Let-60(n1046)을제공한 와티 아루르 박사(MD 앤더슨 암 센터)에게 감사드립니다. 우리는 또한 린 -1 균주에 대한 박사 데이비드 라이너 (휴스턴의 생명 과학 및 기술의 텍사스 A&M 건강 과학 센터 연구소)에 감사드립니다. 마지막으로, 우리는 시약의 일부를 제공 에 대한 박사 다니엘 Garsin과 그녀의 실험실 (텍사스 대학, 맥거번 의과 대학)에 감사드립니다. 일부 웜 균주는 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40 OD010440)에 의해 투자되는 CGC에 의해 제공되었다. 이 연구는 JF 핸콕에 RP200047을 부여 텍사스의 암 예방 및 연구소 (CPRIT)에 의해 지원되었다.

1. 선충 성장 매체 (NGM) 플레이트 준비
<ol><li>2L 에렌마이어 플라스크에 포함된 970mL의 디온화 된 물에 펩톤 2.5 g와 NaCl 3 g을 추가합니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 내용물들을 저어줍니다. 그 후 플라스크에 20g의 한고를 넣습니다. 플라스크의 내용내용은 121°C에서, 30분 동안 15파운드/in2의 압력을 가한다. 살균 후 플라스크를 교반판에 놓고 온도가 50°C에 도달할 때까지 매체를 식힙니다.</li>
	<li>NGM 플레이트를 준비하기 위해 냉각 된 매체에 다음 시약을 추가 : 1 M 칼륨 인산염 버퍼 (pH = 6.0),1 mL의 1 mL4,1 M CaCl2의1 mL, 1 mL (95 % 에탄올에서 5 mg / mL) 콜레스테롤, 1 mL의 (에탄올에서 10% v/w) nystatin, 그리고 1 mL 의 25 mg/mL 연쇄 절제술.</li>
	<li>라미나르 의 흐름 아래, 60mm x 15mm 멸균 페트리 접시에 냉각 된 매체를 부어. 플레이트가 2시간 동안 굳어지게 합니다. 이 플레이트는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>2. C. 예인자의 전파
<ol><li>하룻밤 재배된 대장균 OP50의 100 μL을 각 NGM 플레이트의 중앙에 점하고 라미나르 후드에서 플레이트가 24시간 동안 건조되도록 합니다. 이어서, 플레이트는 폴리스티렌 용기에 보관할 수 있다. 참고: 대장균 OP50 배양은 플레이트의 파종 전에 37°C 배지에서루리아-베르타니(LB) 배지에서 재배된다. 배양은 1-2 개월 동안 4 °C에서 저장하고 플레이트의 주기적인 파종에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>멸균 벌레 선택을 사용하여 이전에 재배한 판에서 10-12개의 중력성 성웜을 해부하는 현미경으로 수집합니다. 이러한 웜을 대장균 OP50으로 시드된 신선한 NGM 플레이트로 옮기고 20°C에서 24시간 동안 플레이트를 배양한다.</li>
	<li>24 시간 후, 멸균 웜 픽을 사용하여 접시에서 성인 웜을 제거합니다. ~ 3 일 동안 20 °C에서 플레이트를 배양합니다. 배아는 중력 성동물 벌레로 발전할 것입니다.</li>
</ol>3. 동기 C. 예인선 문화의 준비
<ol><li>M9W로 2-4 플레이트를 세척하여 15mL 원상 관에 중력 성 웜을 수집합니다.<ol>
<li>M9W의 제제: NaCl 5g, Na2HPO46g, KH2PO4 3g을 1L. Autoclave의 최종 부피로 121°C의 최종 부피로 용액을 15lb/in2의 압력으로 30분 동안 용해한다. 냉각된 용액에 1M MgSO4의 1mL를 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 분 동안 450 x g에서 튜브를 원심분리하여 벌레를 펠렛. 웜 펠릿을 방해하지 않고 상류제를 장식합니다.</li>
	<li>8.25%의 염화나트륨(가정용 표백제)의 400 μL과 5N NaOH의 100 μL을 결합하여 웜 용액을 준비한다. 이 솔루션을 웜 펠릿에 추가하고 튜브의 내용을 혼합하기 위해 튜브를 쓸어 넘깁니다. 해부 현미경의 밑에 벌레의 lysis를 관찰하여 관에 있는 태아의 과표백을 방지합니다.</li>
	<li>성인 웜의 70%가 lysed경우 리시스 믹스를 희석하기 위해 원문 튜브에 10mL의 M9W를 추가합니다.</li>
	<li>튜브를 450 x g에서 1 분 동안 원심 분리합니다. 상체를 M9W의 10mL로 교체하십시오.</li>
	<li>3.5 단계를 두 번 반복합니다.</li>
	<li>세척 단계를 완료한 후 3-5mL의 M9W를 추가하여 달걀 펠릿을 다시 놓습니다. 실온(RT)에서 튜브 회전기에서 18rpm의 속도로 하룻밤 동안 튜브를 회전합니다.</li>
	<li>하룻밤 동안 배양 후 회전기에서 튜브를 제거하고 L1 애벌레를 원심분리하여 튜브를 1 분 동안 450 x g로 원심분리합니다. 250 μL이 튜브에 남아있을 때까지 M9W를 흡인합니다.</li>
	<li>튜브를 흔들어 애벌레를 다시 보냅니다. 페트리 접시 뚜껑에 애벌레가 들어 있는 5μL 방울 3방울을 넣습니다. 해부 현미경을 사용하여 각 낙하의 웜 수를 계산하고 1 μL의 웜 수를 결정합니다.</li>
</ol>4. 약물 검사 준비
참고: 이 분석의 단계는 그림 1에표시됩니다.
<ol><li>150 rpm에서 궤도 셰이커에서 하룻밤 동안 37 °C에서 50 mL 원문 튜브에서 대장균 OP50의 30 mL성장.</li>
	<li>하룻밤 동안 성장 한 대장균 OP50 배양을 4,000 x g에서 10 분 동안 세포에 펠릿하십시오. 상체를 제거하고 M9W의 3mL에서 펠릿을 재놓아 문화를 집중한다.</li>
	<li>약물 분석에 대한 작업 용액을 준비하기 전에 M9W의 100 mL에 콜레스테롤 (95 % 에탄올에서 5 mg / mL) 콜레스테롤의 0.1 mL을 추가하십시오.</li>
	<li>각 약물 플러스 차량(디메틸 설프리산화물)을 희석하여 각 실험 약물의 작업 용액을 준비합니다. DMSO) 4.8 mL M9W에서 적절한 농도를 얻기 위해 콜레스테롤을 보충하였다. DMSO를 M9W 의 4.8mL에 녹여 차량 제어를 준비하도록 콜레스테롤을 보충합니다.</li>
	<li>200 μL의 집중 된 대장균 OP50 배양을 차량 제어 또는 약물 및 소용돌이 튜브를 포함하는 각 튜브에 추가하여 혼합되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>실험을 수행하기 위해, 12웰 조직 배양 플레이트에 각 작업 약물 용액 또는 차량 제어의 2mL을 각 우물에 추가한다. 각 약물 농도 및 차량 제어를 복제하여 테스트합니다.</li>
	<li>멸균 마이크로파이프를 사용하여 우물당 ~100 L1 애벌레를 추가합니다(동기 C. 예르간 배양 단계 참조). 웜의 부피를 10μL로 제한합니다.</li>
	<li>플레이트를 20°C에서 배양합니다.</li>
	<li>필요한 경우 분석 3일째에 10배 농축 대장균 OP50의 50μL을 보충합니다.</li>
</ol>5. 현미경 검사법을 위한 아가로즈 패드 준비
<ol><li>5mL의 해수에서 아가로즈 0.1g을 용해하여 아가로즈의 2%w/v 용액을 준비한다. 내용물들을 전자레인지에 가열하여 아가로즈를 녹입니다. 아가로즈 용액의 5mL로부터 20개의 슬라이드를 준비할 수 있습니다.</li>
	<li>두 개의 유리 슬라이드를 따라 실험실 테이프 스트립을 배치합니다. 테이프는 아가로즈 패드의 두께를 제한하는 스페이서 역할을합니다. 그 후, 녹화 된 슬라이드 사이에 세 번째 깨끗한 유리 슬라이드를 배치합니다.</li>
	<li>아가로즈 패드를 만들려면, 깨끗한 슬라이드의 중앙에 녹은 아가로즈 100 μL을 발견하십시오. 아가로즈 를 가로질러 내려와 서서히 눌러 패드를 형성합니다. 패드가 고형화되면 상단 슬라이드를 제거합니다.</li>
</ol>6. 렛-60, 렛-23 및 린-1 균주에서 무브 표현형 의 관찰
참고: LET-23 및 let-60 균주에서 Muv 표현형을 억제하는 후보 약물만 lin-1 균주를 사용하여 분석하여 억제가 RAS 또는 EGFR 수준에서 발생하는지 여부를 결정합니다.
<ol><li>수명 주기의 적절한 단계에 도달하면 (let-60 및 let-23 균주에 대한 3 일, 린 -1 균주에 대한 5 일), 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 파이펫을 사용하여 15mL 원물 튜브에서 웜을 수집합니다.</li>
	<li>원심 분리튜브를 450 x g에서 1분 동안 제거합니다.</li>
	<li>6.2 단계를 두 번 반복합니다.</li>
	<li>웜 펠릿을 방해하지 않고, 포부로 남아있는 모든 M9W를 제거하십시오. 그 후, 2mM 나트륨 아지드 또는 2m 테트라미솔 염산염의 500 μL을 추가합니다. 튜브가 15 분 동안 RT에서 배양 할 수 있도록. 2 mM 나트륨 아지드 또는 2 mM 테트라미솔 염산염은 이미징을 위해 벌레를 마취합니다. 주의: 나트륨 아지드를 취급할 때 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 용액은 화학 후드 아래에 준비해야합니다.</li>
	<li>마취된 벌레 서스펜션의 10 μL을 아가로즈 패드 중앙에 추가합니다. #1.5 커버슬립을 웜 서스펜션 위에 부드럽게 놓습니다. 필요한 경우, 건조를 방지하기 위해 몇 가지 매니큐어로 커버 슬립을 수정합니다.</li>
	<li>DIC 현미경을 사용하여 let-60(n1046)및 let-23(sa62) 및 lin-1(sy254) 균주를 관찰한다. 10배 및 20배 배율로 웜을 이미지화합니다.</li>
	<li>let-60(n1046) 및 let-23(sa62)의 경우, Muv 표현형의 존재 또는 부재에 따라 성인 웜을 점수. lin-1 스트레인의 경우 고해상도 DIC 현미경을 사용하여 L4 애벌레의 복부 측에 1° 또는 2° 셀 운명을 채택한 VPC 수를 계산합니다.</li>
	<li>각 균주와 약물 치료에 대한 현미경 검사를 받은 후 학생의 t-테스트를수행하여 치료 간의 통계적 차이를 결정합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

우리가 벌레를 사용하여 설명하는 소사는 EGFR 및 RAS 기능의 억제제를 확인하기 위하여 간단하고 저렴합니다. C. elegans는 짧은 수명 주기(20°C에서 3일)와 많은 수의 애벌레를 생성하는 능력으로 인해 실험실에서 쉽게 성장할 수 있기 때문에 약물 발견을 위한 매력적인 모델이다. 더 중요한 것은, EGFR-RAS-ERK MAPK 통로는 EGFR 및 RAS 억제제의 효력을 분석하기 위하여 유전으로 기관시스템을 제공하?...

유기체 내의 발달 사건을 통제하는 세포 통로는 모든 메타조인 사이에서 높게 보존됩니다. 이러한 경로 중 하나는 EGFR-RAS-ERK 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 신호 캐스케이드이며 세포 증식, 분화, 이주 및 생존1,2를제어하는 중요한 통로이다. 이 신호 통로에 있는 결점은 암과 같은 병리학 또는 질병 국가로 이끌어 낼 수 있습니다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 구강 편평상피 세포 암종의 50%를 포함하여 인간 종양에서 높게 발현되는 것으로 나타났으며, 악성 종양3,4,5의발달에 기여한다. 3개의 RAS 동위상체에 있는 돌연변이는 H-, K-및 N-RAS는 다중 인간적인 암에 있는 악성 변환을 위한 중요한 동인인 인 반면. 이 세 가지 RAS 동소 형태 중, K-RAS의 종양 발생 돌연변이는가장널리 퍼진6,7,8. EGFR과 RAS가 작동하려면 플라즈마 멤브레인(PM)으로 국한되어야 합니다. PM에 이러한 분자의 국소화를 방지하면 이 신호 경로9,10의생물학적 활성을 완전히 부정할 수 있다. 따라서 PM에 이러한 단백질의 국소화의 억제는 다운스트림 신호 및 결과 불리 한 결과 차단 하는 치료 전략. 고함량 스크리닝 분석법을 사용하여 L형 칼슘 채널 차단제인 펜딜린(fendiline)은 K-RAS활동(11)의억제제로 확인되었다. K-RAS의 나노 클러스터링은 펜딜린의 존재에서 PM의 내부 전단지에 크게 감소된다. 더욱이, K-RAS는 혈장 막에서 내피성 망상(ER), 골기 장치, 내시경 및 사이토솔로 재분배된다. 더 중요한 것은, 종양유발 돌연변이 K-RAS를 발현하는 췌장, 결장, 폐 및 자궁내막암 세포주의의 증식은펜딜린(11)에의한 하류 신호의 억제에 의해 차단된다. 이러한 데이터는 PM에 RAS 단백질의 잘못된 국소화를 일으키는 특정 K-RAS 항암 치료제로서 펜딜린 기능을 제안합니다.
선충 케노르하비티스 엘레간은 개발의 맥락에서 광범위하게 연구되었습니다. 웜의 발달을 지배하는 많은 신호 경로는 진화적이고 기능적으로 보존됩니다. 예를 들어, EGFR은 RAS의 활성화를 중재하고 ERK MAPK 신호 캐스케이드의 후속 활성화는웜(12)에보존된다. 폭포는 다음과 같은 단백질에 의해 표현된다: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60은 RAS에 동종이며 LET-23은 EGFR에 동종입니다. 웜에서, 이 통로는외음부(13)의발달을 조절한다. 외음부는 수정란을 낳을 수 있도록 벌레의 복부 바디 월의 상피 조리개입니다. 웜내외음부의 형성은 EGFR-RAS-MAPK 신호 캐스케이드의 활성화의 그라데이션에 대한 저속 전구체 세포(VPC)의 노출에 의존한다. 정상 발달 동안 근위 VP는 고나달 앵커 셀로부터 강력한 신호를 수신하여 기능성외음부(12)를야기하는 1° 및 2° 세포 운명으로 분화한다. 탈매 한 VPCs는 피하 싱크티움에 융합하고 고갈 된 신호로 인해 외음부를 형성하지 않는 3 ° 세포 운명으로 분화하는 반면. 신호가 없는 경우 모든 VP는 3° 셀 운명으로 분화하여 외음부가 형성되지 않습니다. 그러나, 구성 신호는 1° 및 2° 세포 운명을 가정하기 위해 모든 VP의 유도로 인해 하나 이상의 비기능 외음부 형성으로 이어집니다.
결함이 있거나 과도한 저속 유도를 일으키는 돌연변이는 이 통로를 나타내는 단백질을 위해 인코딩하는 많은 유전자를 위해 확인되었습니다. 결함이 있는 저속 유도는 외음부(Vul) 표현형을 초래하며, 과도한 저속 유도는 복부 바디 월 전체에 걸쳐 수많은 비기능성 외투성 의사 외음부의 발달로 표현되는 다발음부(Muv) 표현형을 초래한다. let-60(n1046) 균주에 의해 발현된 Muv 표현형은 RAS에서 기능 돌연변이의 이득에 기인하며, let-23(sa62) 균주에서는 EGFR14,15에서돌연변이를 활성화하기 때문이다. 이러한 돌연변이 균주에서 의 강한 Muv 표현형은 MEK-1 억제제 U012616,17을가진 let-60(n1046) 웜의 치료에 의해 입증된 바와 같이 약리학적 개입에 의해 교반되는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 우리는 스핑크고미엘린 대사에 영향을 미치는 R-펜딜린 및 억제제가벌레(18)의Muv 표현형을 억제한다는 것을 보여주었다. 이러한 억제제 블록 let-60 을 RAS 수준에서 시그널링하는 것을 입증하기 위해 lin-1 null 균주는17을활용하였다. Lin-1은외음부(19)의발달에서 억압자로 기능하는 Ets와 같은 억제 전사 인자이다. let-60(n1046) 웜에서 Muv 표현형의 강력한 복귀와 lin-1 null 웜에 미치는 영향은 이러한 억제가 RAS 수준에서 발생한다는 것을 시사한다.
이 프로토콜에서, 우리는 RAS와 EGFR 단백질의 억제제를 확인하기 위한 모형으로 C. elegans의 사용을 보여줍니다. 액체 계 분석법을 이용하여, 우리는 Let-60(n1046) 및 Let-23(sa62) C. elegans의돌연변이 균주에서 Muv 표현형을 억제함으로써 R-fendiline의 억제 효과를 입증한다. 이 분석은 항암 치료제에 대한 약물 발견의 초기 단계에서 도구로 C. elegans의 사용을 검증합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media and chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Agar&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0145-17-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0446-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10138201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>AC455500050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium pPhosphate Monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Fendiline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.25% Sodium Hypochlorite&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(&#8722;)-Tetramisole Hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UO126 (MEK inhibitor)</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>19-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 1.5&#160; 18 mm X 18 mm Cover Slips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12- Well Tissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-197-4804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td>Genotype</td>
			<td>Transgene</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT2124 &#160;</td>
			<td>let-60(n1046) IV.</td>
			<td></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MT7567</td>
			<td>lin-1(sy254) IV.</td>
			<td></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS1839</td>
			<td>let-23(sa62) II.</td>
			<td></td>
			<td>CGC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of egfr and ras inhibitors using caenorhabditis elegans

표피 성장 인자 수용체(EGFR)와 다운스트림 이펙터 RAS의 혈장 막 국소화의 변화는 암을 포함한 여러 질병에 연루되어 있다. 자유 살아있는 선충 C. elegans는 외음부의 발달을 위한 중심인 진화적이고 기능적으로 보존된 EGFR-RAS-ERK MAP 신호 폭포를 가지고 있습니다. RAS homolog LET-60 및 EGFR homolog LET-23에서 기능 돌연변이의 이득은 이러한 웜의 복부 바디 월을 따라 눈에 보이는 비기능성 외투 성 의사 물음부의 생성을 유도한다. 이전에는 이러한 웜에서 다발성(Muv) 표현형이 작은 화학 분자에 의해 억제되는 것으로 나타났다. 여기서 우리는 EGFR 및 RAS 단백질의 활동을 폐지하는 억제제를 확인하기 위해 액체 기반 분석에서 웜을 사용하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 분석법을 사용하여, 우리는 R-fendiline, K-RAS의 간접 억제제를 보여주고, let-60 (n1046) 및 let-23 (sa62) 돌연변이 벌레에 표현된 Muv 표현형을 억제합니다. 분석은 간단하고 저렴하며 설정에 시간이 많이 걸리지 않으며 항암 치료제의 발견을위한 초기 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

우리는 먼저 R-펜딜린이 DMSO 처리 된 웜에 비해 let-60 (n1046) 돌연변이 균주에서 Muv 표현형을 억제 할 수 있음을 입증한다. 우리의 데이터는 R-fendiline이 용량 의존적 방식으로 let-60(n1046)에서 Muv 표현형을 차단할 수 있음을보여줍니다(그림 2A, B). 그러나, Muv 표현형의 비반전은 R-fendiline(도2B)의농도 증가에 대응하여 린-1 널 ?...

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Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

유전적으로 통할 수 있는 선충성 Caenorhabditis elegans는 약물 발견을 위한 간단하고 저렴한 모델로 사용될 수 있습니다. 여기에 설명된 RAS 및 EGFR 단백질의 하류 신호를 억제하는 항암 치료제를 식별하는 프로토콜이 있다.

Caenorhabditis elegans를 사용하여 EGFR 및 RAS 억제제의 식별

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

identification-of-egfr-and-ras-inhibitors-using-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

2.9K 조회수.  University of Texas Health Science Center. 유전적으로 통할 수 있는 선충성 Caenorhabditis elegans는 약물 발견을 위한 간단하고 저렴한 모델로 사용될 수 있습니다. 여기에 설명된 RAS 및 EGFR 단백질의 하류 신호를 억제하는 항암 치료제를 식별하는 프로토콜이 있다.

비디오: Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

병변 식별을위한 유선 절개 전체 장착

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

연구

암 연구학

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis and to identify novel therapeutic targets. To investigate molecular events that drive the progression from primary cancer to metastasis, we have developed a bitransgenic mouse model, RIP-Tag; RIP-tva. In this mouse model, the rat insulin promoter (RIP) drives the expression of the SV40 T antigen (Tag) and the receptor for subgroup A avian leukosis virus (tva) in pancreatic &#946; cells. The mice develop pancreatic neuroendocrine tumors with 100% penetrance through well-defined stages that are similar to human tumorigenesis, with stages including hyperplasia, angiogenesis, adenoma, and invasive carcinoma. Because RIP-Tag; RIP-tva mice do not develop metastatic disease, genetic alterations that promote metastasis can be identified easily. Somatic gene transfer into tva-expressing, proliferating pancreatic &#946; premalignant lesions is achieved through intracardiac injection of avian retroviruses harboring the desired genetic alteration. A titer of &#62;1 x 108 infectious units per ml is considered appropriate for in vivo infection. In addition, avian retroviruses can infect cell lines derived from tumors in RIP-Tag; RIP-tva mice with high efficiency. The cell lines can also be used to characterize the metastatic factors. Here we demonstrate how to utilize this mouse model and cell lines to assess the functions of candidate genes in tumor metastasis.

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

We present a protocol to demonstrate a novel somatic gene transfer system utilizing RIP-Tag; RIP-tva mouse model to study the function of genes in metastasis. The avian retroviruses are delivered intracardiacally to ensure gene transfer into pre-malignant, noninvasive lesions of pancreatic &#946; cells in adult mice.

식별 및 태그-소설 RIP;으로 유전자 이동에 의해 전이성 요인의 특성 RIP-tva Murine 모델

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to overcome this challenge. Here, a 2-step dose-escalation method for establishing dual-resistance to an epidermal growth factor receptor (EGFR)-tyrosine kinase inhibitor (TKI), gefitinib, and a MET-TKI, PHA665752, is described. This method is based on simple stepwise dose-escalation of inhibitors for inducing acquired resistance in cell lines. The alternate method for generating resistant sublines involves exposing the cells to high concentrations of the inhibitor in one step. The stepwise dose-escalation method has a higher possibility of successfully inducing acquired resistance than this method. Activating EGFR mutations are biomarkers of a response to treatment with EGFR-TKI, which is an applied first-line treatment for non-small cell lung cancers (NSCLC) that harbor these mutations. However, despite reports of effective responses, the use of EGFR-TKI is limited because tumors inevitably acquire resistance. The major mechanisms behind EGFR-TKI resistance include a secondary mutation at the gatekeeper site, T790M in exon 20 of EGFR, and a bypass signal of MET. Thus, a potential solution for this issue would be a combination of EGFR-TKI and MET-TKI. This combined treatment has been shown to be effective in an in vitro study model. Acquired gefitinib-resistance was established through MET-amplification by stepwise dose-escalation of gefitinib for 12 months, and a cell line named PC-9MET1000 was generated in a previous study. To further investigate the mechanisms of acquired MET-TKI and EGFR-TKI resistance, a MET-TKI, PHA665752, was administered to these cells with stepwise dose-escalation in the presence of gefitinib for 12 months. This protocol has also been successfully applied for a number of combination therapies to establish acquired resistance to other inhibitor molecules.

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

An in vitro method for establishing dual resistance to an EGFR-TKI and a MET-TKI in cancer cells is described. This method is useful for developing treatments for patients with EGFR-mutations, who exhibit disease progression despite EGFR-TKI treatment with MET-amplification. It can also be modified for inhibitors targeting other molecules.

폐 선 암 세포에서 생체 외에서 2 단계 복용량 단계적 확대 절차와 EGFR TKI와 만난 TKI 듀얼 저항 설정

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Identification of OTX1 and OTX2 As Two Possible Molecular Markers for Sinonasal Carcinomas and Olfactory Neuroblastomas

OTX homeobox (HB) genes are expressed during embryonic morphogenesis and during the development of olfactory epithelium in adult organisms. Mutations occurring in these genes are often related to tumorigenesis in human. No data are available today regarding the possible correlation between OTX genes and tumors of the nasal cavity. The aim of this work is to understand if OTX1 and OTX2 can be considered as molecular markers in the development of nasal tumors. We selected nasal and sinonasal adenocarcinomas to investigate the expression of OTX1 and OTX2 genes through immunohistochemical and real-time PCR analyses.Both OTX1 and OTX2 were absent in all the samples of sinonasal Intestinal-Type Adenocarcinomas (ITACs). OTX1 mRNA was identified only in Non-Intestinal Type Adenocarcinomas (NITACs) while OTX2 mRNA was expressed only in Olfactory Neuroblastomas (ONs). We have demonstrated that the differential gene expression for both OTX1 and OTX2 genes might be a useful molecular marker to distinguish the different types of sinonasal tumors.

Homeobox genes are regulatory genes often associated with tumors in the adult organisms. We investigated their comparative expression by immunohistochemical and real-time PCR analysis, in normal and inflammatory nasal mucosae and in sinonasal neoplasms in order to use them as possible diagnostic and therapeutic targets.

Sinonasal Carcinomas과 후 각 Neuroblastomas에 대 한 두 가지 가능한 분자 마커로 OTX1 OTX2의 식별

OTX homeobox (HB) genes are expressed during embryonic morphogenesis and during the development of olfactory epithelium in adult organisms. Mutations ...

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates approaching 85% are common. Unfortunately, patients often become refractory to the treatment by altering their signal transduction pathways. An implementation of the expression profiling with microarrays can identify the overall mRNA-level changes, and proteomics can identify the overall changes in protein levels or can identify the proteins involved, but the activity of the signal transduction pathways can only be established by interrogating post-translational modifications of the proteins. As a result, the ability to identify whether a drug treatment is successful or whether resistance arose, or the ability to characterize any alterations in the signaling pathways, is an important clinical challenge. Here, we provide a detailed explanation of antibody arrays as a tool which can identify system-wide alterations in various post-translational modifications (e.g., phosphorylation). One of the advantages of using antibody arrays includes their accessibility (an array does not require either an expert in proteomics or costly equipment) and speed. The availability of arrays targeting a combination of post-translational modifications is the primary limitation. In addition, unbiased approaches (phosphoproteomics) may be more suitable for the novel discovery, whereas antibody arrays are ideal for the most widely characterized targets.

Here, we present a protocol for antibody arrays to identify alterations in signaling pathways in various cellular models. These changes, caused by drugs/hypoxia/ultra-violet light/radiation, or by overexpression/downregulation/knockouts, are important for various disease models and can indicate whether a therapy will be effective or can identify mechanisms of drugs resistance.

항 체 배열에 의해 신호 변환 통로의 심문에 의해 Tyrosine Kinase 억제제에 평가

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

식별, 조직학 특성화 및 체 외 3D 회전 타원 체 문화 모델에 대 한 마우스 전립선 돌출부의 해 부

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and invasive potential of cancer cells, and consequently the metastatic spread of disease, are being discovered and considered as complementary treatments in highly invasive cancers such as gliomas. Thus, generating data enabling the detailed analyses of cells in a 3D environment following the addition of a drug is required. The methodology described here, combining spheroid invasion assays with high-resolution image capture and data analysis by confocal laser scanning microscopy (CLSM), enabled detailed characterization of the effects of the potential anti-migratory inhibitor MI-192 on glioma cells. Spheroids were generated from cell lines for invasion assays in low adherent 96-well plates and then prepared for CLSM analysis. The described workflow was preferred over other commonly used spheroid-generating techniques due to both ease and reproducibility. This, combined with the enhanced image resolution attained by confocal microscopy compared to conventional wide-field approaches, allowed the identification and analysis of distinct morphological changes in migratory cells in a 3D environment following treatment with the migrastatic drug MI-192.

The effects of migrastatic inhibitors on glioma cancer cell migration in three-dimensional (3D) invasion assays using a histone deacetylase (HDAC) inhibitor are characterized by high-resolution confocal microscopy.

고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3D 종양 스페로이드 침습에 대한 Migrastatic 억제제의 특성화

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

히스톤 아세틸트랜스퍼효소 억제제 검증을 위한 아세서

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase (RTK)-driven cell signaling, promoting cell survival and proliferation. In addition, SHP2 is recruited by immune check point receptors to inhibit B and T cell activation. Aberrant SHP2 function has been implicated in the development, progression, and metastasis of many cancers. Indeed, small molecule SHP2 inhibitors have recently entered clinical trials for the treatment of solid tumors with Ras/Raf/ERK pathway activation, including tumors with some oncogenic Ras mutations. However, the current class of SHP2 inhibitors is not effective against the SHP2 oncogenic variants that occur frequently in leukemias, and the development of specific small molecules that target oncogenic SHP2 is the subject of current research. A common problem with most drug discovery campaigns involving cytosolic proteins like SHP2&#160;is that the primary assays that drive chemical discovery are often in vitro assays that do not report the cellular target engagement of candidate compounds. To provide a platform for measuring cellular target engagement, we developed both wild-type and mutant SHP2 cellular thermal shift assays. These assays reliably detect target engagement of SHP2 inhibitors in cells. Here, we provide a comprehensive protocol of this assay, which provides a valuable tool for the assessment and characterization of SHP2 inhibitors.

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 PTPN11 Phosphatase Inhibitors

The ability to assess target engagement by candidate inhibitors in intact cells is crucial for drug discovery. This protocol describes a 384 well format cellular thermal shift assay that reliably detects cellular target engagement of inhibitors targeting either wild-type SHP2 or its oncogenic variants.

SHP2(PTPN11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...