Name: co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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Wir danken der Förderung der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) BE1911/8-1, dem LOEWE-Projekt GLUE und dem Sonderforschungsbereich Transport and Communication across Membranes (SFB807) für die finanzielle Unterstützung.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der Aufbau und die Strategien zur Optimierung der CF-Expression und der co-translationalen Insertion von funktionellen MPs in Nanoscheiben werden beschrieben. Die erforderliche Ausrüstung umfasst einen Bioreaktor, eine französische Pressvorrichtung oder ähnliches, einen UV/VIS- und Fluoreszenzreader, CF-Reaktionsgefäße, die für einen Zwei-Kompartiment-Konfigurationsaufbau geeignet sind, und einen temperaturgesteuerten Inkubator. Weitere Standardgeräte sind Zentrifugen zur Gewinnung von E. coli-Zellen sowi...

Membranproteine (MPs) sind aufgrund ihrer Unlöslichkeit in wässrigen Umgebungen anspruchsvolle Ziele in Proteinproduktionsstudien. Herkömmliche MP-Produktionsplattformen umfassen zellbasierte Systeme wie E. coli, Hefe oder eukaryotische Zellen. Die synthetisierten rekombinanten MPs werden entweder aus Zellmembranen extrahiert oder aus Einschlusskörpern refoldet1. Nach der Detergensolubilisierung können MPs durch etablierte In-vitro-Rekonstitutionsprotokolle in geeignete Membranumgebungen überführt werden. Neben Vesikeln und Liposomen ist die MP-Rekonstitution in planare Membranen in Form von Nanodiscs2 - oderSalipro-3-Partikeln in jüngster Zeit zur Routine geworden. Alle diese Strategien implizieren jedoch einen Waschmittelkontakt mit MPs, der zu Destabilisierung, Dissoziation von Oligomeren und sogar zum Verlust der Proteinstruktur und -aktivität führen kann4. Das Screening auf optimale Reinigungsmittel-Solubilisierungs- und Rekonstitutionsbedingungen kann daher mühsam und zeitaufwendig sein5.
Die Offenheit zellfreier (CF) Systeme ermöglicht es, die Expressionsreaktion direkt mit vorgeformten Membranen mit definierter Lipidzusammensetzung zu versorgen. In diesem lipidbasierten Expressionsmodus (L-CF) haben die synthetisierten MPs die Möglichkeit, co-translational in die bereitgestellten Doppelschichten 6,7 einzufügen (Abbildung 1). Nanoscheiben, die aus einem Membrangerüstprotein (MSP) bestehen, das eine planare Lipiddoppelschichtscheibe8 umgibt, scheinen für diese Strategie 9,10 besonders geeignet zu sein. Nanoscheiben können routinemäßig in vitro mit einer Vielzahl verschiedener Lipide zusammengesetzt werden, sie sind sehr stabil und die Bestände können bis zu 1 mM konzentriert werden. Die MSP-Expression in E. coli und ihre Reinigung ist jedoch notwendig. Als alternative Strategie kann MSP zusammen mit dem Ziel-MP in CF-Reaktionen exprimiert werden, die mit Liposomen11,12,13 versorgt werden. DNA-Templates für MSP und MP werden der Reaktion hinzugefügt und MP / Nanodiscs können sich bei der Expression bilden. Während die MSP-Produktion vermieden wird, erfordert die Co-Expressionsstrategie eine sorgfältige Feinabstimmung der endgültigen DNA-Template-Konzentrationen, und höhere Schwankungen in der Effizienz der Probenproduktion sind zu erwarten.
Das co-translationale Einfügen von MPs in Membranen vorgeformter Nanoscheiben ist ein unphysiologischer und noch weitgehend unbekannter Mechanismus, der unabhängig von Translokationsmaschinen und Signalsequenzen13,14,15,16 ist. Hauptdeterminanten der Insertionseffizienz sind die Art des Membranproteins sowie die Lipidzusammensetzung der bereitgestellten Membran, wobei häufig negativ geladene Lipidebevorzugt werden 15,17. Da die Nanoscheibenmembranen relativ begrenzt sind, wird bei MP-Insertion18 eine beträchtliche Menge an Lipiden freigesetzt. Die Variation der Nanoscheibengröße ermöglicht das Einfügen und Einstellen von höheren oligomeren MP-Komplexen15,18. Unter anderem wurde der korrekte Aufbau homooligomerer Komplexe für den Ionenkanal KcsA, für die Ionenpumpe Proteorhodopsin (PR) und für den Multidrug-Transporter EmrE15,18 gezeigt. MPs werden wahrscheinlich von beiden Seiten mit relativ gleicher Frequenz in die symmetrische Nanoscheibenmembran eindringen. Es sollte daher berücksichtigt werden, dass verschiedene Monomere oder Oligomere, die in eine Nanoscheibe eingefügt werden, entgegengesetzte Orientierungen aufweisen können. Eine Verzerrung der Orientierung könnte jedoch durch kooperative Insertionsmechanismen verursacht werden, wie sie für die Bildung von PR-Hexamern und KcsA-Tetrameren berichtetwurden 18. Eine weitere Verzerrung in der MP-Orientierung könnte sich aus Orientierungsschaltern von eingefügten MPs ergeben, wahrscheinlich am Rand der Nanoscheibenmembranen.
Die Herstellung von CF-Lysaten aus E. coli-Stämmen ist eine zuverlässige Routinetechnik und kann in fast jedem biochemischen Labor durchgeführt werden19,20. Es sollte berücksichtigt werden, dass neben der Disulfidbrückenbildung die meisten anderen posttranslationalen Modifikationen fehlen, wenn ein MP mit E. coli-Lysaten synthetisiert wird. Während dies homogenere Stichproben für Strukturstudien erzeugen könnte, kann es notwendig sein, mögliche Auswirkungen auf die Funktion einzelner MP-Ziele auszuschließen. Die effiziente Herstellung von qualitativ hochwertigen Proben von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR)14,21,22, eukaryotischen Transportern23 oder großen heteromeren Anordnungen 24 in E. coli-CF-Lysaten zeigt jedoch deren Eignung auch für komplexe Targets. Präparative Skalenmengen (≈ 1 mg/ml) einer Probe können mit der CECF-Konfiguration (Continuous Exchange Cell-Free) mit zwei Kompartimenten erhalten werden, die aus einem Reaktionsgemisch (RM) und einem Fütterungsgemisch (FM) besteht. Das FM-Volumen übersteigt das RM-Volumen um das 15- bis 20-fache und bietet ein Reservoir an niedermolekularen Energieverbindungen und Vorläufern19. Die Expressionsreaktion wird somit um mehrere Stunden verlängert und die Endausbeute des MP-Targets erhöht. Die RM- und FM-Fächer sind durch eine Dialysemembran mit einem Cutoff von 10-14 kDa getrennt. Die beiden Kompartimente erfordern ein spezielles Design des CECF-Reaktionsbehälters (Abbildung 1). Kommerzielle Dialysekassetten als RM-Container in Kombination mit maßgeschneiderten Plexiglasbehältern mit dem FM sind geeignete Beispiele. MP-Ausbeuten können weiter manipuliert werden, indem das RM:FM-Verhältnis geändert oder das FM nach einer bestimmten Inkubationszeit ausgetauscht wird.
Ausbeute und Qualität eines MP erfordern häufig eine intensive Optimierung der Reaktionsparameter. Ein wichtiger Vorteil der CF-Expression ist die Möglichkeit, nahezu jede Verbindung nach den individuellen Anforderungen eines MP zu modifizieren und zu feinabstimmen. Eine einfache Strategie besteht darin, sich zunächst auf die Verbesserung der Ausbeute eines MP zu konzentrieren, indem ein grundlegendes Produktionsprotokoll erstellt wird, und dann die MP-Qualität durch Feinabstimmung der Reaktions- und Faltbedingungen zu optimieren. Das Fehlen physiologischer Prozesse in CF-Lysaten und deren reduzierte Komplexität führen zu hohen Erfolgsraten für die effiziente Herstellung von MPs25. Routineüberlegungen für das Design von DNA-Templates und die Optimierung derMg2+-Ionenkonzentration reichen in den meisten Fällen aus, um zufriedenstellende Ausbeuten zu erzielen26. Je nach Ausdrucksmodus kann die Optimierung der MP-Qualität zeitaufwändig werden, da eine größere Vielfalt von Parametern gescreent werden muss14,17,22.
Um die beschriebene CF-Expressionsplattform zu etablieren, sind Protokolle für die Herstellung von E. coli-CF-Lysat (i), T7-RNA-Polymerase (ii), Nanodiscs (iii) und den grundlegenden CECF-Reaktionsverbindungen (iv) erforderlich (Abbildung 1). Die E. coli K12 Stamm A1927 oder BL21 Derivate werden häufig zur Herstellung von effizienten S30 (Zentrifugation bei 30.000 x g) Lysaten verwendet. Neben S30-Lysaten können entsprechende Lysate verwendet werden, die bei anderen g-Kräften (z.B. S12) zentrifugiert wurden. Die Lysate unterscheiden sich in der Expressionseffizienz und in der Proteomkomplexität. Das Proteom des nach dem beschriebenen Protokoll hergestellten S30-Lysats wurde eingehenduntersucht 28. Das S30-Proteom enthält noch einige restliche äußere Membranproteine, die Hintergrundprobleme bei der Expression und Analyse von Ionenkanälen verursachen könnten. Für solche Ziele wird die Verwendung von S80-S100-Lysaten empfohlen. Eine wertvolle Modifikation während der Lysataufbereitung ist die Induktion der SOS-Antwort durch kombinierte Hitzeschock- und Ethanolzufuhr in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase der Zellen. Die resultierenden HS30-Lysate sind mit Chaperonen angereichert und können in Mischungen mit S30-Lysaten für eine verbesserte MP-Faltungverwendet werden 22. Die CF-Expression in E. coli-Lysaten wird als gekoppelter Transkriptions-/Translationsprozess mit DNA-Templates betrieben, die Promotoren enthalten, die von der T7-RNA-Polymerase (T7RNAP) kontrolliert werden . Das Enzym kann effizient in BL21(DE3)-Sternzellen hergestellt werden, die das pAR1219-Plasmid29 tragen.
Zwei Kopien von MSP1E3D1 fügen sich zu einer Nanoscheibe mit einem Durchmesser von 10-12 nm zusammen, aber das unten beschriebene Protokoll kann auch für andere MSP-Derivate funktionieren. Nanoscheiben, die größer sind als die mit MSP1E3D1 gebildeten, sind jedoch tendenziell weniger stabil, während kleinere Nanoscheiben, die mit MSP-Derivaten wie MSP1 gebildet werden, möglicherweise keine größeren MPs oder MP-Komplexe aufnehmen. MSP1E3D1-Nanoscheiben können in vitro mit einer Vielzahl unterschiedlicher Lipide oder Lipidgemische zusammengesetzt werden. Vorgeformte Nanoscheiben sind in der Regel für > 1 Jahr bei -80 °C stabil, während die Stabilität für verschiedene Lipidkomponenten variieren kann. Für das Screening von Lipideffekten auf die Faltung und Stabilität eines MP ist es notwendig, einen umfassenden Satz von Nanoscheiben herzustellen, die mit einer repräsentativen Vielfalt von Lipiden / Lipidmischungen zusammengesetzt sind. Die folgenden Lipide können eine gute Ausgangsauswahl ergeben: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC), 1,2 Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerin) (DOPG), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) und 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC).
Ein Protokoll zur Herstellung einer 3-ml-CECF-Reaktion wird beschrieben. Eine weitere Skalierung nach oben oder unten im Verhältnis 1:1 ist möglich. Für die CECF-Konfiguration mit zwei Kompartimenten muss ein RM hergestellt werden, der alle Verbindungen enthält, und ein FM, der nur die niedermolekularen Verbindungen enthält. Handelsübliche 3-ml-Dialysegeräte mit 10-14 kDa MWCO können als RM-Behälter verwendet werden, die dann in speziell angefertigte Plexiglasbehälter mit dem FM (Abbildung 1D)30 gelegt werden. Das Verhältnis von RM:FM beträgt 1:20, so dass 60 mL FM für 3 mL RM vorbereitet werden müssen. Qualität, Konzentration oder Art mehrerer Komponenten können für die Endausbeute und/oder Qualität des synthetisierten MP entscheidend sein (Tabelle 1). DNA-Templates sollten nach veröffentlichten Richtlinien erstellt werden und die Codon-Optimierung des Leserahmens des Ziels kann die Produktausbeute weiter signifikant verbessern26. Für die CECF-Reaktion im präparativen Maßstab wird ein etabliertes Protokoll für die Herstellung von PR beschrieben. Um Expressionsprotokolle für neue MPs zu erstellen, ist es in der Regel notwendig, Optimierungsscreens bestimmter Verbindungen (Tabelle 1) durchzuführen, um Ausbeute und Qualität zu verbessern. Für Mg2+ Ionen existiert ein gut fokussiertes Konzentrationsoptimal, das häufig signifikante Variationen für verschiedene DNA-Templates zeigt. Andere CF-Reaktionsverbindungen wie neue Chargen von T7RNAP oder S30-Lysaten können die optimaleMg2+ -Konzentration weiter verschieben. Als Beispiel wird ein typischer Mg 2+ Bildschirm im Bereich von 14-24 mM Konzentration und in Schritten von 2 mM beschrieben. Jede Konzentration wird in Duplikaten und in analytischen Reaktionen des CECF untersucht. Als CECF-Reaktionsbehälter werden kundenspezifische Mini-CECF-Plexiglasbehälter30 mit dem RM in Kombination mit Standard-24-Well-Mikroplatten verwendet, die das FM enthalten (Abbildung 1B). Alternativ können handelsübliche Dialysekartuschen in Kombination mit 96-tiefen Mikrotiterplatten oder anderen handelsüblichen Dialysatorgeräten in geeigneten Aufbauten verwendet werden (Abbildung 1C).

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840445P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840475C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4227</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>9781</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]-dihydroalprenolol Hydrochloride</td><td>American Radiolabeled Chemicals (USA)</td><td>ART0134</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)</td><td>Merck (Germany)</td><td>1409</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate (ATP)</td><td>Sigma Aldrich (Germany)</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>Alprenolol hydrochloride</td><td>Merck (Germany)</td><td>A0360000</td><td></td></tr><tr><td>Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose&amp;reg;</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>Q1126</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Type GE 446EC-1</td><td>Gettinge (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor Type 884 124/1</td><td>B.Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cholic acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>8137</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks</td><td>Schott Duran (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5&#039;-triphosphate disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>C1506</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose monohydrate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing Spectrum&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Labs Spectra/Por&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 12-14 kD MWCO Standard RC tubing</td><td>Fisher Scientific (Germany)</td><td>8700152</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreit</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Folinic acid calcium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>French pressure cell disruptor</td><td>SLM; Amico Instruments (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate di-sodium salt (GTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>K025</td><td></td></tr><tr><td>IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL</td><td>GE Life Sciences (Germany)</td><td>GE17-5248</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3899</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-&amp;beta;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>2316</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3076.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>HN23</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartic Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T202</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T203</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3774</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3772</td><td></td></tr><tr><td>L-Glycine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3187</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3852</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1699</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4207</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>9359</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1713</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1709</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4682</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1738</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>7700</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T207</td><td></td></tr><tr><td>MD100 dialysis units</td><td>Scienova (Germany)</td><td>40077</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N-2&lt;/em&gt;-Hydroxyethylpiperazine-&lt;em&gt;N&#039;-2&lt;/em&gt;-ethansulfonic acid (HEPES)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecylphosphocholine</td><td>Antrace (USA)</td><td>F308S</td><td></td></tr><tr><td>PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE gel power supply: Power Pac 3000</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone/peptone from caseine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6681</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump: ip-12</td><td>Ismatec (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphoenol pyruvate monopotassium salt</td><td>Sigma Aldrich (Germany)</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>P018</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4986</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate Kinase</td><td>Roche (Germany)</td><td>10109045001</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation counter: Hidex 300 SL</td><td>Hidex (Finland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>8029</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>K305</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Nanodrop</td><td>Peqlab (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer/fluorescence reader Spark&amp;reg;</td><td>Tecan (Switzerland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tRNA (E. coli)</td><td>Roche (Germany)</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Ultra sonificator</td><td>Labsonic U, B. Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5&amp;rsquo;-triphosphate tri-sodium salt (UTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>Y-30 antifoam</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>A6457</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>2904</td><td></td></tr></tbody></table>

co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs

Zellfreie Expressionssysteme ermöglichen das maßgeschneiderte Design von Reaktionsumgebungen, um die funktionelle Faltung selbst komplexer Proteine wie Membranproteine zu unterstützen. Die experimentellen Verfahren zur co-translationalen Insertion und Faltung von Membranproteinen in vorgeformte und definierte Membranen, die als Nanoscheiben geliefert werden, werden demonstriert. Das Protokoll ist völlig reinigungsmittelfrei und kann innerhalb eines Tages Milligramm gereinigter Proben erzeugen. Die resultierenden Membranprotein-/Nanoscheibenproben können für eine Vielzahl von funktionellen Studien und strukturellen Anwendungen wie Kristallisation, Kernspinresonanz oder Elektronenmikroskopie verwendet werden. Die Herstellung grundlegender Schlüsselkomponenten wie zellfreie Lysate, Nanoscheiben mit entworfenen Membranen, kritische Stammlösungen sowie der Aufbau von zellfreien Zweikompartiment-Expressionsreaktionen wird beschrieben. Da die Faltungsanforderungen von Membranproteinen sehr unterschiedlich sein können, liegt ein Schwerpunkt dieses Protokolls auf der Modulation von Parametern und Reaktionsschritten, die für die Probenqualität wichtig sind, wie kritische basische Reaktionsverbindungen, Membranzusammensetzung von Nanoscheiben, Redox- und Chaperonumgebung oder DNA-Template-Design. Der gesamte Prozess wird mit der Synthese von Proteorhodopsin und einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor demonstriert.

Der Einfluss der Feinabstimmung von Reaktionsverbindungen auf die Endausbeute oder Qualität synthetisierter MPs wird veranschaulicht. Ein häufiger Routineansatz besteht darin, die optimaleMg2+-Konzentration in CF-Reaktionen durch Expression von grün fluoreszierendem Protein (GFP) als bequemen Monitor der Systemeffizienz einzustellen. Als Beispiel wurde GFP aus einem pET-21a(+)-Vektor beiMg2+-Konzentrationen zwischen 14 und 24 mM synthetisiert (Abbildung 2). Die SDS-P...

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Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Die kotranslationale Insertion in vorgeformte Nanoscheiben ermöglicht es, zellfrei synthetisierte Membranproteine in definierten Lipidumgebungen ohne Kontakt mit Detergenzien zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung wesentlicher Systemkomponenten und die kritischen Parameter zur Verbesserung der Expressionseffizienz und Probenqualität.

Co-translationale Insertion von Membranproteinen in vorgeformte Nanoscheiben

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

co-translational-insertion-membrane-proteins-into-preformed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.3K Aufrufe.  Goethe University Frankfurt. Die kotranslationale Insertion in vorgeformte Nanoscheiben ermöglicht es, zellfrei synthetisierte Membranproteine in definierten Lipidumgebungen ohne Kontakt mit Detergenzien zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung wesentlicher Systemkomponenten und die kritischen Parameter zur Verbesserung der Expressionseffizienz und Probenqualität.

Serie: Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Forschung

Biochemie

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To study retrograde protein traffic, we have recently developed a versatile nanobody-based toolkit to analyze transport from the cell surface to the Golgi complex, either by fixed and live cell imaging, by electron microscopy, or biochemically. We engineered functionalized anti-green fluorescent protein (GFP) nanobodies &#8212; small, monomeric, high-affinity protein binders &#8212; that can be applied to cell lines expressing membrane proteins of interest with an extracellular GFP moiety. Derivatized nanobodies bound to the GFP reporters are specifically internalized and transported piggyback along the reporters&#39; sorting routes. Nanobodies were functionalized with fluorophores to follow retrograde transport by fluorescence microscopy and live imaging, with ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to investigate the ultrastructural localization of reporter-nanobody complexes by electron microscopy, and with tyrosine sulfation (TS) motifs to assess kinetics of trans-Golgi network (TGN) arrival. In this methodological article, we outline the general procedure to bacterially express and purify functionalized nanobodies. We illustrate the powerful use of our tool using the mCherry- and TS-modified nanobodies to analyze endocytic uptake and TGN arrival of cargo proteins.

Retrograde transport of proteins from the cell surface to the Golgi is essential to maintain membrane homeostasis. Here, we describe a method to biochemically analyze cell surface-to-Golgi transport of recombinant proteins using functionalized nanobodies in HeLa cells.

Analyse der Endocytic Aufnahme und retrograder Transport mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen mit dem Trans-Golgi-Netzwerk

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

Formulierung und Charakterisierung bioaktiver Wirkstoffe, die Nanoscheiben enthalten

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a particularly attractive option for studying membrane proteins, especially in the context of ligand-receptor interactions. The method pioneered by Sligar and colleagues is based on the amphipathic properties of an engineered highly a-helical scaffold protein derived from the apolipoprotein A1. The hydrophobic faces of the scaffold protein interact with the fatty acyl side-chains of the lipid bilayer whereas the polar regions face the aqueous environment. Analyses of membrane proteins in nanodiscs have significant advantages over liposome because the particles are small, homogeneous and water-soluble. In addition, biochemical and biophysical methods normally reserved to soluble proteins can be applied, and from either side of the membrane. In this visual protocol, we present a step-by-step reconstitution of a well characterized bacterial ABC transporter, the MalE-MalFGK2 complex. The formation of the disc is a self-assembly process that depends on hydrophobic interactions taking place during the progressive removal of the detergent. We describe the essential steps and we highlight the importance of choosing a correct protein-to-lipid ratio in order to limit the formation of aggregates and larger polydisperse liposome-like particles. Simple quality controls such as gel filtration chromatography, native gel electrophoresis and dynamic light scattering spectroscopy ensure that the discs have been properly reconstituted.

Nanodiscs are small discoid particles that incorporate membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. We provide a visual protocol that shows the step-by-step incorporation of the MalFGK2 transporter into a disc.

Eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Rekonstitution eines ABC-Transporter in Nanodisc Lipid Particles

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Biologie

Lichtgesteuerte reversible Proteinstrukturierung auf Lipidmembranen

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Autor im Rampenlicht: Photoschaltbare Proteinrekrutierung für reversible Musterbildung in künstlichen zellulären Systemen

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

Dynamische lichtinduzierte Proteinmuster an Modellmembranen

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell ...

Biotechnik

Protein Translocation Machinery on the ER Membrane

The translocon complex situated on the ER membrane is the main gateway for the protein secretory pathway. It facilitates the transport of nascent peptides into the ER lumen and their insertion into the ER membrane.
Sec61 protein conducting channel
In eukaryotes, the translocon complex comprises a core heterotrimeric translocator channel called the Sec61 complex. This channel includes three transmembrane proteins, Sec61&#945;, Sec61&#946;, and Sec61&#947;, and is the largest subunit of the translocon complex. In higher eukaryotes, such as mammals, the channel is capped in its resting state to prevent the leakage of ions like calcium into the cytosol.
Accessory protein complexes associated with the Sec61 channel
Sec62 and Sec63 are integral transmembrane proteins associated with the Sec61 complex. They are primarily involved in the functioning of the Sec61 channel&#39;s lateral gate and aid in the exit of the signal sequence and transmembrane domains into the lipid bilayer.
The translocon-associated protein or TRAP complex is a hetero-tetrameric constitutive subunit of the translocon complex, present behind the Sec61 channel. It assists in the binding of signal peptides having low hydrophobicity to the Sec61 channel. The oligosaccharyltransferase (OST) complex is another closely associated complex, which transfers pre-assembled glycans to select asparagine residues.
Some proteins, like the signal peptidase complex, associate with the translocon complex under specific conditions. For instance, the signal recognition particle receptor (SR) only interacts with the Sec61 channel to hand over the ribosome-nascent peptide complex during active translocation. Other proteins like lectin chaperones (calnexin and malectin) and sensor molecules (IRE1) associate with the translocon to correctly fold the incoming polypeptide or signal misfolded proteins.

Mechanismen der Proteintranslokation an der ER-Membran

The translocon complex situated on the ER membrane is the main gateway for the protein secretory pathway. It facilitates the transport of nascent peptides ...

Lehre

JoVE Core

Zellbiologie

Unit 1

Transmembrantransport im endoplasmatischen Retikulum und in Peroxisomen

SCHLÜSSELBEGRIFFE UND KONZEPTE

Cotranslational Protein Translocation

Translocation of proteins across membranes is an ancient process that occurs even in bacteria and archaebacteria. In fact, the components of the translocation machinery are still conserved between prokaryotes and eukaryotes.
Sec61 channel partners for cotranslational translocation
During cotranslational translocation, the Sec61 channel partners with the signal recognition particle (SRP), the signal recognition particle receptor (SR), and the ribosomes to transport the nascent polypeptide chain into the lumen.
SRP mediates ribosome attachment to the Sec61 complex via the polypeptide exit tunnel of the large ribosomal subunit. The GTPase domains on both SRP and SR carry out GTP hydrolysis, which supports the transfer of the target polypeptide to the Sec61 channel. Subsequently, the ribosomes act as primary translocation motors and push the protein towards the ER lumen. Except for the GTPs spent during peptide chain elongation, no additional energy is expended for the protein to descend through the channel.&#160;
Accessory translocon complex proteins involved in cotranslational translocation
The translocating chain-associating membrane (TRAM) protein and translocon-associated protein (TRAP) complex are auxiliary components associated with the Sec61 channel during SRP-mediated translocation. The TRAP complex is a substrate-specific complex essential for secure anchoring of the signal sequences having low hydrophobicity. Its proteins directly interact with Sec61 and keep the channel in open confirmation to compensate for the weak interaction with the signal sequence.
On the other hand, TRAM is a membrane protein that acts as a chaperone. It assists in folding and membrane integration of cotranslationally translocating proteins.

Co-translationale Insertion von Membranproteinen in vorgeformte Nanoscheiben

Zusammenfassung

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Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine durch Transmissionselektronenmikroskopie

Analyse der Endocytic Aufnahme und retrograder Transport mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen mit dem Trans-Golgi-Netzwerk

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Formulierung und Charakterisierung bioaktiver Wirkstoffe, die Nanoscheiben enthalten

Eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Rekonstitution eines ABC-Transporter in Nanodisc Lipid Particles

Dynamische lichtinduzierte Proteinmuster an Modellmembranen

Dynamische lichtinduzierte Proteinmuster an Modellmembranen

Dynamische lichtinduzierte Proteinmuster an Modellmembranen

Mechanismen der Proteintranslokation an der ER-Membran

Cotranslationale Translokation von Proteinen

Co-translationale Insertion von Membranproteinen in vorgeformte Nanoscheiben

Zusammenfassung

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Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Analyse der Endocytic Aufnahme und retrograder Transport mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen mit dem Trans-Golgi-Netzwerk

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Formulierung und Charakterisierung bioaktiver Wirkstoffe, die Nanoscheiben enthalten

Eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Rekonstitution eines ABC-Transporter in Nanodisc Lipid Particles

Dynamische lichtinduzierte Proteinmuster an Modellmembranen

Dynamische lichtinduzierte Proteinmuster an Modellmembranen

Dynamische lichtinduzierte Proteinmuster an Modellmembranen

Mechanismen der Proteintranslokation an der ER-Membran

Cotranslationale Translokation von Proteinen

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine durch Transmissionselektronenmikroskopie