Name: co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs at JoVE.com

Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) hibesi BE1911/8-1'e, LOEWE projesi GLUE'ya ve işbirlikçi araştırma merkezi Transport and Communication across Membranes'a (SFB807) finansal destek için teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+strategies+for+protein+production+and+purification+enabling+membrane+protein+structural+biology.">Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).</li><li>Ritchie, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs.</a> Methods in Enzymology. 464 (09), 211-231 (2009).</li><li>Frauenfeld, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lipoprotein+nanoparticle+system+for+membrane+proteins.">A novel lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins.</a> Nature Methods. 13 (4), 345-351 (2016).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+stability+can+be+compromised+by+detergent+interactions+with+the+extramembranous+soluble+domains.">Membrane protein stability can be compromised by detergent interactions with the extramembranous soluble domains.</a> Protein Science. 23 (6), 769-789 (2014).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Junge, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-free+protein+synthesis+for+the+functional+and+structural+analysis+of+membrane+proteins.">Advances in cell-free protein synthesis for the functional and structural analysis of membrane proteins.</a> New Biotechnology. 28 (3), (2011).</li><li>Smolskaya, S., Logashina, Y. A., Andreev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+extract-based+cell-free+expression+system+as+an+alternative+for+difficult-to-obtain+protein+biosynthesis.">Escherichia coli extract-based cell-free expression system as an alternative for difficult-to-obtain protein biosynthesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (928), 1-21 (2020).</li><li>Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+discoidal+phospholipid+bilayer+nanoparticles+with+membrane+scaffold+proteins.">Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins.</a> Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).</li><li>Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+expression:+no+cells+required.">Membrane protein expression: no cells required.</a> Trends in Biotechnology. 27 (8), 455-460 (2009).</li><li>Roos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+co-translationally+formed+nanodisc+complexes+with+small+multidrug+transporters,+proteorhodopsin+and+with+the+E.+coli+MraY+translocase.">Characterization of co-translationally formed nanodisc complexes with small multidrug transporters, proteorhodopsin and with the E. coli MraY translocase.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1818 (12), 3098-3106 (2012).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodelivery+of+a+functional+membrane+receptor+to+manipulate+cellular+phenotype.">Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-translational+approaches+for+producing+mammalian+receptors:+expanding+the+cell-free+expression+toolbox+using+nanolipoproteins.">Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins.</a> Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).</li><li>Rues, R. B., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+formation+and+pharmacological+characterization+of+beta1-adrenergic+receptor/nanodisc+complexes+with+different+lipid+environments.">Co-translational formation and pharmacological characterization of beta1-adrenergic receptor/nanodisc complexes with different lipid environments.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1858 (6), 1306-1316 (2016).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+native+membrane+protein+assembly+in+nanodiscs+by+combined+non-covalent+mass+spectrometry+and+synthetic+biology.">Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology.</a> eLife. 6, 1-19 (2017).</li><li>Harris, N. J., Pellowe, G. A., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+tools+to+study+co-translational+folding+of+alpha+helical+membrane+transporters.">Cell-free expression tools to study co-translational folding of alpha helical membrane transporters.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+requirements+for+the+enzymatic+activity+of+MraY+translocases+and+in+vitro+reconstitution+of+the+lipid+II+synthesis+pathway.">Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).</li><li>Peetz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+co-translational+membrane+protein+insertion+by+combined+LILBID-mass+spectrometry+and+NMR+spectroscopy.">Insights into co-translational membrane protein insertion by combined LILBID-mass spectrometry and NMR spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12314-12318 (2017).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1-2), 63-68 (2004).</li><li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+scale+expression+of+membrane+proteins+in+Escherichia+coli-based+continuous+exchange+cell-free+systems.">Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).</li><li>Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+a+functional+G+protein-coupled+receptor+complexed+with+nanometer+scale+bilayer+discs.">Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs.</a> BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).</li><li>Rues, R. B., Dong, F., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+optimization+of+cell-free+synthesized+human+endothelin+B+receptor+folding.">Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding.</a> Methods. 147 (1), 73-83 (2018).</li><li>Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., D&#246;tsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+organic+cation+transporter+1+contains+three+binding+sites+for+substrate+1-methyl-4-phenylpyridinium+per+monomer.">Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer.</a> Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).</li><li>Matthies, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+and+assembly+of+ATP+synthase.">Cell-free expression and assembly of ATP synthase.</a> Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).</li><li>Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+profiling+of+E.+coli+inner+membrane+proteins.">Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins.</a> Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).</li><li>Haberstock, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+to+increase+the+efficiency+of+membrane+protein+production+in+cell-free+expression+systems.">A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems.</a> Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).</li><li>Falkinham, J. O., Clark, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+a+double+male+strain+of+Escherichia+coli+K12.">Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12.</a> Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).</li><li>Foshag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E.+coli+S30+lysate+proteome:+A+prototype+for+cell-free+protein+production.">The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production.</a> New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).</li><li>Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+the+gene+for+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (7), 2035-2039 (1984).</li><li>Reckel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+cell-free+expression+of+membrane+proteins.">Strategies for the cell-free expression of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Baas, B. J., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperativity+in+cytochrome+P450+3A4:+Linkages+in+substrate+binding,+spin+state,+uncoupling,+and+product+formation.">Cooperativity in cytochrome P450 3A4: Linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (10), 7066-7076 (2007).</li><li>Scholz, O., Thiel, A., Hillen, W., Niederweis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+gene+expression+with+an+improved+green+fluorescent+protein.">Quantitative analysis of gene expression with an improved green fluorescent protein.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (6), 1565-1570 (2000).</li><li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+to+function+cell-free+electrophysiological+and+optical+analysis+of+ion+pumps+in+nanodiscs.">From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).</li><li>Shen, H. H., Lithgow, T., Martin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+model+membranes:+Seeking+better+ways+to+retain+protein+activities.">Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

CF ekspresyonunu optimize etmek için kurulum ve stratejiler ve fonksiyonel milletvekillerinin nanodisklere birlikte translasyonel olarak yerleştirilmesi açıklanmaktadır. Gerekli ekipman bir biyoreaktör, bir Fransız pres cihazı veya benzeri, bir UV / VIS ve floresan okuyucu, iki bölmeli bir konfigürasyon kurulumu için uygun CF reaksiyon kapları ve sıcaklık kontrollü bir inkübatörden oluşur. Diğer standart ekipmanlar, E. coli hücrelerinin toplanması için santrifüjlerin yanı sıra S30 lizatl...

Membran proteinleri (MPS), sulu ortamlarda çözünmemeleri nedeniyle protein üretim çalışmalarında zorlu hedeflerdir. Geleneksel MP üretim platformları, E. coli, maya veya ökaryotik hücreler gibi hücre tabanlı sistemlerden oluşur. Sentezlenen rekombinant milletvekilleri ya hücre zarlarından ekstrakte edilir ya da inklüzyon cisimciklerinden yeniden katlanır1. Deterjan çözünürlüğünden sonra milletvekilleri, in vitro sulandırma protokolleri oluşturularak uygun membran ortamlarına aktarılabilir. Veziküller ve lipozomların yanı sıra, nanodiskler2 veya salipro3 parçacıkları şeklinde düzlemsel membranlara MP resuentasyonu son zamanlarda rutin teknikler haline gelmiştir. Bununla birlikte, tüm bu stratejiler, milletvekilleriyle deterjan temasının istikrarsızlaşmaya, oligomerlerin ayrışmasına ve hatta protein yapısının ve aktivitesinin kaybına neden olabileceği anlamınagelir 4. Bu nedenle optimum deterjan çözünürlüğü ve sulandırma koşullarının taranması sıkıcı ve zaman alıcı olabilir5.
Hücresiz (CF) sistemlerin açık doğası, ekspresyon reaksiyonunun, tanımlanmış bir lipit bileşimine sahip önceden oluşturulmuş membranlarla doğrudan sağlanmasını sağlar. Bu lipit bazlı ekspresyon modunda (L-CF), sentezlenmiş milletvekilleri, sağlanan çift katmanlı 6,7'ye birlikte translasyonel olarak ekleme fırsatına sahiptir (Şekil 1). Düzlemsel lipid çift katmanlı disk8'i çevreleyen bir membran iskele proteininden (MSP) oluşan nanodiskler, bu strateji 9,10 için özellikle uygun görünmektedir. Nanodiskler rutin olarak çeşitli farklı lipitlerle in vitro olarak monte edilebilir, çok kararlıdırlar ve stoklar 1 mM'ye kadar konsantre edilebilir. Bununla birlikte, E. coli'de MSP ekspresyonu ve saflaştırılması gereklidir. Alternatif bir strateji olarak MSP, lipozomlarla beslenen KF reaksiyonlarında hedef MP ile birlikte eksprese edilebilir11,12,13. Hem MSP hem de MP için DNA şablonları reaksiyona eklenir ve ifade üzerine MP / nanodiskler oluşabilir. MSP üretiminden kaçınılırken, birlikte ekspresyon stratejisi, nihai DNA şablon konsantrasyonlarının dikkatli bir şekilde ince ayarlanmasını gerektirir ve numune üretiminin verimliliğinde daha yüksek varyasyonlar beklenebilir.
Milletvekillerinin önceden oluşturulmuş nanodisklerin zarlarına ko-translasyonel olarak eklenmesi, translokon makinelerinden ve sinyal dizileri13,14,15,16'dan bağımsız, fizyolojik olmayan ve hala büyük ölçüde bilinmeyen bir mekanizmadır. Yerleştirme etkinliğinin başlıca belirleyicileri, membran proteininin tipi ve sağlanan membranın lipit bileşimidir ve negatif yüklü lipitler için sıklıkla tercih edilir15,17. Nanodisk membranları nispeten sınırlı boyuttadır, MP yerleştirme18 üzerine önemli miktarda lipit salınır. Nanodisk boyutunun değişimi, daha yüksek oligomerik MP komplekslerinin 15,18'in yerleştirilmesini ve ayarlanmasını sağlar. Diğerlerinin yanı sıra, iyon kanalı KcsA, iyon pompası proteorhodopsin (PR) ve çoklu ilaç taşıyıcı EmrE15,18 için homooligomerik komplekslerin doğru montajı gösterilmiştir. Milletvekillerinin simetrik nanodisk membranına her iki taraftan da nispeten eşit frekansta girmeleri muhtemeldir. Bu nedenle, bir nanodiske yerleştirilen farklı monomerlerin veya oligomerlerin zıt yönelimlere sahip olabileceği düşünülmelidir. Bununla birlikte, oryantasyondaki bir önyargı, PR hexamers ve KcsA tetramerlerinin oluşumu için bildirilen işbirlikçi yerleştirme mekanizmalarından kaynaklanabilir18. MP oryantasyonundaki başka bir önyargı, muhtemelen nanodisk membranlarının kenarına yerleştirilmiş MP'lerin oryantasyon anahtarlarından kaynaklanabilir.
E. coli suşlarından CF lizat üretimi güvenilir bir rutin tekniktir ve hemen hemen her biyokimyasal laboratuvarda gerçekleştirilebilir19,20. Disülfit köprü oluşumunun yanı sıra, bir MP'nin E. coli lizatları kullanılarak sentezlenmesi durumunda, diğer birçok çeviri sonrası modifikasyonun bulunmadığı düşünülmelidir. Bu, yapısal çalışmalar için daha homojen örnekler üretebilirken, bireysel MP hedeflerinin işlevi üzerindeki potansiyel etkileri dışlamak gerekebilir. Bununla birlikte, E. coli CF lizatlarında G-protein kuplajlı reseptörlerin (GPCR) 14,21,22, ökaryotik taşıyıcıların 23 veya büyük heteromerik montajların 24'ünün yüksek kaliteli örneklerinin verimli bir şekilde üretilmesi, karmaşık hedefler için bile uygunluklarını göstermektedir. Bir numunenin hazırlık ölçeği miktarları (≈ 1 mg/mL), bir reaksiyon karışımı (RM) ve bir besleme karışımı (FM) bölmesinden oluşan iki bölmeli sürekli değişim hücresiz (CECF) konfigürasyonu ile elde edilebilir. FM hacmi, RM hacmini 15 ila 20 kat aşıyor ve düşük moleküler ağırlıklı enerji bileşikleri ve öncülleri19'dan oluşan bir rezervuar sağlıyor. Böylece reaksiyon ifadesi birkaç saat uzatılır ve MP hedefinin nihai verimi artırılır. RM ve FM bölmeleri, 10-14 kDa kesimli bir diyaliz membranı ile ayrılır. İki bölme, CECF reaksiyon kabının özel bir tasarımını gerektirir (Şekil 1). FM'i tutan özel pleksiglas kaplar ile birlikte RM kapları olarak ticari diyaliz kasetleri uygun örneklerdir. MP verimleri, RM: FM oranlarını değiştirerek veya belirli bir inkübasyon süresinden sonra FM'yi değiştirerek daha da manipüle edilebilir.
Bir MP'nin verimi ve kalitesi sıklıkla reaksiyon parametrelerinin yoğun optimizasyonunu gerektirir. CF ifadesinin önemli bir avantajı, bir MP'nin bireysel gereksinimlerine göre hemen hemen her bileşiği değiştirme ve ince ayar yapma olasılığıdır. Basit bir strateji, önce temel bir üretim protokolü oluşturarak bir MP'nin verimini artırmaya odaklanmak ve daha sonra reaksiyon ve katlama koşullarına ince ayar yaparak MP kalitesini optimize etmektir. KF lizatlarında fizyolojik süreçlerin olmaması ve karmaşıklığının azalması, milletvekillerinin verimli üretimi için yüksek başarı oranlarına neden olmaktadır25. DNA şablon tasarımı ve Mg2 + iyon konsantrasyonunun optimizasyonu için rutin hususlar çoğu durumda tatmin edici verimler elde etmek için yeterlidir26. İfade moduna bağlı olarak, MP kalitesinin optimizasyonu zaman alıcı olabilir, çünkü daha çeşitli parametrelerintaranması gerekir 14,17,22.
Tanımlanan CF ekspresyon platformunu oluşturmak için, E. coli CF lizat (i), T7 RNA polimeraz (ii), nanodiskler (iii) ve temel CECF reaksiyon bileşiklerinin (iv) üretimi için protokoller gereklidir (Şekil 1). E. coli K12 suşu A1927 veya BL21 türevleri, verimli S30 (30.000 x g'de santrifüjleme) lizatlarının hazırlanmasında sıklıkla kullanılır. S30 lizatlarının yanı sıra, diğer g-kuvvetlerinde (örneğin S12) santrifüj edilmiş karşılık gelen lizatlar da kullanılabilir. Lisatlar ekspresyon verimliliği ve proteom karmaşıklığı bakımından farklılık gösterir. Tanımlanan protokol ile hazırlanan S30 lizatının proteomu28 ayrıntılı olarak incelenmiştir. S30 proteomu hala iyon kanallarının ekspresyonu ve analizi üzerine arka plan problemleri verebilecek bazı artık dış zar proteinleri içerir. Bu tür hedefler için S80-S100 lizat kullanılması önerilir. Lisat hazırlama sırasında değerli bir modifikasyon, hücrelerin orta log büyüme fazında kombine ısı şoku ve etanol beslemesi ile SOS yanıtının indüklenmesidir. Elde edilen HS30 lizatları şaperonlar bakımından zenginleştirilmiştir ve gelişmiş MP katlama22 için S30 lizatlarla karışımlarda kullanılabilir. E. coli lizatlarındaki CF ekspresyonu, T7 RNA polimeraz (T7RNAP) tarafından kontrol edilen promotörler içeren DNA şablonları ile birleştirilmiş bir transkripsiyon / translasyon işlemi olarak çalıştırılır. Enzim, pAR1219 plazmid29'u taşıyan BL21 (DE3) Yıldız hücrelerinde verimli bir şekilde üretilebilir.
MSP1E3D1'in iki kopyası, 10-12 nm çapında bir nanodiskte toplanır, ancak aşağıda açıklanan protokol diğer MSP türevleri için de çalışabilir. Bununla birlikte, MSP1E3D1 ile oluşturulanlardan daha büyük nanodiskler daha az kararlı olma eğilimindeyken, MSP1 gibi MSP türevleriyle oluşturulan daha küçük nanodiskler daha büyük MP'leri veya MP komplekslerini barındırmayabilir. MSP1E3D1 nanodiskleri, çok çeşitli farklı lipitler veya lipit karışımları ile in vitro olarak monte edilebilir. Önceden oluşturulmuş nanodiskler genellikle -80 ° C'de 1 yıl > stabildir, stabilite ise farklı lipit bileşenleri için değişebilir. Bir MP'nin katlanması ve stabilitesi üzerindeki lipit etkilerinin taranması için, temsili çeşitli lipitler / lipit karışımları ile monte edilmiş kapsamlı bir nanodisk seti hazırlamak gerekir. Aşağıdaki lipitler iyi bir başlangıç seçimi sağlayabilir: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) ve 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC).
3 mL CECF reaksiyonunun hazırlanması için bir protokol tanımlanmıştır. 1: 1 oranında daha fazla yukarı veya aşağı ölçeklendirme mümkündür. İki bölmeli CECF konfigürasyonu için, tüm bileşikleri içeren bir RM ve sadece düşük moleküler ağırlıklı bileşikleri içeren bir FM hazırlanmalıdır. 10-14 kDa MWCO'lu ticari 3 mL diyaliz cihazları RM konteyner olarak kullanılabilir ve daha sonra FM'i tutan özel yapım pleksiglas kaplara yerleştirilir (Şekil 1D)30. RM: FM oranı 1: 20'dir, bu nedenle 3 mL RM için 60 mL FM hazırlanmalıdır. DNA şablonları yayınlanan kılavuzlara göre hazırlanmalıdır ve hedefin okuma çerçevesinin kodon optimizasyonu ürün verimini daha da artırabilir26. Hazırlık ölçeği CECF reaksiyonu için, PR üretimi için belirlenmiş bir protokol tanımlanmıştır. Yeni milletvekilleri için ifade protokolleri oluşturmak için, verimi ve kaliteyi artırmak için genellikle belirli bileşiklerin optimizasyon ekranlarını (Tablo 1) gerçekleştirmek gerekir. Mg2 + iyonları için, farklı DNA şablonları için sıklıkla önemli varyasyonlar gösteren iyi odaklanmış bir konsantrasyon optimumluğu vardır. Yeni T7RNAP veya S30 lizat partileri gibi diğer CF reaksiyon bileşikleri, optimal Mg2 + konsantrasyonunu daha da değiştirebilir. Örnek olarak, 14-24 mM konsantrasyon aralığında ve 2 mM'lik adımlar halinde tipik bir Mg2+ ekran tanımlanmıştır. Her konsantrasyon kopyalar halinde ve analitik ölçekte CECF reaksiyonlarında taranır. CECF reaksiyon kabı olarak, RM'yi tutan özel yapım Mini-CECF Pleksiglas kaplar30, FM'yi tutan standart 24 delikli mikro plakalarla birlikte kullanılır (Şekil 1B). Alternatif olarak, uygun kurulumlarda 96 derin kuyucuklu mikroplakalar veya diğer ticari diyalizör cihazları ile birlikte ticari diyaliz kartuşları kullanılabilir (Şekil 1C).

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840445P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840475C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4227</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>9781</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]-dihydroalprenolol Hydrochloride</td><td>American Radiolabeled Chemicals (USA)</td><td>ART0134</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)</td><td>Merck (Germany)</td><td>1409</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate (ATP)</td><td>Sigma Aldrich (Germany)</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>Alprenolol hydrochloride</td><td>Merck (Germany)</td><td>A0360000</td><td></td></tr><tr><td>Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose&amp;reg;</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>Q1126</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Type GE 446EC-1</td><td>Gettinge (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor Type 884 124/1</td><td>B.Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cholic acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>8137</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks</td><td>Schott Duran (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5&#039;-triphosphate disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>C1506</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose monohydrate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing Spectrum&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Labs Spectra/Por&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 12-14 kD MWCO Standard RC tubing</td><td>Fisher Scientific (Germany)</td><td>8700152</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreit</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Folinic acid calcium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>French pressure cell disruptor</td><td>SLM; Amico Instruments (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate di-sodium salt (GTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>K025</td><td></td></tr><tr><td>IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL</td><td>GE Life Sciences (Germany)</td><td>GE17-5248</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3899</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-&amp;beta;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>2316</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3076.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>HN23</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartic Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T202</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T203</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3774</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3772</td><td></td></tr><tr><td>L-Glycine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3187</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3852</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1699</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4207</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>9359</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1713</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1709</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4682</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1738</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>7700</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T207</td><td></td></tr><tr><td>MD100 dialysis units</td><td>Scienova (Germany)</td><td>40077</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N-2&lt;/em&gt;-Hydroxyethylpiperazine-&lt;em&gt;N&#039;-2&lt;/em&gt;-ethansulfonic acid (HEPES)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecylphosphocholine</td><td>Antrace (USA)</td><td>F308S</td><td></td></tr><tr><td>PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE gel power supply: Power Pac 3000</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone/peptone from caseine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6681</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump: ip-12</td><td>Ismatec (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphoenol pyruvate monopotassium salt</td><td>Sigma Aldrich (Germany)</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>P018</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4986</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate Kinase</td><td>Roche (Germany)</td><td>10109045001</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation counter: Hidex 300 SL</td><td>Hidex (Finland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>8029</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>K305</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Nanodrop</td><td>Peqlab (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer/fluorescence reader Spark&amp;reg;</td><td>Tecan (Switzerland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tRNA (E. coli)</td><td>Roche (Germany)</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Ultra sonificator</td><td>Labsonic U, B. Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5&amp;rsquo;-triphosphate tri-sodium salt (UTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>Y-30 antifoam</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>A6457</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>2904</td><td></td></tr></tbody></table>

co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs

Hücresiz ekspresyon sistemleri, membran proteinleri gibi karmaşık proteinlerin bile işlevsel katlanmasını desteklemek için reaksiyon ortamlarının özel tasarımına izin verir. Membran proteinlerinin nanodiskler olarak tedarik edilen önceden oluşturulmuş ve tanımlanmış membranlara ko-translasyonel olarak yerleştirilmesi ve katlanması için deneysel prosedürler gösterilmiştir. Protokol tamamen deterjansızdır ve bir gün içinde miligram saflaştırılmış numune üretebilir. Elde edilen membran proteini / nanodisk örnekleri, çeşitli fonksiyonel çalışmalar ve kristalizasyon, nükleer manyetik rezonans veya elektron mikroskobu gibi yapısal uygulamalar için kullanılabilir. Hücresiz lizatlar, tasarlanmış membranlı nanodiskler, kritik stok çözeltileri ve iki bölmeli hücresiz ekspresyon reaksiyonlarının montajı gibi temel anahtar bileşenlerin hazırlanması açıklanmaktadır. Membran proteinlerinin katlanma gereksinimleri çok çeşitli olabileceğinden, bu protokolün ana odak noktası, kritik temel reaksiyon bileşikleri, nanodisklerin membran bileşimi, redoks ve şaperon ortamı veya DNA şablon tasarımı gibi numune kalitesi için önemli olan parametrelerin ve reaksiyon adımlarının modülasyonudur. Tüm süreç proteorhodopsin ve bir G-protein eşleşmiş reseptör sentezi ile gösterilmiştir.

İnce ayar reaksiyon bileşiklerinin, sentezlenmiş milletvekillerinin nihai verimi veya kalitesi üzerindeki etkisi örneklendirilmiştir. Sık kullanılan rutin bir yaklaşım, CF reaksiyonlarında optimal Mg2+ konsantrasyonunu, sistem verimliliğinin uygun bir monitörü olarak yeşil floresan proteini (GFP) ekspresyonu ile ayarlamaktır. Örnek olarak, GFP, 14 ila 24 mM arasındaki Mg 2+ konsantrasyonlarında bir pET-21a (+) vektöründen sentezlendi (Şekil 2). SDS...

Watch this Scientific Journal Video about Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs at JoVE.com

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Önceden oluşturulmuş nanodisklere birlikte translasyonel yerleştirme, tanımlanmış lipit ortamlarında deterjanlarla temas etmeden hücresiz sentezlenmiş membran proteinlerinin incelenmesini mümkün kılar. Bu protokol, temel sistem bileşenlerinin hazırlanmasını ve ifade verimliliğini ve numune kalitesini artırmak için kritik parametreleri açıklar.

Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

co-translational-insertion-membrane-proteins-into-preformed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.3K Görüntüleme.  Goethe University Frankfurt. Önceden oluşturulmuş nanodisklere birlikte translasyonel yerleştirme, tanımlanmış lipit ortamlarında deterjanlarla temas etmeden hücresiz sentezlenmiş membran proteinlerinin incelenmesini mümkün kılar. Bu protokol, temel sistem bileşenlerinin hazırlanmasını ve ifade verimliliğini ve numune kalitesini artırmak için kritik parametreleri açıklar.

Video: Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biyokimya

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To study retrograde protein traffic, we have recently developed a versatile nanobody-based toolkit to analyze transport from the cell surface to the Golgi complex, either by fixed and live cell imaging, by electron microscopy, or biochemically. We engineered functionalized anti-green fluorescent protein (GFP) nanobodies &#8212; small, monomeric, high-affinity protein binders &#8212; that can be applied to cell lines expressing membrane proteins of interest with an extracellular GFP moiety. Derivatized nanobodies bound to the GFP reporters are specifically internalized and transported piggyback along the reporters&#39; sorting routes. Nanobodies were functionalized with fluorophores to follow retrograde transport by fluorescence microscopy and live imaging, with ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to investigate the ultrastructural localization of reporter-nanobody complexes by electron microscopy, and with tyrosine sulfation (TS) motifs to assess kinetics of trans-Golgi network (TGN) arrival. In this methodological article, we outline the general procedure to bacterially express and purify functionalized nanobodies. We illustrate the powerful use of our tool using the mCherry- and TS-modified nanobodies to analyze endocytic uptake and TGN arrival of cargo proteins.

Retrograde transport of proteins from the cell surface to the Golgi is essential to maintain membrane homeostasis. Here, we describe a method to biochemically analyze cell surface-to-Golgi transport of recombinant proteins using functionalized nanobodies in HeLa cells.

Endositik alımını ve kültürlü hücrelerde Functionalized Nanobodies kullanarak Trans-Golgi ağına retrograd taşıma analizi

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

Nanodisk İçeren Biyoaktif Ajanın Formülasyonu ve Karakterizasyonu

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a particularly attractive option for studying membrane proteins, especially in the context of ligand-receptor interactions. The method pioneered by Sligar and colleagues is based on the amphipathic properties of an engineered highly a-helical scaffold protein derived from the apolipoprotein A1. The hydrophobic faces of the scaffold protein interact with the fatty acyl side-chains of the lipid bilayer whereas the polar regions face the aqueous environment. Analyses of membrane proteins in nanodiscs have significant advantages over liposome because the particles are small, homogeneous and water-soluble. In addition, biochemical and biophysical methods normally reserved to soluble proteins can be applied, and from either side of the membrane. In this visual protocol, we present a step-by-step reconstitution of a well characterized bacterial ABC transporter, the MalE-MalFGK2 complex. The formation of the disc is a self-assembly process that depends on hydrophobic interactions taking place during the progressive removal of the detergent. We describe the essential steps and we highlight the importance of choosing a correct protein-to-lipid ratio in order to limit the formation of aggregates and larger polydisperse liposome-like particles. Simple quality controls such as gel filtration chromatography, native gel electrophoresis and dynamic light scattering spectroscopy ensure that the discs have been properly reconstituted.

Nanodiscs are small discoid particles that incorporate membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. We provide a visual protocol that shows the step-by-step incorporation of the MalFGK2 transporter into a disc.

Nanodisc Lipid Parçacıklar içine bir ABC Transporter Sulandırma için bir adım-adım yöntemi

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Biyoloji

Lipid Membranlar Üzerinde Işık Kontrollü Tersinir Protein Deseni

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Yazar Spotlight: Yapay Hücresel Sistemlerde Tersinir Modelleme için Fotoğraf Değiştirilebilir Protein Alımı

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

Model Membranlarda Dinamik Işık Kaynaklı Protein Modelleri

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell ...

Biyomühendislik

Protein Translocation Machinery on the ER Membrane

The translocon complex situated on the ER membrane is the main gateway for the protein secretory pathway. It facilitates the transport of nascent peptides into the ER lumen and their insertion into the ER membrane.
Sec61 protein conducting channel
In eukaryotes, the translocon complex comprises a core heterotrimeric translocator channel called the Sec61 complex. This channel includes three transmembrane proteins, Sec61&#945;, Sec61&#946;, and Sec61&#947;, and is the largest subunit of the translocon complex. In higher eukaryotes, such as mammals, the channel is capped in its resting state to prevent the leakage of ions like calcium into the cytosol.
Accessory protein complexes associated with the Sec61 channel
Sec62 and Sec63 are integral transmembrane proteins associated with the Sec61 complex. They are primarily involved in the functioning of the Sec61 channel&#39;s lateral gate and aid in the exit of the signal sequence and transmembrane domains into the lipid bilayer.
The translocon-associated protein or TRAP complex is a hetero-tetrameric constitutive subunit of the translocon complex, present behind the Sec61 channel. It assists in the binding of signal peptides having low hydrophobicity to the Sec61 channel. The oligosaccharyltransferase (OST) complex is another closely associated complex, which transfers pre-assembled glycans to select asparagine residues.
Some proteins, like the signal peptidase complex, associate with the translocon complex under specific conditions. For instance, the signal recognition particle receptor (SR) only interacts with the Sec61 channel to hand over the ribosome-nascent peptide complex during active translocation. Other proteins like lectin chaperones (calnexin and malectin) and sensor molecules (IRE1) associate with the translocon to correctly fold the incoming polypeptide or signal misfolded proteins.

ER Membranı Üzerinde Protein Translokasyon Makineleri

The translocon complex situated on the ER membrane is the main gateway for the protein secretory pathway. It facilitates the transport of nascent peptides ...

Education

JoVE Core

Hücre Biyolojisi

Unit 1

Endoplazmik Retikulum ve Peroksizomlarda Transmembran Taşıma

KEY TERMS AND CONCEPTS

Cotranslational Protein Translocation

Translocation of proteins across membranes is an ancient process that occurs even in bacteria and archaebacteria. In fact, the components of the translocation machinery are still conserved between prokaryotes and eukaryotes.
Sec61 channel partners for cotranslational translocation
During cotranslational translocation, the Sec61 channel partners with the signal recognition particle (SRP), the signal recognition particle receptor (SR), and the ribosomes to transport the nascent polypeptide chain into the lumen.
SRP mediates ribosome attachment to the Sec61 complex via the polypeptide exit tunnel of the large ribosomal subunit. The GTPase domains on both SRP and SR carry out GTP hydrolysis, which supports the transfer of the target polypeptide to the Sec61 channel. Subsequently, the ribosomes act as primary translocation motors and push the protein towards the ER lumen. Except for the GTPs spent during peptide chain elongation, no additional energy is expended for the protein to descend through the channel.&#160;
Accessory translocon complex proteins involved in cotranslational translocation
The translocating chain-associating membrane (TRAM) protein and translocon-associated protein (TRAP) complex are auxiliary components associated with the Sec61 channel during SRP-mediated translocation. The TRAP complex is a substrate-specific complex essential for secure anchoring of the signal sequences having low hydrophobicity. Its proteins directly interact with Sec61 and keep the channel in open confirmation to compensate for the weak interaction with the signal sequence.
On the other hand, TRAM is a membrane protein that acts as a chaperone. It assists in folding and membrane integration of cotranslationally translocating proteins.

Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Endositik alımını ve kültürlü hücrelerde Functionalized Nanobodies kullanarak Trans-Golgi ağına retrograd taşıma analizi

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Nanodisk İçeren Biyoaktif Ajanın Formülasyonu ve Karakterizasyonu

Nanodisc Lipid Parçacıklar içine bir ABC Transporter Sulandırma için bir adım-adım yöntemi

Model Membranlarda Dinamik Işık Kaynaklı Protein Modelleri

Model Membranlarda Dinamik Işık Kaynaklı Protein Modelleri

Model Membranlarda Dinamik Işık Kaynaklı Protein Modelleri

ER Membranı Üzerinde Protein Translokasyon Makineleri

Kotranslasyonel Protein Translokasyonu