Name: co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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Vorremmo ringraziare la sovvenzione BE1911/8-1 della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), il progetto LOEWE GLUE e il centro di ricerca collaborativa Transport and Communication across Membranes (SFB807) per il sostegno finanziario.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Vengono descritti il setup e le strategie per ottimizzare l'espressione CF e l'inserimento co-traduttivo di MP funzionali nei nanodischi. L'attrezzatura necessaria comprende un bioreattore, un dispositivo di pressatura francese o simile, un lettore UV / VIS e fluorescenza, recipienti di reazione CF adatti per una configurazione a due compartimenti e un incubatore a temperatura controllata. Ulteriori attrezzature standard sono centrifughe per la raccolta di cellule di E. coli e centrifughe da tavolo che raggiungono almeno 30.000 x g per la preparazione di lisati S30. Se devono essere preparati lisati S80-S100, sono necessarie ultracentrifughe. Le apparecchiature elencate sono regolarmente disponibili nei laboratori biochimici e non sono necessari investimenti iniziali più grandi per iniziare con l'espressione CF. Inoltre, la fermentazione e la manipolazione delle cellule di E. coli per il lisato CF e i preparati T7RNAP sono tecniche comuni e robuste. I composti più costosi sono il lisato CF, il T7RNAP e i nanodischi. Possono essere preparati con protocolli affidabili ed efficienti e le aliquote sono stabili per anni a -80 °C. I protocolli richiedono tre giorni ciascuno per la preparazione del lisato CF e del T7RNAP e circa una settimana per l'espressione e la purificazione della MSP e la preformatura dei nanodischi. Il DNA modello target può essere fornito utilizzando pET-21, pIVEX o sistemi vettoriali simili. Per l'impostazione e l'ottimizzazione dei sistemi di espressione CF, la produzione di varianti GFP come GFP spostato (GFP+) o superfolderGFP può essere utilizzata come monitor20,32. Per le condizioni di produzione MP, l'espressione di PR è un buon sistema modello o controllo positivo in quanto si piega in molte condizioni diverse e può essere facilmente monitorato mediante assorbanza a 530 nm10,15,18. Per stabilire un protocollo di espressione CF efficiente per un nuovo MP, si raccomanda l'ottimizzazione del codone del frame di lettura target e l'utilizzo di fusioni con GFP collegata C-terminalmente25,26. Ulteriori materiali richiesti includono sostanze chimiche ed enzimi che sono tutti disponibili in commercio. Questi componenti devono essere ottenuti in alta qualità e un calcolo del costo complessivo per la reazione CF descritta con 3 mL di RM e 60 mL di FM ammonterebbe a circa 150-200 €. Un'applicazione primaria per i sistemi di espressione CF è quindi la produzione di proteine difficili da ottenere nei classici sistemi di espressione basati su cellule come molti MP o tossine. I sistemi CF sono inoltre piattaforme fondamentali nella biologia sintetica e campi di applicazione in continua crescita li rendono sempre più indispensabili come strumento nella ricerca molecolare. Tra le altre applicazioni, di routine sono l'etichettatura delle proteine, i processi ad alto rendimento o la progettazione di cellule sintetiche.
La strategia dimostrata consente la produzione senza detergenti di MP puri già inseriti negli ambienti lipidici desiderati di nanodischi altamente solubili. Una volta stabilito e ottimizzato il protocollo di espressione CF per un MP, la produzione è molto veloce e campioni puri possono essere ottenuti in meno di 24 ore anche in scala preparativa. I complessi MP/nanodisco vengono purificati direttamente dalla reazione CF tramite streptavidina II o tag poliistidinici attaccati all'MP. Il processo consente l'analisi funzionale e strutturale parallela di campioni MP identici mediante una serie di tecniche diverse33. La rapidità e l'efficienza della strategia sono quindi competitive rispetto agli approcci convenzionali che impiegano sistemi di espressione basati su cellule e l'estrazione detergente di MP dalle membrane cellulari seguita da ricostituzione in vitro di routine 5,34. L'accessibilità aperta delle reazioni CF facilita ulteriormente numerosi studi meccanicistici unici di ripiegamento MP e inserimento di membrana 15,16,18, assemblaggio complesso MP15,18,24 o regolazione funzionale 23.
Un'importante differenza tra l'espressione della CF e l'espressione basata sulle cellule è l'assenza di sistemi di controllo della qualità per il prodotto proteico sintetizzato. Qualsiasi polipeptide tradotto indipendente dal suo ripiegamento funzionale finirà nel campione finale del prodotto. Inoltre, il processo di inserimento nelle membrane dei nanodischi è artificiale e indipendente dal translocon e può comportare un'integrazione incompleta o potrebbe non funzionare affatto con un certo numero di bersagli MP. La frazione di prodotto infine solubilizzata in una reazione CF potrebbe quindi essere abbastanza eterogenea contenente MP completamente inseriti ma anche solo parzialmente integrati o associati alla membrana. Di conseguenza, solo una piccola frazione di un campione purificato di complessi MP/nanodischi potrebbe essere ripiegata funzionalmente. La modifica della composizione della membrana e l'attenta messa a punto dei rapporti MP/nanodischi modulando le concentrazioni di nanodischi e modelli di DNA sono strumenti adatti per l'ottimizzazione. Tuttavia, gli approcci di controllo della qualità a valle, come il profilo di esclusione dimensionale e i saggi funzionali quantitativi specifici per il target, sono sempre necessari per l'ottimizzazione dei protocolli di espressione della CF. La disponibilità di tali saggi può quindi limitare le applicazioni, in particolare nei progetti che includono MP che richiedono ambienti liposomici per funzioni come trasportatori, canali o pompe. Inoltre, le limitazioni delle dimensioni dei nanodischi potrebbero limitare l'inserimento di grandi gruppi MP.
Negli esempi documentati, la variazione della frazione funzionalmente piegata del GPCR Tβ1AR-GFP è compresa nell'intervallo di pochi punti percentuali, fino a circa il 30%. Il folding funzionale richiede un'attenta regolazione di un certo numero di parametri14 e un simile processo di ottimizzazione individuale e noioso potrebbe essere necessario anche per altri GPCR22. Tuttavia, la resa finale del GPCR funzionalmente ripiegato è competitiva con altri sistemi di produzione e consente la messa a punto di > 1.000 saggi radio per studi di legame del ligando da una singola reazione da 60 μL in un reattore Mini-CECF su scala analitica. Vale la pena ricordare che gli studi di legame del ligando dei costrutti di fusione GPCR-GFP non richiedono alcuna fase di purificazione. Se necessario, la purificazione può essere ottenuta sfruttando i tag di affinità attaccati al MP sintetizzato, come His-tags o Strep-tag II. L'RM viene quindi diluito nel tampone desiderato e caricato sulla corrispondente colonna cromatografica di affinità che è stata pre-equilibrata di conseguenza. La valutazione strutturale di PR e di altri MP sintetizzati con CF mediante spettroscopia NMR o cristallizzazione hanno già contribuito a stabilire i sistemi di espressione CF come piattaforme fondamentali nella ricerca MP. La strategia descritta per la produzione di complessi MP/nanodischi potrebbe diventare particolarmente interessante per futuri studi strutturali mediante microscopia elettronica.

Le proteine di membrana (MP) sono obiettivi impegnativi negli studi sulla produzione di proteine a causa della loro insolubilità in ambienti acquosi. Le piattaforme di produzione MP convenzionali comprendono sistemi basati su cellule come E. coli, lievito o cellule eucariotiche. Gli MP ricombinanti sintetizzati vengono estratti dalle membrane cellulari o ripiegati dai corpi di inclusione1. Dopo la solubilizzazione del detergente, gli MP possono essere trasferiti in ambienti di membrana adatti mediante protocolli di ricostituzione in vitro stabiliti. Oltre alle vescicole e ai liposomi, la ricostituzione di MP nelle membrane planari sotto forma di nanodischi2 o particelle salipro3 è diventata una tecnica di routine negli ultimi tempi. Tuttavia, tutte queste strategie implicano il contatto del detergente con i MP che può provocare destabilizzazione, dissociazione degli oligomeri e persino perdita della struttura e dell'attività proteica4. Lo screening per condizioni ottimali di solubilizzazione e ricostituzione del detergente può quindi essere noioso e richiedere molto tempo5.
La natura aperta dei sistemi cell-free (CF) consente di fornire direttamente la reazione di espressione con membrane preformate con una composizione lipidica definita. In questa modalità di espressione a base lipidica (L-CF), i MP sintetizzati hanno l'opportunità di inserire co-traduzionalmente nei doppi strati forniti 6,7 (Figura 1). I nanodischi costituiti da una proteina di scaffold di membrana (MSP) che circonda un disco planare lipidico a doppio strato8 sembrano essere particolarmente adatti per questa strategia 9,10. I nanodischi possono essere assemblati di routine in vitro con una varietà di lipidi diversi, sono molto stabili e le scorte possono essere concentrate fino a 1 mM. Tuttavia, l'espressione della MSP in E. coli e la sua purificazione sono necessarie. Come strategia alternativa, la MSP può essere co-espressa insieme al target MP nelle reazioni CF fornite con liposomi11,12,13. I modelli di DNA sia per MSP che MP vengono aggiunti nella reazione e MP/nanodischi possono formarsi durante l'espressione. Mentre la produzione di MSP è evitata, la strategia di co-espressione richiede un'attenta messa a punto delle concentrazioni finali del modello di DNA e ci si possono aspettare variazioni più elevate nell'efficienza della produzione del campione.
L'inserimento co-traduzionale di MP in membrane di nanodischi preformati è un meccanismo non fisiologico e ancora in gran parte sconosciuto indipendente dai macchinari translocon e dalle sequenze di segnale13,14,15,16. I principali determinanti dell'efficienza di inserzione sono il tipo di proteina di membrana e la composizione lipidica della membrana fornita, con una frequente preferenza per i lipidi caricati negativamente15,17. Poiché le membrane dei nanodischi sono di dimensioni relativamente limitate, una notevole quantità di lipidi viene rilasciata dopo l'inserimento MP18. La variazione della dimensione del nanodisco consente l'inserimento e la messa a punto di complessi MP oligomerici superiori15,18. Tra gli altri, è stato dimostrato il corretto assemblaggio di complessi omooligomerici per il canale ionico KcsA, per la pompa ionica proteorodopsina (PR) e per il trasportatore multifarmaco EmrE15,18. È probabile che gli MP entrino nella membrana simmetrica del nanodisco da entrambi i lati con una frequenza relativamente uguale. Va pertanto considerato che diversi monomeri o oligomeri inseriti in un nanodisco possono avere orientamenti opposti. Tuttavia, un bias nell'orientamento potrebbe essere causato da meccanismi di inserzione cooperativa come riportato per la formazione di esameri PR e tetrameri KcsA18. Un'ulteriore distorsione nell'orientamento MP potrebbe derivare da interruttori di orientamento di MP inseriti probabilmente sul bordo delle membrane del nanodisco.
La produzione di lisati CF da ceppi di E. coli è una tecnica di routine affidabile e può essere eseguita in quasi tutti i laboratori biochimici19,20. Va considerato che, oltre alla formazione di ponti disolfuro, la maggior parte delle altre modifiche post-traduzionali sono assenti se un MP viene sintetizzato usando lisati di E. coli. Sebbene ciò possa generare campioni più omogenei per gli studi strutturali, potrebbe essere necessario escludere potenziali effetti sulla funzione dei singoli bersagli MP. Tuttavia, la produzione efficiente di campioni di alta qualità di recettori accoppiati a proteine G (GPCR)14,21,22, trasportatori eucariotici 23 o grandi gruppi eteromerici 24 in lisati CF di E. coli indica la loro idoneità anche per bersagli complessi. Le quantità su scala preparativa (≈ 1 mg/ml) di un campione possono essere ottenute con la configurazione senza cella a scambio continuo a due compartimenti (CECF), composta da un compartimento di una miscela di reazione (RM) e da un compartimento di miscela di alimentazione (FM). Il volume FM supera il volume RM da 15 a 20 volte e fornisce un serbatoio di composti energetici a basso peso molecolare e precursori19. La reazione di espressione viene così estesa per diverse ore e la resa finale del target MP viene aumentata. I compartimenti RM e FM sono separati da una membrana di dialisi con un cutoff di 10-14 kDa. I due compartimenti richiedono un design speciale del contenitore di reazione CECF (Figura 1). Le cassette di dialisi commerciali come contenitori RM in combinazione con contenitori in plexiglass su misura contenenti il FM sono esempi adatti. Le rese MP possono essere ulteriormente manipolate modificando i rapporti RM:FM o scambiando l'FM dopo un certo periodo di incubazione.
La resa e la qualità di un MP richiedono spesso un'intensa ottimizzazione dei parametri di reazione. Un importante vantaggio dell'espressione CF è la possibilità di modificare e mettere a punto quasi tutti i composti in base alle esigenze individuali di un MP. Una strategia semplice consiste nel concentrarsi prima sul miglioramento della resa di un MP stabilendo un protocollo di produzione di base e quindi sull'ottimizzazione della qualità MP regolando le condizioni di reazione e piegatura. L'assenza di processi fisiologici nei lisati CF e la loro ridotta complessità si traducono in alti tassi di successo per la produzione efficiente di MP25. Le considerazioni di routine per la progettazione del modello di DNA e l'ottimizzazione della concentrazione di ioni Mg 2+ sono nella maggior parte dei casi sufficienti per ottenere rendimenti soddisfacenti26. A seconda della modalità di espressione, l'ottimizzazione della qualità MP può richiedere molto tempo, poiché è necessario esaminare una maggiore varietà di parametri14,17,22.
Per stabilire la piattaforma di espressione CF descritta, sono necessari protocolli per la produzione di E. coli CF lisato (i), T7 RNA polimerasi (ii), nanodischi (iii) e composti di reazione CECF di base (iv) (Figura 1). I derivati di E. coli K12 ceppo A1927 o BL21 sono frequentemente utilizzati per la preparazione di lisati efficienti S30 (centrifugazione a 30.000 x g). Oltre ai lisati S30, possono essere utilizzati lisati corrispondenti centrifugati ad altre forze g (ad esempio S12). I lisati differiscono nell'efficienza di espressione e nella complessità del proteoma. Il proteoma del lisato S30 preparato dal protocollo descritto è stato studiato in dettaglio28. Il proteoma S30 contiene ancora alcune proteine residue della membrana esterna che potrebbero dare problemi di fondo durante l'espressione e l'analisi dei canali ionici. Per tali obiettivi, si raccomanda l'uso di lisati S80-S100. Una preziosa modifica durante la preparazione del lisato è l'induzione della risposta SOS mediante shock termico combinato e fornitura di etanolo nella fase di crescita intermedia delle cellule. I lisati HS30 risultanti sono arricchiti in chaperoni e possono essere utilizzati in miscele con lisati S30 per migliorare il ripiegamento MP22. L'espressione di CF in lisati di E. coli è operata come un processo di trascrizione/traduzione accoppiato con modelli di DNA contenenti promotori controllati dalla T7 RNA polimerasi (T7RNAP). L'enzima può essere prodotto in modo efficiente nelle cellule stellari BL21(DE3) che trasportano il plasmide 29 pAR1219.
Due copie di MSP1E3D1 si assemblano in un nanodisco con un diametro di 10-12 nm, ma il protocollo descritto di seguito può funzionare anche per altri derivati MSP. Tuttavia, i nanodischi più grandi di quelli formati con MSP1E3D1 tendono ad essere meno stabili, mentre i nanodischi più piccoli formati con derivati MSP come MSP1 potrebbero non ospitare MP o complessi MP più grandi. I nanodischi MSP1E3D1 possono essere assemblati in vitro con una grande varietà di lipidi o miscele lipidiche diverse. I nanodischi preformati sono generalmente stabili per > 1 anno a -80 °C, mentre la stabilità può variare per diversi componenti lipidici. Per lo screening degli effetti lipidici sul ripiegamento e sulla stabilità di un MP, è necessario preparare un set completo di nanodischi assemblati con una varietà rappresentativa di miscele lipidiche / lipidiche. I seguenti lipidi possono dare una buona selezione di partenza: 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) (DMPG), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1,2 dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerolo) (DOPG), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) (POPG) e 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC).
Viene descritto un protocollo per la preparazione di una reazione CECF da 3 ml. È possibile un ulteriore ridimensionamento verso l'alto o verso il basso in un rapporto 1:1. Per la configurazione CECF a due compartimenti, devono essere preparati un RM contenente tutti i composti e un FM contenente solo i composti a basso peso molecolare. I dispositivi commerciali per dialisi da 3 mL con MWCO da 10-14 kDa possono essere utilizzati come contenitori RM, che vengono poi collocati in contenitori in plexiglass personalizzati contenenti FM (Figura 1D)30. Il rapporto RM:FM è 1:20, quindi 60 mL di FM devono essere preparati per 3 mL RM. La qualità, la concentrazione o il tipo di diversi componenti possono essere critici per la resa finale e/o la qualità del MP sintetizzato (Tabella 1). I modelli di DNA devono essere preparati secondo le linee guida pubblicate e l'ottimizzazione del codone del frame di lettura del bersaglio può migliorare ulteriormente significativamente la resa del prodotto26. Per la reazione CECF su scala preparativa, viene descritto un protocollo stabilito per la produzione di PR. Per stabilire protocolli di espressione per i nuovi MP, di solito è necessario eseguire schermate di ottimizzazione di alcuni composti (Tabella 1) per migliorare la resa e la qualità. Per gli ioni Mg2+ , esiste un ottimale di concentrazione ben focalizzato che spesso mostra variazioni significative per diversi modelli di DNA. Altri composti di reazione CF come nuovi lotti di lisati T7RNAP o S30 possono spostare ulteriormente la concentrazione ottimale di Mg2+ . Ad esempio, viene descritto un tipico schermo Mg 2+ nell'intervallo di concentrazione di14-24 mM e in incrementi di 2 mM. Ogni concentrazione viene sottoposta a screening in duplicati e in reazioni CECF su scala analitica. Come contenitore di reazione CECF, i contenitori in plexiglas Mini-CECF su misura30 che contengono l'RM vengono utilizzati in combinazione con micropiastre standard a 24 pozzetti che contengono l'FM (Figura 1B). In alternativa, possono essere utilizzate cartucce per dialisi commerciali in combinazione con micropiastre a pozzetti profondi 96 o altri dispositivi dializzatori commerciali in configurazioni appropriate (Figura 1C).

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840445P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840475C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4227</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>9781</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]-dihydroalprenolol Hydrochloride</td><td>American Radiolabeled Chemicals (USA)</td><td>ART0134</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)</td><td>Merck (Germany)</td><td>1409</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate (ATP)</td><td>Sigma Aldrich (Germany)</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>Alprenolol hydrochloride</td><td>Merck (Germany)</td><td>A0360000</td><td></td></tr><tr><td>Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose&amp;reg;</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>Q1126</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Type GE 446EC-1</td><td>Gettinge (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor Type 884 124/1</td><td>B.Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cholic acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>8137</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks</td><td>Schott Duran (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5&#039;-triphosphate disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>C1506</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose monohydrate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing Spectrum&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Labs Spectra/Por&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 12-14 kD MWCO Standard RC tubing</td><td>Fisher Scientific (Germany)</td><td>8700152</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreit</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Folinic acid calcium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>French pressure cell disruptor</td><td>SLM; Amico Instruments (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate di-sodium salt (GTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>K025</td><td></td></tr><tr><td>IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL</td><td>GE Life Sciences (Germany)</td><td>GE17-5248</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3899</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-&amp;beta;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>2316</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3076.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>HN23</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartic Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T202</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T203</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3774</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3772</td><td></td></tr><tr><td>L-Glycine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3187</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3852</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1699</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4207</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>9359</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1713</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1709</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4682</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1738</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>7700</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T207</td><td></td></tr><tr><td>MD100 dialysis units</td><td>Scienova (Germany)</td><td>40077</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N-2&lt;/em&gt;-Hydroxyethylpiperazine-&lt;em&gt;N&#039;-2&lt;/em&gt;-ethansulfonic acid (HEPES)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecylphosphocholine</td><td>Antrace (USA)</td><td>F308S</td><td></td></tr><tr><td>PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE gel power supply: Power Pac 3000</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone/peptone from caseine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6681</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump: ip-12</td><td>Ismatec (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphoenol pyruvate monopotassium salt</td><td>Sigma Aldrich (Germany)</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>P018</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4986</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate Kinase</td><td>Roche (Germany)</td><td>10109045001</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation counter: Hidex 300 SL</td><td>Hidex (Finland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>8029</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>K305</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Nanodrop</td><td>Peqlab (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer/fluorescence reader Spark&amp;reg;</td><td>Tecan (Switzerland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tRNA (E. coli)</td><td>Roche (Germany)</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Ultra sonificator</td><td>Labsonic U, B. Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5&amp;rsquo;-triphosphate tri-sodium salt (UTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>Y-30 antifoam</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>A6457</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>2904</td><td></td></tr></tbody></table>

co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs

I sistemi di espressione cell-free consentono la progettazione su misura di ambienti di reazione per supportare il ripiegamento funzionale di proteine anche complesse come le proteine di membrana. Vengono dimostrate le procedure sperimentali per l'inserimento e il ripiegamento co-traduzionale di proteine di membrana in membrane preformate e definite fornite come nanodischi. Il protocollo è completamente privo di detergenti e può generare milligrammi di campioni purificati in un giorno. I campioni di proteine di membrana/nanodisco risultanti possono essere utilizzati per una varietà di studi funzionali e applicazioni strutturali come la cristallizzazione, la risonanza magnetica nucleare o la microscopia elettronica. Viene descritta la preparazione di componenti chiave di base come lisati cell-free, nanodischi con membrane progettate, soluzioni stock critiche e l'assemblaggio di reazioni di espressione prive di cellule a due compartimenti. Poiché i requisiti di ripiegamento delle proteine di membrana possono essere molto diversi, un obiettivo principale di questo protocollo è la modulazione dei parametri e delle fasi di reazione importanti per la qualità del campione come i composti critici di reazione di base, la composizione della membrana dei nanodischi, l'ambiente redox e chaperone o la progettazione del modello di DNA. L'intero processo è dimostrato con la sintesi di proteorodopsina e un recettore accoppiato alla proteina G.

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Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

L'inserimento co-traduzionale in nanodischi preformati rende possibile lo studio di proteine di membrana sintetizzate prive di cellule in ambienti lipidici definiti senza contatto con detergenti. Questo protocollo descrive la preparazione dei componenti essenziali del sistema e i parametri critici per migliorare l'efficienza dell'espressione e la qualità del campione.

Inserimento co-traduzionale di proteine di membrana in nanodischi preformati

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.3K Views.  Goethe University Frankfurt. L'inserimento co-traduzionale in nanodischi preformati rende possibile lo studio di proteine di membrana sintetizzate prive di cellule in ambienti lipidici definiti senza contatto con detergenti. Questo protocollo descrive la preparazione dei componenti essenziali del sistema e i parametri critici per migliorare l'efficienza dell'espressione e la qualità del campione.

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Ricerca

Biochimica

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To study retrograde protein traffic, we have recently developed a versatile nanobody-based toolkit to analyze transport from the cell surface to the Golgi complex, either by fixed and live cell imaging, by electron microscopy, or biochemically. We engineered functionalized anti-green fluorescent protein (GFP) nanobodies &#8212; small, monomeric, high-affinity protein binders &#8212; that can be applied to cell lines expressing membrane proteins of interest with an extracellular GFP moiety. Derivatized nanobodies bound to the GFP reporters are specifically internalized and transported piggyback along the reporters&#39; sorting routes. Nanobodies were functionalized with fluorophores to follow retrograde transport by fluorescence microscopy and live imaging, with ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to investigate the ultrastructural localization of reporter-nanobody complexes by electron microscopy, and with tyrosine sulfation (TS) motifs to assess kinetics of trans-Golgi network (TGN) arrival. In this methodological article, we outline the general procedure to bacterially express and purify functionalized nanobodies. We illustrate the powerful use of our tool using the mCherry- and TS-modified nanobodies to analyze endocytic uptake and TGN arrival of cargo proteins.

Retrograde transport of proteins from the cell surface to the Golgi is essential to maintain membrane homeostasis. Here, we describe a method to biochemically analyze cell surface-to-Golgi transport of recombinant proteins using functionalized nanobodies in HeLa cells.

Analisi dell'endocitosi assorbimento e trasporto retrogrado alla rete Trans-Golgi utilizzando Nanobodies funzionalizzati in cellule coltivate

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per l'analisi dell'interazione proteina-proteina di membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

Formulazione e caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodischi

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a particularly attractive option for studying membrane proteins, especially in the context of ligand-receptor interactions. The method pioneered by Sligar and colleagues is based on the amphipathic properties of an engineered highly a-helical scaffold protein derived from the apolipoprotein A1. The hydrophobic faces of the scaffold protein interact with the fatty acyl side-chains of the lipid bilayer whereas the polar regions face the aqueous environment. Analyses of membrane proteins in nanodiscs have significant advantages over liposome because the particles are small, homogeneous and water-soluble. In addition, biochemical and biophysical methods normally reserved to soluble proteins can be applied, and from either side of the membrane. In this visual protocol, we present a step-by-step reconstitution of a well characterized bacterial ABC transporter, the MalE-MalFGK2 complex. The formation of the disc is a self-assembly process that depends on hydrophobic interactions taking place during the progressive removal of the detergent. We describe the essential steps and we highlight the importance of choosing a correct protein-to-lipid ratio in order to limit the formation of aggregates and larger polydisperse liposome-like particles. Simple quality controls such as gel filtration chromatography, native gel electrophoresis and dynamic light scattering spectroscopy ensure that the discs have been properly reconstituted.

Nanodiscs are small discoid particles that incorporate membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. We provide a visual protocol that shows the step-by-step incorporation of the MalFGK2 transporter into a disc.

A Step-by-step Metodo per la ricostituzione di un Transporter ABC in particelle lipidiche Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Biologia

Patterning proteico reversibile controllato dalla luce su membrane lipidiche

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Autore in primo piano: Reclutamento di proteine commutabili con foto per il patterning reversibile nei sistemi cellulari artificiali

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

Modelli proteici dinamici indotti dalla luce su membrane modello

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell ...

Bioingegneria

Protein Translocation Machinery on the ER Membrane

The translocon complex situated on the ER membrane is the main gateway for the protein secretory pathway. It facilitates the transport of nascent peptides into the ER lumen and their insertion into the ER membrane.
Sec61 protein conducting channel
In eukaryotes, the translocon complex comprises a core heterotrimeric translocator channel called the Sec61 complex. This channel includes three transmembrane proteins, Sec61&#945;, Sec61&#946;, and Sec61&#947;, and is the largest subunit of the translocon complex. In higher eukaryotes, such as mammals, the channel is capped in its resting state to prevent the leakage of ions like calcium into the cytosol.
Accessory protein complexes associated with the Sec61 channel
Sec62 and Sec63 are integral transmembrane proteins associated with the Sec61 complex. They are primarily involved in the functioning of the Sec61 channel&#39;s lateral gate and aid in the exit of the signal sequence and transmembrane domains into the lipid bilayer.
The translocon-associated protein or TRAP complex is a hetero-tetrameric constitutive subunit of the translocon complex, present behind the Sec61 channel. It assists in the binding of signal peptides having low hydrophobicity to the Sec61 channel. The oligosaccharyltransferase (OST) complex is another closely associated complex, which transfers pre-assembled glycans to select asparagine residues.
Some proteins, like the signal peptidase complex, associate with the translocon complex under specific conditions. For instance, the signal recognition particle receptor (SR) only interacts with the Sec61 channel to hand over the ribosome-nascent peptide complex during active translocation. Other proteins like lectin chaperones (calnexin and malectin) and sensor molecules (IRE1) associate with the translocon to correctly fold the incoming polypeptide or signal misfolded proteins.

Macchinari di traslocazione delle proteine sulla membrana del reticolo endoplasmatico

The translocon complex situated on the ER membrane is the main gateway for the protein secretory pathway. It facilitates the transport of nascent peptides ...

Didattica

JoVE Core

Cell Biology

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

TERMINI E CONCETTI CHIAVE

Cotranslational Protein Translocation

Translocation of proteins across membranes is an ancient process that occurs even in bacteria and archaebacteria. In fact, the components of the translocation machinery are still conserved between prokaryotes and eukaryotes.
Sec61 channel partners for cotranslational translocation
During cotranslational translocation, the Sec61 channel partners with the signal recognition particle (SRP), the signal recognition particle receptor (SR), and the ribosomes to transport the nascent polypeptide chain into the lumen.
SRP mediates ribosome attachment to the Sec61 complex via the polypeptide exit tunnel of the large ribosomal subunit. The GTPase domains on both SRP and SR carry out GTP hydrolysis, which supports the transfer of the target polypeptide to the Sec61 channel. Subsequently, the ribosomes act as primary translocation motors and push the protein towards the ER lumen. Except for the GTPs spent during peptide chain elongation, no additional energy is expended for the protein to descend through the channel.&#160;
Accessory translocon complex proteins involved in cotranslational translocation
The translocating chain-associating membrane (TRAM) protein and translocon-associated protein (TRAP) complex are auxiliary components associated with the Sec61 channel during SRP-mediated translocation. The TRAP complex is a substrate-specific complex essential for secure anchoring of the signal sequences having low hydrophobicity. Its proteins directly interact with Sec61 and keep the channel in open confirmation to compensate for the weak interaction with the signal sequence.
On the other hand, TRAM is a membrane protein that acts as a chaperone. It assists in folding and membrane integration of cotranslationally translocating proteins.

Inserimento co-traduzionale di proteine di membrana in nanodischi preformati

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Analisi dell'endocitosi assorbimento e trasporto retrogrado alla rete Trans-Golgi utilizzando Nanobodies funzionalizzati in cellule coltivate

Sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per l'analisi dell'interazione proteina-proteina di membrana

Formulazione e caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodischi

A Step-by-step Metodo per la ricostituzione di un Transporter ABC in particelle lipidiche Nanodisc

Modelli proteici dinamici indotti dalla luce su membrane modello

Modelli proteici dinamici indotti dalla luce su membrane modello

Modelli proteici dinamici indotti dalla luce su membrane modello

Macchinari di traslocazione delle proteine sulla membrana del reticolo endoplasmatico

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Modelli proteici dinamici indotti dalla luce su membrane modello

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