Nous tenons à remercier la subvention BE1911/8-1 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), le projet LOEWE GLUE et le centre de recherche collaborative Transport and Communication across Membranes (SFB807) pour leur soutien financier.

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P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthesis+of+a+functional+G+protein-coupled+receptor+complexed+with+nanometer+scale+bilayer+discs.">Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs.</a> BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).</li><li>Rues, R. B., Dong, F., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+optimization+of+cell-free+synthesized+human+endothelin+B+receptor+folding.">Systematic optimization of cell-free synthesized human endothelin B receptor folding.</a> Methods. 147 (1), 73-83 (2018).</li><li>Keller, T., Gorboulev, V., Mueller, T. D., D&#246;tsch, V., Bernhard, F., Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+organic+cation+transporter+1+contains+three+binding+sites+for+substrate+1-methyl-4-phenylpyridinium+per+monomer.">Rat organic cation transporter 1 contains three binding sites for substrate 1-methyl-4-phenylpyridinium per monomer.</a> Molecular Pharmacology. 95 (2), 169-182 (2019).</li><li>Matthies, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+and+assembly+of+ATP+synthase.">Cell-free expression and assembly of ATP synthase.</a> Journal of Molecular Biology. 413 (3), 593-603 (2011).</li><li>Schwarz, D., Daley, D., Beckhaus, T., D&#246;tsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+profiling+of+E.+coli+inner+membrane+proteins.">Cell-free expression profiling of E. coli inner membrane proteins.</a> Proteomics. 10 (9), 1762-1779 (2010).</li><li>Haberstock, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+to+increase+the+efficiency+of+membrane+protein+production+in+cell-free+expression+systems.">A systematic approach to increase the efficiency of membrane protein production in cell-free expression systems.</a> Protein Expression and Purification. 82, 308-316 (2012).</li><li>Falkinham, J. O., Clark, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+a+double+male+strain+of+Escherichia+coli+K12.">Genetic analysis of a double male strain of Escherichia coli K12.</a> Genetics. 78 (2), 633-644 (1974).</li><li>Foshag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E.+coli+S30+lysate+proteome:+A+prototype+for+cell-free+protein+production.">The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production.</a> New Biotechnology. 40, 245-260 (2018).</li><li>Davanloo, P., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Studier, F. 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H., Lithgow, T., Martin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+model+membranes:+Seeking+better+ways+to+retain+protein+activities.">Reconstitution of membrane proteins into model membranes: Seeking better ways to retain protein activities.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1589-1607 (2013).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La configuration et les stratégies visant à optimiser l’expression de la mucoviscidose et l’insertion co-translationnelle de MP fonctionnels dans les nanodisques sont décrites. L’équipement requis comprend un bioréacteur, un dispositif de presse à Français ou similaire, un lecteur UV/VIS et de fluorescence, des cuves de réaction CF adaptées à une configuration à deux compartiments et un incubateur à température contrôlée. D’autres équipements standard sont des centrifugeuses pour la récolte de ce...

Les protéines membranaires (MP) sont des cibles difficiles dans les études de production de protéines en raison de leur insolubilité dans des environnements aqueux. Les plates-formes de production MP conventionnelles comprennent des systèmes cellulaires tels que E. coli, la levure ou les cellules eucaryotes. Les MP recombinants synthétisés sont soit extraits des membranes cellulaires, soit repliés à partir des corps d’inclusion1. Après solubilisation du détergent, les MP peuvent être transférés dans des environnements membranaires appropriés par des protocoles de reconstitution in vitro établis. Outre les vésicules et les liposomes, la reconstitution de MP en membranes planes sous forme de nanodisques2 ou de particules de salipro3 est devenue une technique de routine ces derniers temps. Cependant, toutes ces stratégies impliquent un contact détergent avec les MP qui peut entraîner une déstabilisation, une dissociation des oligomères, voire une perte de structure et d’activitéprotéique 4. Le dépistage des conditions optimales de solubilisation et de reconstitution des détergents peut donc être fastidieux et chronophage5.
La nature ouverte des systèmes acellulaires (CF) permet d’alimenter directement la réaction d’expression avec des membranes préformées avec une composition lipidique définie. Dans ce mode d’expression à base de lipides (L-CF), les MP synthétisés ont la possibilité d’insérer en co-traduction dans les bicouchesfournies 6,7 (Figure 1). Les nanodisques constitués d’une protéine d’échafaudage membranaire (MSP) entourant un disque bicouche lipidique planaire8 semblent particulièrement adaptés à cette stratégie 9,10. Les nanodisques peuvent être assemblés in vitro avec une variété de lipides différents, ils sont très stables et les stocks peuvent être concentrés jusqu’à 1 mM. Cependant, l’expression du MSP dans E. coli et sa purification sont nécessaires. Comme stratégie alternative, le MSP peut être co-exprimé avec le MP cible dans les réactions de mucoviscidose fournies avec des liposomes11,12,13. Des modèles d’ADN pour MSP et MP sont ajoutés dans la réaction et MP / nanodisques peuvent se former lors de l’expression. Bien que la production de MSP soit évitée, la stratégie de co-expression nécessite un réglage minutieux des concentrations finales de la matrice d’ADN et on peut s’attendre à des variations plus importantes dans l’efficacité de la production d’échantillons.
L’insertion co-translationnelle de MP dans les membranes de nanodisques préformés est un mécanisme non physiologique et encore largement inconnu indépendant des machines de translocon et des séquences de signaux13,14,15,16. Les principaux déterminants de l’efficacité de l’insertion sont le type de protéine membranaire ainsi que la composition lipidique de la membrane fournie, avec une préférence fréquente pour les lipides chargés négativement15,17. Comme les membranes nanodisques sont relativement confinées en taille, une quantité importante de lipides est libérée lors de l’insertionde MP 18. La variation de la taille des nanodisques permet l’insertion et l’ajustement de complexes MP oligomères supérieurs15,18. Entre autres, l’assemblage correct de complexes homooligomères a été montré pour le canal ionique KcsA, pour la pompe ionique protéorhodopsine (PR) et pour le transporteur multidrogue EmrE15,18. Les MP sont susceptibles de pénétrer dans la membrane nanodisque symétrique des deux côtés à une fréquence relativement égale. Il faut donc considérer que différents monomères ou oligomères insérés dans un nanodisque peuvent avoir des orientations opposées. Cependant, un biais d’orientation pourrait être causé par des mécanismes d’insertion coopératifs tels que rapportés pour la formation d’hexamères PR et de tétramères KcsA18. Un autre biais dans l’orientation des MP pourrait résulter des commutateurs d’orientation des MP insérés probablement au bord des membranes nanodisques.
La production de lysats de mucoviscidose à partir de souches d’E. coli est une technique de routine fiable et peut être effectuée dans presque tous les laboratoires biochimiques19,20. Il faut considérer qu’en plus de la formation du pont disulfure, la plupart des autres modifications post-traductionnelles sont absentes si un MP est synthétisé à l’aide de lysats E. coli. Bien que cela puisse générer des échantillons plus homogènes pour les études structurelles, il peut être nécessaire d’exclure les effets potentiels sur la fonction des cibles MP individuelles. Cependant, la production efficace d’échantillons de haute qualité de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)14,21,22, de transporteurs eucaryotes 23 ou de grands assemblages hétéromères 24 dans les lysats de E. coli CF indique leur adéquation même à des cibles complexes. Les quantités d’échelle préparative (≈ 1 mg/mL) d’un échantillon peuvent être obtenues avec la configuration sans cellule à échange continu (CECF) à deux compartiments, composée d’un compartiment de mélange réactionnel (RM) et d’un compartiment de mélange d’alimentation (FM). Le volume FM dépasse le volume RM de 15 à 20 fois et fournit un réservoir de composés énergétiques et de précurseurs de faible poids moléculaire19. La réaction d’expression est ainsi prolongée de plusieurs heures et le rendement final de la cible MP est augmenté. Les compartiments RM et FM sont séparés par une membrane de dialyse avec une coupure de 10-14 kDa. Les deux compartiments nécessitent une conception spéciale du récipient de réaction CECF (figure 1). Les cassettes de dialyse commerciales en tant que récipients RM en combinaison avec des récipients en plexiglas sur mesure contenant le FM sont des exemples appropriés. Les rendements MP peuvent en outre être manipulés en modifiant les rapports RM:FM ou en échangeant le FM après une certaine période d’incubation.
Le rendement et la qualité d’un MP nécessitent souvent une optimisation intense des paramètres de réaction. Un avantage important de l’expression CF est la possibilité de modifier et d’affiner presque n’importe quel composé en fonction des exigences individuelles d’un MP. Une stratégie simple consiste à se concentrer d’abord sur l’amélioration du rendement d’un MP en établissant un protocole de production de base, puis à optimiser la qualité du MP en affinant les conditions de réaction et de repliement. L’absence de processus physiologiques dans les lysats de mucoviscidose et leur complexité réduite se traduisent par des taux de réussite élevés pour la production efficace de MP25. Les considérations de routine pour la conception de modèles d’ADN et l’optimisation de la concentration d’ions Mg 2+ sont dans la plupart des cas suffisantes pour obtenir des rendements satisfaisants26. Selon le mode d’expression, l’optimisation de la qualité MP peut prendre beaucoup de temps, car une plus grande variété de paramètres doivent être examinés14,17,22.
Pour établir la plateforme d’expression de la mucoviscidose décrite, des protocoles sont nécessaires pour la production de lysat d’E. coli (i), d’ARN polymérase T7 (ii), de nanodisques (iii) et des composés réactionnels CECF de base (iv) (Figure 1). Les dérivés A1927 ou BL21 de la souche K12 d’E. coli sont fréquemment utilisés pour la préparation de lysats efficaces de S30 (centrifugation à 30 000 x g). Outre les lysats S30, des lysats correspondants centrifugés à d’autres forces g (par exemple S12) peuvent être utilisés. Les lysats diffèrent par l’efficacité de l’expression et la complexité du protéome. Le protéome du lysat S30 préparé par le protocole décrit a été étudié en détail28. Le protéome S30 contient encore des protéines résiduelles de la membrane externe qui pourraient donner des problèmes de fond lors de l’expression et de l’analyse des canaux ioniques. Pour de telles cibles, l’utilisation de lysats S80-S100 est recommandée. Une modification précieuse lors de la préparation du lysat est l’induction de la réponse SOS par un choc thermique combiné et un apport d’éthanol à mi-phase de croissance logarithmique des cellules. Les lysats HS30 qui en résultent sont enrichis en chaperons et peuvent être utilisés dans des mélanges avec des lysats S30 pour un repliement MP22 amélioré. L’expression de la mucoviscidose dans les lysats d’E. coli est exploitée comme un processus couplé de transcription/traduction avec des matrices d’ADN contenant des promoteurs contrôlés par l’ARN polymérase T7 (T7RNAP). L’enzyme peut être produite efficacement dans les cellules étoiles BL21 (DE3) portant le plasmide pAR121929.
Deux copies de MSP1E3D1 s’assemblent en un nanodisque d’un diamètre de 10 à 12 nm, mais le protocole décrit ci-dessous peut également fonctionner pour d’autres dérivés MSP. Cependant, les nanodisques plus grands que ceux formés avec MSP1E3D1 ont tendance à être moins stables, tandis que les nanodisques plus petits formés avec des dérivés MSP tels que MSP1 peuvent ne pas accueillir de plus grands MP ou complexes MP. Les nanodisques MSP1E3D1 peuvent être assemblés in vitro avec une grande variété de lipides différents ou des mélanges lipidiques. Les nanodisques préformés sont généralement stables pendant > 1 an à -80 °C, tandis que la stabilité peut varier pour différents composants lipidiques. Pour le criblage des effets lipidiques sur le repliement et la stabilité d’un MP, il est nécessaire de préparer un ensemble complet de nanodisques assemblés avec une variété représentative de lipides/mélanges lipidiques. Les lipides suivants peuvent donner un bon choix de départ: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (DMPG), 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC), 1,2 dioléoyl-sn-glycéro-3-phospho-rac-(1-glycérol) (DOPG), 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (POPG) et 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine (POPC).
Un protocole pour la préparation d’une réaction CECF de 3 mL est décrit. Une mise à l’échelle plus élevée ou plus basse dans un rapport de 1:1 est possible. Pour la configuration CECF à deux compartiments, un RM contenant tous les composés et un FM contenant uniquement les composés de faible poids moléculaire doivent être préparés. Les appareils de dialyse commerciaux de 3 ml avec MWCO de 10 à 14 kDa peuvent être utilisés comme contenants RM, qui sont ensuite placés dans des contenants en plexiglas fabriqués sur mesure contenant le FM (Figure 1D)30. Le rapport RM:FM est de 1:20, donc 60 mL de FM doivent être préparés pour 3 mL RM. La qualité, la concentration ou le type de plusieurs composants peuvent être critiques pour le rendement final et/ou la qualité du MP synthétisé (tableau 1). Les modèles d’ADN doivent être préparés conformément aux lignes directrices publiées et l’optimisation du codon du cadre de lecture de la cible peut encore améliorer considérablement le rendement du produit26. Pour la réaction CECF à l’échelle préparatrice, un protocole établi pour la production de PN est décrit. Pour établir des protocoles d’expression pour les nouveaux MP, il est généralement nécessaire d’effectuer des criblages d’optimisation de certains composés (tableau 1) afin d’améliorer le rendement et la qualité. Pour les ions Mg2+ , il existe un optimum de concentration bien ciblé qui montre souvent une variation significative pour différents modèles d’ADN. D’autres composés réactionnels de la mucoviscidose, tels que de nouveaux lots de lysats T7RNAP ou S30, peuvent modifier davantage la concentration optimale de Mg2+ . À titre d’exemple, un écran Mg 2+ typique dans la plage de concentration de14-24 mM et par pas de 2 mM est décrit. Chaque concentration est examinée en double et dans des réactions CECF à l’échelle analytique. En tant que conteneur de réaction CECF, des conteneurs en plexiglas Mini-CECF30 sur mesure contenant le RM sont utilisés en combinaison avec des microplaques standard à 24 puits contenant le FM (Figure 1B). On peut aussi utiliser des cartouches de dialyse commerciales en combinaison avec des microplaques de puits de 96 profondeurs ou d’autres dispositifs de dialyseur commerciaux dans des configurations appropriées (figure 1C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840445P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850345C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840475C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (USA)</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]-dihydroalprenolol Hydrochloride</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals (USA)</td>
			<td>ART0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)</td>
			<td>Merck (Germany)</td>
			<td>1409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Germany)</td>
			<td>A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alprenolol hydrochloride</td>
			<td>Merck (Germany)</td>
			<td>A0360000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose&#174;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>Q1126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave Type GE 446EC-1</td>
			<td>Gettinge (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor Type 884 124/1</td>
			<td>B.Braun (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>8137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R250</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks</td>
			<td>Schott Duran (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine 5&#39;-triphosphate disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose monohydrate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Standard RC tubing</td>
			<td>Fisher Scientific (Germany)</td>
			<td>8700152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreit</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>K928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>47612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French pressure cell disruptor</td>
			<td>SLM; Amico Instruments (USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate di-sodium salt (GTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>K025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL</td>
			<td>GE Life Sciences (Germany)</td>
			<td>GE17-5248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3076.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arginine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>HN23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic Acid</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glycine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Isoleucine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>9359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Phenylalanine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Serine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Threonine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>1738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tryptophane</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>7700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>T207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MD100 dialysis units</td>
			<td>Scienova (Germany)</td>
			<td>40077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethansulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecylphosphocholine</td>
			<td>Antrace (USA)</td>
			<td>F308S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel power supply: Power Pac 3000</td>
			<td>Biorad (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone/peptone from caseine</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump: ip-12</td>
			<td>Ismatec (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoenol pyruvate monopotassium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich (Germany)</td>
			<td>860077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>P018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>4986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>6781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Kinase</td>
			<td>Roche (Germany)</td>
			<td>10109045001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter: Hidex 300 SL</td>
			<td>Hidex (Finland)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS pellets</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>8029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>K305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Nanodrop</td>
			<td>Peqlab (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer/fluorescence reader Spark&#174;</td>
			<td>Tecan (Switzerland)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (E. coli)</td>
			<td>Roche (Germany)</td>
			<td>10109550001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra sonificator</td>
			<td>Labsonic U, B. Braun (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#8217;-triphosphate tri-sodium salt (UTP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-30 antifoam</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Germany)</td>
			<td>A6457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Carl Roth (Germany)</td>
			<td>2904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs

Les systèmes d’expression acellulaires permettent la conception sur mesure d’environnements de réaction pour soutenir le repliement fonctionnel de protéines même complexes telles que les protéines membranaires. Les procédures expérimentales pour l’insertion et le repliement co-translationnels de protéines membranaires dans des membranes préformées et définies fournies sous forme de nanodisques sont démontrées. Le protocole est totalement exempt de détergent et peut générer des milligrammes d’échantillons purifiés en une journée. Les échantillons de protéines membranaires/nanodisques qui en résultent peuvent être utilisés pour une variété d’études fonctionnelles et d’applications structurelles telles que la cristallisation, la résonance magnétique nucléaire ou la microscopie électronique. La préparation de composants clés de base tels que les lysats acellulaires, les nanodisques avec des membranes conçues, les solutions mères critiques ainsi que l’assemblage de réactions d’expression sans cellules à deux compartiments sont décrites. Étant donné que les exigences de repliement des protéines membranaires peuvent être très diverses, l’un des principaux objectifs de ce protocole est la modulation des paramètres et des étapes de réaction importantes pour la qualité de l’échantillon, tels que les composés réactionnels de base critiques, la composition membranaire des nanodisques, l’environnement redox et chaperon, ou la conception de modèles d’ADN. L’ensemble du processus est démontré avec la synthèse de la protéorhodopsine et d’un récepteur couplé aux protéines G.

L’impact du réglage fin des composés réactionnels sur le rendement final ou la qualité des MP synthétisés est illustré. Une approche de routine fréquente consiste à ajuster la concentration optimale de Mg2+ dans les réactions de mucoviscidose par expression de protéine fluorescente verte (GFP) comme moniteur pratique de l’efficacité du système. À titre d’exemple, la GFP a été synthétisée à partir d’un vecteur pET-21a(+) à des concentrations de Mg 2+ comprises entre 14 et24</sup...

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Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

L’insertion co-translationnelle dans des nanodisques préformés permet d’étudier des protéines membranaires synthétisées acellulaires dans des environnements lipidiques définis sans contact avec des détergents. Ce protocole décrit la préparation des composants essentiels du système et les paramètres critiques pour améliorer l’efficacité de l’expression et la qualité de l’échantillon.

Insertion co-translationnelle de protéines membranaires dans des nanodisques préformés

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

co-translational-insertion-membrane-proteins-into-preformed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.2K vues.  Goethe University Frankfurt. L’insertion co-translationnelle dans des nanodisques préformés permet d’étudier des protéines membranaires synthétisées acellulaires dans des environnements lipidiques définis sans contact avec des détergents. Ce protocole décrit la préparation des composants essentiels du système et les paramètres critiques pour améliorer l’efficacité de l’expression et la qualité de l’échantillon.

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

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Biochimie

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently tagged proteins have revolutionized the study of subcellular protein distribution. However, it is difficult to quantify the distribution with fluorescent microscopy, especially when proteins are partially cytosolic. Moreover, it is often important to study endogenous proteins. Biochemical assays such as immunoblots remain the gold standard for quantification of protein distribution after subcellular fractionation. Although there are commercial kits that aim to isolate cytosolic or certain membrane fractions, most of these kits are based on extraction with detergents, which may be unsuitable for studying peripheral membrane proteins that are easily extracted from membranes. Here we present a detergent-free protocol for cellular homogenization by nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. We confirm the separation of subcellular organelles in soluble and pellet fractions across different cell types, and compare protein extraction among several common non-detergent-based mechanical homogenization methods. Among several advantages of nitrogen cavitation is the superior efficiency of cellular disruption with minimal physical and chemical damage to delicate organelles. Combined with ultracentrifugation, nitrogen cavitation is an excellent method to examine the shift of peripheral membrane proteins between cytosolic and membrane fractions.

Here we present protocols for detergent-free homogenization of cultured mammalian cells based on nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. This method is ideal for monitoring the partitioning of peripheral membrane proteins between soluble and membrane fractions.

Azote Cavitation et Centrifugation différentielle permet de surveiller la Distribution des protéines membranaires périphériques dans des cellules cultivées

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Sans tensioactifs ultrarapide Reconstitution des protéines membranaires dans les bicouches lipidiques à l’aide de fusogène complémentaire chargée protéoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein interactions in many cases is associated with significant experimental challenges. In particular, sorting receptors interact with their protein cargo in the lumen of the membrane compartments often in a detergent-sensitive fashion, making co-immunoprecipitation of these proteins unusable. Binding of the sorting receptor sortilin to glucose transporter GLUT4 may serve as an example of weak luminal interactions between membrane proteins. Here, we describe a fast, simple, and inexpensive assay to validate the interaction between sortilin and GLUT4. For that, we have designed and chemically synthesized the myc-tagged peptide corresponding to the potential sortilin-binding epitope in the luminal part of GLUT4. Sortilin tagged with six histidines was expressed in mammalian cells, and isolated from cell lysates using Cobalt beads. Sortilin immobilized on the beads was incubated with the peptide solution at different pH values, and the eluted material was analyzed by Western blotting. This assay can be easily adapted to study other detergent-sensitive protein-protein interactions.

We describe a protocol for detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins using binding of the sorting receptor, sortilin, to the first luminal loop of the glucose transporter protein, GLUT4, as an example.

Détection de détergent-sensibles aux Interactions entre les protéines membranaires

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug targets. Yet, a major barrier to their characterization and exploitation in academic or industrial settings is that most biochemical, biophysical, and drug screening strategies require these proteins to be in a water-soluble state. Our laboratory recently developed the peptidisc, a membrane mimetic offering a &#8220;one-size-fits-all&#8221; approach to the problem of membrane protein solubility. We present here a streamlined protocol that combines protein purification and peptidisc reconstitution in a single chromatographic step. This workflow, termed PeptiQuick, allows for bypassing dialysis and incubation with polystyrene beads, thereby greatly reducing exposure to detergent, protein denaturation, and sample loss. When PeptiQuick is performed with biotinylated scaffolds, the preparation can be directly attached to streptavidin-coated surfaces. There is no need to biotinylate or modify the membrane protein target. PeptiQuick is showcased here with the membrane receptor FhuA and antimicrobial ligand colicin M, using biolayer interferometry to determine the precise kinetics of their interaction. It is concluded that PeptiQuick is a convenient way to prepare and analyze membrane protein-ligand interactions within one&#160;day in a detergent-free environment.

We present a method that combines membrane protein purification and reconstitution into peptidiscs in a single chromatographic step. Biotinylated scaffolds are used for direct surface attachment and measurement of protein-ligand interactions via biolayer interferometry.

PeptiQuick, une incorporation en une seule étape des protéines de membrane dans les Peptidiscs biotinylated pour les essais de liaison de protéine rationalisés

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular mechanism for learning and memory. Palmitoylation regulates localization and function of many synaptic proteins including AMPA-Rs, auxiliary factors and synaptic scaffolds in an activity-dependent manner. We identified the synapse differentiation induced gene (SynDIG) family of four genes (SynDIG1-4) encoding brain-specific transmembrane proteins that associate with AMPARs and regulate synapse strength. SynDIG1 is palmitoylated at two cysteine residues located at positions 191 and 192 in the juxta-transmembrane region important for activity-dependent excitatory synapse development. Here, we describe an innovative biochemical approach, the acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) assay, to investigate the palmitoylation state of any protein of interest and demonstrate its utility with the SynDIG family of proteins in mouse brain lysates.

Palmitoylation entails the incorporation of a 16-carbon palmitate moiety to cysteine residues of target proteins in a reversible manner. Here, we describe a biochemical approach, the acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) assay, to investigate the palmitoylation state of any protein of interest in mouse brain lysates.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay pour détermination quantitative de la palmitoylation des protéines de membrane cérébrale

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Mesure de la liaison des nucléotides aux protéines membranaires fonctionnelles intactes en temps réel

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm phenotyping can be used to classify genotypes based on SG morphotype using scanning electron microscopic (SEM) analysis. SGs can be visualized using SEM by slicing through the kernel (pericarp, aleurone layers, and endosperm) and exposing the organellar contents. Current methods require the rice kernel to be embedded in plastic resin and sectioned using a microtome or embedded in a truncated pipette tip and sectioned by hand using a razor blade. The former method requires specialized equipment and is time-consuming, while the latter introduces a new host of problems depending on rice genotype. Chalky rice varieties, particularly, pose a problem for this type of sectioning due to the friable nature of their endosperm tissue. Presented here is a technique for preparing translucent and chalky rice kernel sections for microscopy, requiring only pipette tips and a scalpel blade. Preparing the sections within the confines of a pipette tip prevents rice kernel endosperm from shattering (for translucent or &#8216;vitreous&#8217; phenotypes) and crumbling (for chalky phenotypes). Using this technique, endosperm cell patterning and the structure of intact SGs can be observed.

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

This protocol allows for the preparation of transverse sections of cereal seeds (e.g., rice) for the analysis of endosperm and starch granule morphology using scanning electron microscopy.

Sectionnement transversal du riz mature (Oryza sativa L.) Noyaux pour l’imagerie par microscopie électronique à balayage à l’aide d’embouts de pipette comme support d’immobilisation