 20 g agar ekleyin. Şişenin içeriğini 121 °C'de ve 15 lb/in2 basınçta 30 dakika boyunca otoklavlayın. Sterilizasyondan sonra, şişeyi bir karıştırma plakasına yerleştirin ve sıcaklığın 50 ° C'ye ulaşana kadar ortamın soğumasını bekleyin.</li>
	<li>NGM plakalarını hazırlamak için soğutulmuş ortama aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 25 mL 1 M potasyum fosfat tamponu (pH = 6.0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2,1 mL (%95 etanolde 5 mg/mL) kolesterol, 1 mL (etanolde% 10 v / w) nystatin ve 1 mL 25 mg / mL streptomisin.</li>
	<li>Laminer bir akış altında, soğutulmuş ortamı 60 mm x 15 mm steril Petri kaplarına dökün. Plakaların 2 saat katılaşmasını bırakın. Bu plakalar 4 °C'de 1 ay saklanabilir.</li>
</ol>2. C. eleganların yayılması
<ol><li>Her NGM plakasının ortasına 100 μL gece yetiştirilen E. coli OP50'yi tespit edin ve plakaların laminar bir başlıkta 24 saat kurumasını bekleyin. Daha sonra, plakalar polistiren kapta saklanabilir. NOT: E. coli OP50 kültürü, plakaların tohumlanması öncesinde Luria-Bertani (LB) medyasında 37 °C media'da yetiştirilir. Kültür 1-2 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir ve plakaların periyodik tohumlama için kullanılabilir.</li>
	<li>Steril bir solucan toplama kullanarak, daha önce yetiştirilen bir tabaktan 10-12 gravid yetişkin solucanı bir diseksiyon mikroskobu altında toplayın. Bu solucanları E. coli OP50 ile tohumlanmış taze bir NGM plakasına aktarın ve plakayı 20 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>24 saat sonra, steril bir solucan toplama kullanarak yetişkin solucanları plakalardan çıkarın. Plakaları ~ 3 gün boyunca 20 ° C'de kuluçkaya yatırın. Embriyolar gravid yetişkin solucanlara dönüşecek.</li>
</ol>3. Senkron C. elegans kültürünün hazırlanması
<ol><li>Gravid yetişkin solucanlarını M9W ile 2-4 tabak yıkayarak 15 mL konik bir tüpe toplayın.<ol>
<li>M9W'ın hazırlanması: 5 g NaCl, 6 g Na 2 HPO 4ve 3 g KH2PO4'ü iyonize suda 1 L'lik son hacme kadar çözün. Soğutulmuş çözeltiye 1 mL 1 M MgSO4 ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüpü 1 dakika boyunca 450 x g'da santrifüj ederek solucanları peletin. Solucan peletini bozmadan süpernatantı dekant.</li>
	<li>%8,25 sodyum hipoklorit (ev tipi çamaşır suyu) ve 5 N NaOH'un 100 μL'sini birleştirerek solucan lizis çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi solucan peleti ekleyin ve tüpün içeriğini karıştırmak için tüpü hafifçe vurun. Solucanların lizizini bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyerek tüpteki embriyoların aşırı etkilenmesini önleyin.</li>
	<li>Yetişkin solucanların% 70'i lize olduğunda lizis karışımını seyreltmek için konik tüpe 10 mL M9W ekleyin.</li>
	<li>Tüpü 1 dakika boyunca 450 x g'da santrifüj edin. Süpernatant'ı 10 mL M9W ile değiştirin.</li>
	<li>3,5 adımlarını iki kez yineleyin.</li>
	<li>Yıkama adımlarını tamamladıktan sonra, yumurta peletini yeniden çıkarmak için 3-5 mL M9W ekleyin. Tüpü oda sıcaklığında (RT) bir tüp rotator üzerinde 18 rpm hızında gece boyunca döndürün.</li>
	<li>Gece kuluçkadan sonra, tüpü rotatordan çıkarın, tüpü 1 dakika boyunca 450 x g'da santrifüj ederek L1 larvalarını peletin. M9W'ı tüpte 250 μL kalana kadar aspire edin.</li>
	<li>Larvaları yeniden çıkarmak için tüpü sallayın. Bir Petri kabı kapağına larvaları içeren üç 5 μL damla ekleyin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak her damladaki solucan sayısını sayın ve 1 μL'deki solucan sayısını belirleyin.</li>
</ol>4. İlaç testlerinin hazırlanması
NOT: Bu testteki adımlar Şekil 1'de gösterilmiştir.
<ol><li>150 rpm'de bir yörünge çalkalayıcıda bir gecede 37 °C'de 50 mL konik tüpte 30 mL E. coli OP50 yetiştirin.</li>
	<li>Hücreleri peletmek için 10 dakika boyunca 4.000 x g'da bir gecede yetiştirilen E. coli OP50 kültürünü döndürün. Süpernatant çıkarın ve kültürü konsantre etmek için peletin 3 mL M9W'ta yeniden süzülür.</li>
	<li>İlaç tahlil için çalışma çözümlerini hazırlamadan önce, 100 mL ML M9W'a 0,1 mL (%95 etanolde 5 mg/mL) kolesterol ekleyin.</li>
	<li>Her ilaç artı aracı seyrelterek her deneysel ilacın çalışma çözümlerini hazırlayın (dimetil süloksit; DMSO) 4.8 mL M9W uygun konsantrasyonları elde etmek için kolesterol ile desteklenmiştir. Araç kontrolünü hazırlamak için DMSO'yu kolesterolle desteklenmiş 4,8 mL M9W'da çözün.</li>
	<li>Karıştırıldıklarından emin olmak için araç kontrolünü veya uyuşturucu ve girdap tüplerini içeren her tüpe 200 μL konsantre E. coli OP50 kültürü ekleyin.</li>
	<li>Deneyi gerçekleştirmek için, her kuyuya 12 kuyu doku kültürü plakasında her bir ilaç çözeltisinin veya araç kontrolünün 2 mL'sini ekleyin. Her uyuşturucu konsantrasyonu ve araç kontrolünü kopya olarak test edin.</li>
	<li>Steril bir mikropipette kullanarak kuyu başına ~100 L1 larva ekleyin (bkz. senkron C. elegans kültür adımları). Solucanların hacmini 10 μL ile sınırlandırın.</li>
	<li>Plakaları 20 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Gerekirse tahlilin 3. gününde 50 μL 10x konsantre E. coli OP50 ile takviye kuyuları.</li>
</ol>5. Mikroskopi için agarose ped hazırlığı
<ol><li>5 mL deiyonize suda 0,1 g agarose eriterek% 2 w / v agarose çözeltisi hazırlayın. Agarose'un çözünmesi için içindekileri mikrodalga fırında ısıtın. 5 mL agarose çözeltisinden 20 slayt hazırlanabilir.</li>
	<li>laboratuvar bandı şeritlerini iki cam slayt boyunca yerleştirin. Bant, agarose pedlerinin kalınlığını sınırlayan aralayıcılar olarak hareket edecektir. Daha sonra, bantlanmış slaytların arasına üçüncü bir temiz cam slayt yerleştirin.</li>
	<li>Bir agarose ped yapmak için, temiz slaytın ortasına 100 μL erimiş agarose bulun. Agarose boyunca ve üstüne başka bir temiz cam slayt yerleştirin ve bir ped oluşturmak için hafifçe bastırın. Ped katılaştırıldığında üst slaydı çıkarın.</li>
</ol>6. Muv fenotipinin let-60, let-23 ve lin-1 suşlarında gözlemlenmesi
NOT: Sadece let-23 ve let-60 suşlarındaki Muv fenotiplerini baskılayan aday ilaçlar, inhibisyonun RAS veya EGFR düzeyinde gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için lin-1 suşu kullanılarak test edilecektir.
<ol><li>Yaşam döngüsünün uygun aşamasına ulaşıldığında (let-60 ve let-23 suşları için 3 gün, lin-1 suşu için 5 gün), plakaları inkübatörden çıkarın. ve solucanları bir pipet kullanarak 15 mL konik tüplerde toplayın.</li>
	<li>Tüpleri 450 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>6.2 adımlarını iki kez yineleyin.</li>
	<li>Solucan peletini bozmadan, kalan tüm M9W'yi aspirasyonla çıkarın. Daha sonra, 500 μL 2 mM sodyum azit veya 2 mM tetramisol hidroklorür ekleyin. Tüplerin RT'de 15 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin, 2 mM sodyum azit veya 2 mM tetramisol hidroklorür görüntüleme için solucanları uyuşturacaktır. DİkKAT: Sodyum azid kullanırken kişisel koruyucu ekipman (KKD) giydiğinden emin olun. Çözelti kimyasal bir başlık altında hazırlanmalıdır.</li>
	<li>Bir agarose pedinin ortasına 10 μL anestezi solucan süspansiyonu ekleyin. Solucan süspansiyonu üzerine hafifçe #1,5 kapak zarı yerleştirin. Gerekirse, kurumasını önlemek için kapak kapağını biraz oje ile sabitleyin.</li>
	<li>Let-60(n1046), let-23(sa62) ve lin-1(sy254) suşlarını gözlemlemek için bir DIC mikroskobu kullanın. Solucanları 10x ve 20x büyütmelerde görüntüleyin.</li>
	<li>Let-60(n1046) ve let-23(sa62) için, Muv fenotipinin varlığına veya yokluğuna göre yetişkin solucanları puanlama. Lin-1 suşu için, yüksek çözünürlüklü bir DIC mikroskobu kullanarak L4 larvalarının ventral tarafında 1° veya 2 ° hücre kaderlerini benimseyen VPC sayısını sayın.</li>
	<li>Her suş ve ilaç tedavisi için mikro grafikleri puanlama yaptıktan sonra, tedaviler arasındaki istatistiksel farklılıkları belirlemek için Öğrenci t-testini gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Marshall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+Ras+and+Raf:+key+regulatory+proteins+in+cellular+transformation.">Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).</li><li>Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+the+Ras-ERK/MAPK+signaling+pathway.">Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).</li><li>Grandis, J. R., Tweardy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+transforming+growth+factor+alpha+and+epidermal+growth+factor+receptor+messenger+RNA+are+early+markers+of+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).</li><li>Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+molecular+pathobiology+in+oral+cancer:+a+review.">Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review.</a> International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).</li><li>Stransky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutational+landscape+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).</li><li>Bos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ras+oncogenes+in+human+cancer:+a+review.">ras oncogenes in human cancer: a review.</a> Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).</li><li>Downward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RAS+signalling+pathways+in+cancer+therapy.">Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+survey+of+Ras+mutations+in+cancer.">A comprehensive survey of Ras mutations in cancer.</a> Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).</li><li>Hancock, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+proteins:+different+signals+from+different+locations.">Ras proteins: different signals from different locations.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).</li><li>Hancock, J. F., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+plasma+membrane+signalling+platforms.">Ras plasma membrane signalling platforms.</a> Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).</li><li>van der Hoeven, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fendiline+inhibits+K-Ras+plasma+membrane+localization+and+blocks+K-Ras+signal+transmission.">Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).</li><li>Moghal, N., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+system+in+Caenorhabditis+elegans.">The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).</li><li>Sundaram, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTK/Ras/MAPK+signaling.">RTK/Ras/MAPK signaling.</a> WormBook. , 1-19 (2006).</li><li>Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+22+genes+that+affect+the+vulval+cell+lineages+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).</li><li>Katz, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point+mutation+in+the+extracellular+domain+activates+LET-23,+the+Caenorhabditis+elegans+epidermal+growth+factor+receptor+homolog.">A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).</li><li>Hara, M., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+farnesyltransferase+inhibitors+suppress+the+phenotype+resulting+from+an+activated+ras+mutation+in+Caenorhabditis+elegans.">Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).</li><li>Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Caenorhabditis+elegans+to+evaluate+inhibitors+of+Ras+function+in+vivo.">Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo.</a> Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).</li><li>van der Hoeven, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomyelin+Metabolism+Is+a+Regulator+of+K-Ras+Function.">Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function.</a> Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).</li><li>Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gene+lin-1+encodes+an+ETS-domain+protein+and+defines+a+branch+of+the+vulval+induction+pathway.">The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway.</a> Genes &amp; Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+mitochondria+and+diet+mediates+pathogen+and+stress+resistance+in+Caenorhabditis+elegans.">Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).</li><li>Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+human+microbiome+drug+metabolism+by+gut+bacteria+and+their+genes.">Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes.</a> Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).</li><li>Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+EGF+receptor-mediated+vulva+development+by+the+heterotrimeric+G-protein+G-alpha+q+and+excitable+cells+in+C.+elegans.">Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans.</a> Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).</li></ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.

Solucanı kullanarak tarif ettiğimiz tahliller, EGFR ve RAS fonksiyonunun inhibitörlerini tanımlamak için basit ve ucuzdur. C. elegans ilaç keşfi için çekici bir modeldir, çünkü kısa yaşam döngüsü (20 ° C'de 3 gün) ve çok sayıda larva üretme yeteneği nedeniyle laboratuvarda büyümek kolaydır. Daha da önemlisi, EGFR-RAS-ERK MAPK yolu, EGFR ve RAS inhibitörlerinin etkilerini analiz etmek için genetik olarak çekişli bir sistem sağlayan memeliler ile evrimsel ve işlevsel olarak korunur...

Organizmalar içindeki gelişimsel olayları düzenleyen hücresel yollar tüm metazoanlar arasında oldukça korunmuştır. Bu yollardan biri EGFR-RAS-ERK mitojen aktive protein kinaz (MAPK) hücre çoğalması, farklılaşma, göç ve sağkalım1,2yöneten kritik bir yol olan çağlayan sinyaldir. Bu sinyal yollarındaki kusurlar patolojik veya kanser gibi hastalık durumlarına yol açabilir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), oral skuamöz hücreli karsinomların % 50'si de dahil olmak üzere insan tümörlerinde yüksek oranda eksprese edildiğini ve malign tümörlerin gelişimine katkıda bulunduğunu göstermiştir3,4,5. Üç RAS izoformu H-, K ve N-RAS'daki mutasyonlar birden fazla insan kanserinde kötü huylu dönüşümün başlıca iticileridir. Bu üç RAS izoformu arasında, K-RAS'daki onkojenik mutasyonlar en yaygın6,7,8 'dir. EGFR ve RAS'ın çalışması için plazma membranını (PM) lokalize etmeleri gerekir. Bu moleküllerin PM'ye lokalizasyonunu önlemek, bu sinyal yolu9,10'unbiyolojik aktivitesini tamamen yok edebilir. Bu nedenle, bu proteinlerin PM'ye lokalizasyonunun inhibisyonu, aşağı akış sinyalini ve ortaya çıkan olumsuz sonuçları engellemek için terapötik bir stratejidir. Yüksek içerikli bir tarama tahlilleri kullanılarak, L tipi kalsiyum kanal bloker olan fendiline, K-RAS aktivitesinin inhibitörü olarak tanımlanmıştır11. K-RAS'ın PM'nin iç broşürüne nanokütlesi, fendilin varlığında önemli ölçüde azalır. Ayrıca, K-RAS plazma zarından endoplazmik retikülüse (ER), Golgi aparatına, endozomlara ve sitozollere yeniden dağıtılır. Daha da önemlisi, onkojenik mutant K-RAS'ı ifade eden pankreas, kolon, akciğer ve endometriyal kanser hücre hatlarının çoğalması, fendiline11ile aşağı akış sinyalinin inhibisyonu ile engellenir. Bu veriler, fendiline'in RAS proteininin PM'ye yanlış lokalizasyonuna neden olan belirli bir K-RAS antikanser terapötik olarak işlev gösterdiğini göstermektedir.
Nematod Caenorhabditis elegans gelişim bağlamında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Solucandaki gelişimi yöneten sinyal yollarının çoğu evrimsel ve işlevsel olarak korunmuş. Örneğin, RAS'ın EGFR aracılı aktivasyonu ve erk MAPK sinyal basamaklamanın daha sonra etkinleştirilmesi solucan12'de korunur. Basamak aşağıdaki proteinlerle temsil edilir: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 RAS için homolog, LET-23 ise EGFR için homologdur. Solucanda, bu yol vulva gelişimini düzenler13. Vulva, solucanın ventral vücut duvarında döllenmiş yumurtaların döşenmesini sağlayan epitel bir diyaframdır. Solucandaki vulva oluşumu, vulval öncül hücrelerin (VPC) EGFR-RAS-MAPK sinyal basamaklanmasının aktivasyonuna maruz kalmasına bağlıdır. Normal gelişim sırasında, proksimal VPC'ler, fonksiyonel birvulva12'ye yol açan 1° ve 2 ° hücre kaderlerine farklılaşmak için gonadal çapa hücrelerinden güçlü sinyaller alır. Distal VPC'ler hipodermal senkryuma kaynaşan ve tükenmiş sinyaller nedeniyle vulva oluşturmayan 3° hücre kaderlerine farklılık sağlar. Sinyalizasyonun yokluğunda, tüm VPC'ler 3 ° hücre kaderlerine farklılaşarak vulva oluşumuna neden olur. Bununla birlikte, konsitülatif sinyalleme, tüm VPC'lerin 1° ve 2° hücre kaderlerini üstlenme indüksiyonu nedeniyle bir veya daha fazla işlevsel olmayan vulva oluşumuna yol açar.
Bu yolu temsil eden proteinleri kodlayan genlerin birçoğu için kusurlu veya aşırı vulval indüksiyona neden olan mutasyonlar tanımlanmıştır. Kusurlu vulval indüksiyon vulvasız (Vul) bir fenotiple sonuçlanırken, aşırı vulval indüksiyon ventral vücut duvarı boyunca çok sayıda işlevsiz ektopik psödoovulvanın gelişmesiyle temsil edilen multivulva (Muv) fenotip ile sonuçlanır. Let-60(n1046) suşu tarafından ifade edilen Muv fenotipi RAS'daki fonksiyon mutasyonunun kazanıcılığından kaynaklanırken, let-23(sa62) suşunda EGFR14,15'te aktive edici bir mutasyondan kaynaklanmaktadır. Bu mutant suşlarındaki güçlü Muv fenotipinin, let-60(n1046) solucanlarının MEK-1 inhibitörü U0126 16 ,17ile tedavisinde gösterildiği gibi farmakolojik müdahalelerle pertüre olduğu gösterilmiştir. İlginçtir ki, sphingomyelin metabolizmasını etkileyen R-fendilin ve inhibitörlerin solucandaki Muv fenotipini baskıladığını gösterdik18. Bu inhibitörlerin RAS seviyesinde let-60 sinyalini engellediğini göstermek için lin-1 boş suşukullanılmıştır 17. Lin-1, vulva19'ungelişiminde bir baskılayıcı olarak işlev gösteren Ets benzeri bir inhibitör transkripsiyon faktörüdür. Let-60(n1046) solucanlarında Muv fenotipinin güçlü bir şekilde geri çevrilmesi ve lin-1 null solucanlar üzerinde hiçbir etkisi olmaması, bu inhibisyonların RAS düzeyinde gerçekleştiğini göstermektedir.
Bu protokolde, RAS ve EGFR proteinlerinin inhibitörlerini tanımlamak için C. elegans'ın bir model olarak kullanıldığını gösteriyoruz. Sıvı bazlı bir tahlil kullanarak, C. elegans'ın let-60(n1046) ve let-23(sa62) mutant suşlarındaki Muv fenotiplerini bastırarak R-fendilin inhibitör etkilerini gösteriyoruz. Bu test, antikanser terapötikler için ilaç keşfinin ilk aşamasında C. elegans'ın bir araç olarak kullanılmasını doğrulamaz.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Media and chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Millipore Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Agar&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco LB Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138201</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Acros organics</td><td>AC455500050</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium pPhosphate Monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>R-Fendiline</td><td></td><td></td><td>Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Millipore Sigma&amp;nbsp;</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>8.25% Sodium Hypochlorite&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Bleach</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>(&amp;minus;)-Tetramisole Hydrochloride</td><td>Millipore Sigma&amp;nbsp;</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>UO126 (MEK inhibitor)</td><td>Millipore Sigma&amp;nbsp;</td><td>19-147</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>No. 1.5&amp;nbsp; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>12- Well Tissue Culture Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-197-4804</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; OP50</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Worm Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Strain&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Genotype&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Transgene&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Source&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MT2124 &amp;nbsp;</td><td>&lt;em&gt;let-60(n1046) IV.&lt;/em&gt;</td><td></td><td>CGC</td></tr><tr><td>MT7567</td><td>&lt;em&gt;lin-1(sy254) IV.&lt;/em&gt;</td><td></td><td>CGC</td></tr><tr><td>PS1839</td><td>&lt;em&gt;let-23(sa62) II.&lt;/em&gt;</td><td></td><td>CGC</td></tr></tbody></table>

identification of egfr and ras inhibitors using caenorhabditis elegans

Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve aşağı akış efektörü RAS'ın plazma membran lokalizasyonundaki değişiklikler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklara karışmıştır. Serbest yaşayan nematod C. elegans, vulvanın gelişimi için merkezi olan evrimsel ve işlevsel olarak korunmuş bir EGFR-RAS-ERK MAP sinyal kaskadına sahiptir. RAS homolog LET-60 ve EGFR homolog LET-23'te fonksiyon mutasyonlarının kazanılması, bu solucanların ventral vücut duvarı boyunca görünür işlevsiz ektopik psödoovulva üretimine neden olur. Daha önce, bu solucanlardaki multivulval (Muv) fenotipinin küçük kimyasal moleküller tarafından inhibe edildiği gösterilmiştir. Burada, EGFR ve RAS proteinlerinin faaliyetlerini kaldıran inhibitörleri tanımlamak için solucanı sıvı bazlı bir testte kullanma protokolünü açıklıyoruz. Bu tahlilleri kullanarak, K-RAS'ın dolaylı bir inhibitörü olan R-fendiline'in let-60(n1046) ve let-23(sa62) mutant solucanlarında ifade edilen Muv fenotipini baskıladığını gösteriyoruz. Test basit, ucuz, kurulum için zaman alıcı değildir ve antikanser terapötiklerin keşfi için bir başlangıç platformu olarak kullanılabilir.

İlk olarak R-fendiline'in let-60(n1046) mutant suşundaki Muv fenotipini DMSO tarafından tedavi edilen solucanlara kıyasla bastırabildiğini gösteriyoruz. Verilerimiz, R-fendiline'in let-60(n1046) 'daki Muv fenotipini doza bağımlı bir şekilde engelleyebildiğini göstermektedir (Şekil 2A,B). Bununla birlikte, artan R-fendiline konsantrasyonlarına yanıt olarak lin-1 boş mutant suşunda Muv fenotipinin tersine çevrilmemesi gözlenmişti...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Genetik olarak çekilebilir nematod Caenorhabditis elegans, ilaç keşfi için basit ve ucuz bir model olarak kullanılabilir. Burada, RAS ve EGFR proteinlerinin aşağı akış sinyalini engelleyen antikanser terapötiklerini tanımlamak için bir protokol açıklanmıştır.

Caenorhabditis elegans kullanılarak EGFR ve RAS inhibitörlerinin tanımlanması

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

identification-of-egfr-and-ras-inhibitors-using-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

3.0K Görüntüleme.  University of Texas Health Science Center. Genetik olarak çekilebilir nematod Caenorhabditis elegans, ilaç keşfi için basit ve ucuz bir model olarak kullanılabilir. Burada, RAS ve EGFR proteinlerinin aşağı akış sinyalini engelleyen antikanser terapötiklerini tanımlamak için bir protokol açıklanmıştır.

Video: Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Gelişim Biyolojisi

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Genetik

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1</emOtizm> olarak Adaylar

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

Biyoloji

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or identification of new ones can provide invaluable information about the function of a protein of interest. Some of the traditional methods for extract preparation frequently require labor-intensive and time-consuming techniques. Here, a modified extract preparation protocol using a bead mill homogenizer and metal beads is described as a rapid alternative to traditional protein preparation methods. This extract preparation method is compatible with downstream co-immunoprecipitation studies. As an example, the method was used to successfully co-immunoprecipitate&#160;C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 and two known ALG-1 interactors: AIN-1, and HRPK-1. This protocol includes descriptions of animal sample collection, extract preparation, extract clarification, and protein immunoprecipitation. The described protocol can be adapted to test for interactions between any two or more endogenous, endogenously tagged, or overexpressed C. elegans proteins in a variety of genetic backgrounds.

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

This method describes a protocol for high-throughput protein extract preparation from Caenorhabditis elegans samples and subsequent co-immunoprecipitation.

Caenorhabditis elegans'tan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ease of growth and small size. This small size, though, has disallowed a number of technical approaches found in other model systems. For example, blood transfusions in mammalian systems and grafting techniques in plants enable asking questions of circulatory system composition and signaling. The circulatory system of the worm, the pseudocoelom, has until recently been impossible to assay directly. To answer questions of intercellular signaling and circulatory system composition C. elegans researchers have traditionally turned to genetic analysis, cell/tissue specific rescue, and mosaic analysis. These techniques provide a means to infer what is happening between cells, but are not universally applicable in identification and characterization of extracellular molecules. Here we present a newly developed technique to directly assay the pseudocoelomic fluid of C. elegans. The technique begins with either genetic or physical manipulation to increase the volume of extracellular fluid. Afterward the animals are subjected to a vampiric reverse microinjection technique using a microinjection rig that allows fine balance pressure control. After isolation of extracellular fluid, the collected fluid can be assayed by transfer into other animals or by molecular means. To demonstrate the effectiveness of this technique we present a detailed approach to assay a specific example of extracellular signaling molecules, long dsRNA during a systemic RNAi response. Although characterization of systemic RNAi is a proof of principle example, we see this technique as being adaptable to answer a variety of questions of circulatory system composition and signaling.

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The model organism C. elegans uses pseudocoelomic fluid as a passive circulatory system. Direct assay of this fluid has not been previously possible. Here we present a novel technique to directly assay the extracellular space, and use systemic silencing signals during an RNAi response as a proof of principle example.

Dan Ekstrasellüler Akışkan Vampiric İzolasyonu<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

Büyük ölçekli Gen demonte olarak<em&gt; C. elegans</em&gt; Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Oksidatif Stres Direnci Ölçüm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 oyuklu mikrotiter plakalarında

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Caenorhabditis elegans kullanılarak EGFR ve RAS inhibitörlerinin tanımlanması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1 olarak Adaylar

Caenorhabditis elegans'tan Protein Özü Hazırlama ve Eş-immün premobpriktiasyon

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans

Dan Ekstrasellüler Akışkan Vampiric İzolasyonu

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı

Büyük ölçekli Gen demonte olarak

Oksidatif Stres Direnci Ölçüm