Bu çalışma LSUHSC Vakfı (PLF) ve kısmen Louisiana Klinik ve Çeviri Bilim Merkezi'ni finanse eden Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden U54 GM104940 tarafından desteklendi.

Kuyruk damarı enjeksiyonları ve ısınma/kısıtlama cihazının kullanımını içeren tüm hayvan protokolleri yerel Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.
1. Hazırlık
<ol><li>Hayvanları en az 1 hafta boyunca barınma ortamına alıştırın ve yiyecek ve su reklam libitumuna izin verin. NOT: Bu enjeksiyon tekniğinin çoğu yeni kullanıcısı için, kuyruk damarları ciltte kolayca görülebildiğinden, beyaz veya açık renkli kürklü hayvan suşları tercih edilebilir. Farelerin koyu renkli suşları (örneğin, C57BL/6) veya sıçanlar (örneğin, Kahverengi Norveç) derin pigmentli kuyruklara sahiptir ve bu da damara karşı zayıf bir renk kontrastı ile sonuçlanır. Yeterlilik elde edilene kadar yeni kullanıcıların yeterli eğitim alması şiddetle tavsiye edilir.</li>
	<li>Kuyruk damarı enjeksiyonu için ajanlar<ol>
<li>Tüm test ajanlarını ve çözümlerini aseptik olarak hazırlayın. Organizmaları veya hücresel malzemeleri uygularken, pirojen içermeyen koşulları korumak için tüm işlem adımları sırasında önlem alın.</li>
		<li>Kuyruk damarı enjeksiyonu için araç olarak sadece normal salin (%0,9 w/v sodyum klorür) veya fosfat tamponlu salin (PBS) gibi dengeli tuz çözeltileri kullanın. DİkKAT: Potansiyel damar hasarı riski nedeniyle asla su, yağ veya viskoz çözeltiler kullanmayın. Kemirgenlerde kanın tamponlama etkisi ve hızlı kan akış hızları nedeniyle çok çeşitli pH (4.5–8.0) tolere edilebilir. Bununla birlikte, yüksek derecede asidik veya alkali çözeltiler enjeksiyon bölgesinde gereksiz doku hasarına neden olabilir ve kaçınılmalıdır.</li>
		<li>Enjeksiyon hacmini ve sıklığını minimumla sınırlayın. Hayvana stresi en aza indirmek için enjeksiyondan önce vücut sıcaklığında fareler ve sıçanlar için önerilen hacimleri (sırasıyla ≤200 μL ve≤500μL) kullanın 3 .</li>
		<li>Şırınga ve iğnenin her preparatının çözeltideki hava kabarcıklarından arındırılmış olduğundan emin olun; kabarcıklar varsa, emboli riskini önlemek için tamamen temizleyin. NOT: Tipik olarak, 27 G, 1/2 inç iğneli 1 mL şırıngalar çoğu kuyruk damarı enjeksiyonu için yeterlidir.</li>
		<li>En az tek kullanımlık veya özel önlük ve lateks veya nitril eldiven ile yerel IACUC'un gerektirdiği uygun kişisel koruyucu ekipmanı (KKD) kullanın. Kuyruk damarı enjeksiyonu yapılırken güvenlik gözlüklerinin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isınma ve kısıtlama cihazı<ol>
<li>Cihazın herhangi bir kusurdan arındırılmasını sağlamak için kullanmadan önce tüm bileşenleri dikkatlice inceleyin (Şekil 1).</li>
		<li>Isınma cihazı başlatma (Şekil 2A)<ol>
<li>Isınma ünitesini temiz düz bir tezgah üzerine yerleştirin ve cihazı açık tutun. Termostat güç göstergesi lambasının yeşil yandığından emin olun. Alanı kuru tutmak ve ısıyı korumak için yatak malzemelerini ısıtma odasının içine yerleştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kısıtlama cihazı kurulumu (Şekil 2B)<ol>
<li>Kısıtlama ünitesini ısıtma ünitesinin yanına yerleştirin ve hayvan için uygun koni boyutlarını belirleyin. Gerekirse, hayvan için yeterli kısıtlama sağlamak için esnek alüminyum koninin taban genişliklerini manuel olarak ayarlayın. Alternatif olarak, koniyi, farklı vücut boyutlarındaki fareleri veya sıçanları barındırmak için özel olarak monte edilmiş modellerle değiştirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kuyruk damarı enjeksiyonu
<ol><li>Aparat ayarlamaları<ol>
<li>İç sıcaklığı ayarlama<ol>
<li>Kontrol kadranını kullanarak termostatı istediğiniz sıcaklığa ayarlayın. Isıtıcı göstergesinin kırmızı yandığından ve ampulnün yandığından emin olun. Ampul yanarken (ısıtma) iç sıcaklık göstergesini dikkatlice izleyin. Termostat, hedef sıcaklık ulaştığında ampulü yaklaşık 10-15 dakika içinde otomatik olarak devre dışı bırakmaz. NOT: Ortam sıcaklığından daha yüksek bir sıcaklık ayarlamak ısıtıcıyı etkinleştirir. Genel olarak, standart vivaryum koşullarında önerilen muhafaza sıcaklığı 20 ila 26 ° C arasında değişirken, laboratuvar fareleri için nötr (yani rahat) sıcaklık 30 ila 32 ° C42arasında kabul edilir. Bu nedenle, ısınma odasının iç sıcaklığının termonötraliteden biraz daha yüksek, yaklaşık 32-36 ° C'de yükseltilmesi önerilir. Termostatı asla vücut sıcaklığının üzerine ayarlamayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kısıtlama platformunun konumlandırılması<ol>
<li>Yükseklik ayarlama düğmesini kullanarak koni yüksekliğini kullanıcı için en uygun seviyeye ayarlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Isıl işlem (Şekil 3A)<ol>
<li>Hedef sıcaklığa (32-36 °C) ulaştıktan sonra, hayvanları konut kafesinden ısınma odasına hafifçe aktarın. NOT: Vazodilasyona neden olmak ve kuyruk damarlarının görünürlüğünü artırmak için 5-10 dakika ısıl işlem yeterlidir. Bununla birlikte, hayvanlar prosedür süresince termoregüle odasında güvenle tutulabilir (tipik olarak hipertermi belirtisi olmadan 20-30 dk). Isınma odası güvenli bir şekilde 4-6 fare veya bir sıçan içerebilir.</li>
		<li>Hayvanı akut ısı stresi belirtileri için izleyin (örneğin, hızlı solunum, uyuşukluk, atlama kaçış davranışı). DİkKAT: Hipertermi belirtileri gösteren hayvanlar, yeniden kullanımdan önce normal aktiviteye devam edene kadar kafeslerine geri verilmeli ve izlenmelidir. Bunun nedeni iç sıcaklığın en uygun aralığı aşmasıysa, ısınma cihazının kapalı olduğundan emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Ekleme adımları<ol>
<li>Hayvanı kuyruğun tabanından kaldırın ve ısınma odasından çıkarın. Hayvanı kısıtlama ünitesinin koni açıklığı üzerine sokun. DİkKAT: Fareleri asla kuyruk ucundan kaldırmayın; bu ciddi yaralanmalara neden olabilir. Obez veya hamile fareler için alternatif yol tutuş yöntemleri kullanılmalıdır28.</li>
		<li>Hayvan koninin uzak kenarında forelegleriyle kavrarken, kuyruğu yavaşça geriye doğru çekin ve kuyruğu açık yarıktan geçirin. Hayvanın arka ucunu koninin tabanına, bir arka bacağı koniden çıkıntı yaparak sabitleyin, böylece yanal damar saat 12 pozisyonunda gösterilir. Her iki tarafta bir tane olmak üzere iki yanal damar olduğu için arka bacaktan biri çıkıntı yapılabilir (Şekil 3B).</li>
		<li>Kuyruğu orta ila üçte iki uzunluğunda başparmak ve işaret parmağı arasındaki baskın olmayan el ile kavrayın, kuyruk konumlandırmasını ve vazodilasyonunu korumak için yanal damara hafif bir gerginlik koyarak. NOT: Isıl işlemle genişlemiş damarların gelişmiş görünürlüğü, kullanıcının en iyi sonuçlar için hızlı bir şekilde bir enjeksiyon bölgesi belirlemesini sağlar (Şekil 4).</li>
		<li>Enjeksiyon bölgesinin derisini% 70 alkolle nemlendirilmiş bir gazlı bez süngeri veya ped ile silin. Kuyruğun tahrişini önlemek için mümkün olduğunca nazikçe ve hızlı bir şekilde temizleyin. NOT: Bu prosedür kurumsal IACUC'nin takdirine bağlı olarak atlanabilir.</li>
		<li>Şırıngayı baskın el ile tutun ve iğneyi kuyruğa paralel yerleştirin. İğneyi kan akışının yönüne doğru yerleştirin, 10-15° açıyla(Şekil 5A–B)eğimli olun ve 2–4 mm(Şekil5C-D)nüfuz ederek damarın lümenine daha da ilerleyin. Çözeltiyi yavaşça enjekte edin. NOT: Enjeksiyon başarılı olursa pistonda direnç hissedilmemeli ve sıvı damarda hareket ederken görülebilir. Enjeksiyon bölgesinin üzerinde direnç veya beyaz kabarcıklar olması durumunda, iğneyi çıkarın ve orijinal iğne yerleşiminin üzerindeki bir bölgeye ikinci bir enjeksiyon girişiminde bulunun. Sıvı ilk bölgeden geçeceğinden, ilk enjeksiyon bölgesinin altına enjekte etmeye çalışmayın. Bir lateral damar enjeksiyonu başarısız olursa, hayvanı karşı tarafa yeniden konumlandırın ve kontralatör damar üzerinde daha fazla girişimde bulunun. Maksimum deneme sayısı, damar boyunca enjeksiyon girişimine nereden başladığına ve kaçırılan girişimlerle oluşabilecek şişmeye bağlı olacaktır. Yanlış enjeksiyonlar ve ilişkili yaralanmalar için kurumsal IACUC düzenlemelerine danışın.</li>
		<li>İğneyi çıkarın ve enjekte edilen çözeltinin ve/veya kanın geri akışını önlemek için başparmakla sıkıca bastırın. Kanama durana kadar temiz bir gazlı bez/mendil veya doku ile nazik sıkıştırma uygulamaya devam edin (Şekil 6).</li>
		<li>Hayvanı kafesine geri koyun ve en az 5 dakika izleyin. Hayvanın daha fazla kanama olmadan normal aktiviteye devam etmesine emin olun.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Mantar kan dolaşımı enfeksiyonu ve sepsis bir murine modeli
<ol><li>Fare suşları<ol>
<li>Dişi swiss Webster, kurumsal olarak önerilen yönergeler başına 6 haftalıkken fareleri yetiştirdi. Alternatif olarak, değiştirilmiş inocula ile bu protokol için inbred/genetiği değiştirilmiş suşlar (örneğin, C57BL/6 arka plan) kullanın (bkz. NOT). NOT (bkz. Ayrıntı için tartışma): Koyu kürklü farelerin kuyruk damarları, derin pigmentli kuyruk nedeniyle genellikle daha hafif kürklü olanlara göre daha az görünür (Şekil 4). Farklı fare suşları arasında mantar sepsis / öldürücülüğüne karşı değişen duyarlılık vardır. Swiss Webster dışındaki fare suşlarının kullanımı, konak bağışıklık durumunu etkileyebilecek ilgili faktörleri (örneğin, genetik arka plan, yaş, cinsiyet, vücut büyüklüğü) göz önünde bulundurarak ek protokol optimizasyonu gerektirebilir. Örneğin, C57BL/ 6 farelerde ölümcül bir zorluk, İsviçre Webster farelerinde görülen ölüm seviyesine ulaşmak için tipik olarak daha yüksek inokula (10x'e kadar) gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroorganizma -lar<ol>
<li>Ölümcül bir meydan okuma (sepsis) için, Candida albicans'ın donmuş stokları DAY185'i (veya tercih ettikleri suşları) Sabouraud dekstroz agarına zorlar ve 2 gün boyunca 30 ° C'de kuluçkaya yatır.</li>
		<li>Tek bir koloniyi 10 mL maya özü-peptone-dekstroz suyuna ve kültürü sallanarak 30 ° C'de 18 saat boyunca sabit büyüme aşamasına aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculum çözümleri<ol>
<li>Ölümcül bir meydan okuma gününde, et suyu kültürünü toplayın ve peleti steril PBS'de santrifüjleme (800 × g)ile 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Canlı maya hücrelerini trypan mavi boya dışlama ile tanımlayın ve bir hemositometre kullanarak numaralandırır. Oda sıcaklığında steril PBS'de hücre konsantrasyonu 1 x10 6 hücre/mL olarak ayarlayın. NOT: Her hayvan 100 μL inoculum çözeltisi alacaktır. Enjeksiyon işlemi sırasında potansiyel kayba izin vermek için fazla miktarda inoculum (>500 μL) hazırlayın. Son inoculum fare başına 1 x 105 hücredir. Hücre konsantrasyonu buna göre ayarlanarak inokülum hacmi 200 μL'ye kadar arttırılabilir. DİkKAT: Mantar inoculum çözeltisi enjeksiyondan önce oda sıcaklığında tutulmalıdır. Inoculum çözeltisinin vücut sıcaklığına ısıtması maya hücrelerinden hyphae'ye morfolojik bir değişikliğe neden olabilir. Aksine, soğuk çözeltilerin bolus i.v yönetimi hayvanın vücut sıcaklığını hızla düşürebilir ve kaçınılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İntravenöz aşılama<ol>
<li>Hayvanları ısıtın ve bölüm 2'deki prosedürleri izleyerek vazodilasyona neden olan.</li>
		<li>27 G, 1/2 inç iğne ile 1 mL şırınga kullanarak kuyruk damarına 100 μL inoculum çözeltisi enjekte edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşı sonrası izleme<ol>
<li>Hayvanları aşağıdaki sepsis kaynaklı morbidite belirtileri için izleyin: i) kürk yönü (örneğin, pürüzsüz, fırfırlı), ii) aktivite (örneğin, serbestçe hareket eden, tepkisiz), iii) duruş (örneğin, kambur, sert), iv) davranış (örneğin, yavaş, yer değiştirme yok), v) göğüs hareketleri (örneğin, normal solunum, dispne), vi) göz kapakları (örneğin, açık, kapalı)43.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sepsis puanlama<ol>
<li>Sepsis için değiştirilmiş fare klinik değerlendirme puanına (M-CASS) göre gözlemlenen morbiditeyi her kategoride 0'dan 3'e dört puanlık bir derecelendirme ölçeğinde puanlamak: 0, normal; 1, hafif; 2, ılımlı; 3, şiddetli43.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İsteğe bağlı protokol: Mantar sepsisine karşı aşılama<ol>
<li>Ölümcül bir meydan okumadan on dört gün önce, C. albicans DAY185 yerine 3.2-3.4 bölümlerinde açıklandığı gibi, Candida dubliniensis suşu Wü284 veya Δefg1/Δcph1 mutant (fare başına 1x105 hücre) gibi zayıflatılmış C. albicans suşları ile fareleri aşılayın.</li>
		<li>3.2–3.4 bölümlerinde açıklandığı gibi aşılanmış farelerde ölümcül bir zorluk meydana gelir ve 3.5-3.6 bölümlerinde açıklanan sepsis kaynaklı morbidite belirtilerini izleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tutarlı ve doğru dosing, hayvan modellerinde deneysel güvenilirlik için temel gereksinimlerdir. Bu, enjekte edilen ajanların sistemik biyoyararlanımının diğer yönetim yollarına göre önemli ölçüde daha yüksek / daha hızlı olduğu i.v. yönetimi durumlarında özellikle önemlidir3. Bu nedenle, kuyruk damarı enjeksiyonundaki hatalar çalışma sonuçları üzerinde zararlı bir etkiye sahip olabilir. Tarihsel olarak, i.v. yerine intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu, teknik basitlik ve kolaylık nedeniyle kemirgenlerde sistemik erişim için en yaygın yöntem olmuştur. Bununla birlikte, hayvanlardan klinik ortamlara preklinik okumaları çevirirken yönetim yolları daha önemli hale gelir. Bu nedenle, başarılı kuyruk damarı enjeksiyonu kolaylaştırabilecek kemirgen protokollerinde sürekli iyileştirmeye ihtiyaç vardır.
Mevcut protokoldeki temel ilerleme, kemirgenlerde vazodilasyonun etkili bir şekilde indüksiyonunu sağlayan ve kuyruk damarlarının ve iğne hizalamasının görünürlüğünü önemli ölçüde artıran yenilikçi teergüle edilmiş ısıtma cihazıdır. Kötü şekilde terrigüle edilmiş ısıtma yöntemleri (örneğin, lambalar), topikal vazodilatörler veya cilt tahriş edicileri (örneğin, ksilenler) sadece güvenilmez değildir, aynı zamanda hayvan için de güvenli değildir ve kaçınılmalıdır44. Kuyruğu ılık suya batırmak gibi diğer geleneksel yöntemlerin aksine, bu cihazın otomatikgülasyon yeteneği aynı anda birden fazla hayvanı güvenli bir şekilde koşullayabilir. Ek olarak, bu protokol en uygun şekilde tasarlanmış kısıtlama cihazı kullanılarak ve hayvanın yanal kuyruk damarını en iyi şekilde görüntüleyen bir pozisyonda hızlı ve güvenli hareketsiz hale getirilmesine izin vererek daha da güçlendirilir.
Birçok mevcut kısıtlayıcıda görülen şeffaf tubal formatlar, pratik olarak iyi tasarlanmış olsa da, her hayvanla daha fazla kullanım süresi gerektirir, böylece kısıtlama işlemi45. Bu, sınırlı işbirliği sunan agresif özelliklere sahip kemirgen suşlarında daha sorunlu olabilir46,47. Buna karşılık, kısıtlama cihazının yarı kapalı koni yapısı, hayvanın hızlı bir şekilde konumlandırılmasına izin eder ve kısıtlama süresini en aza indirmeye yardımcı olur. Birlikte, yenilikçi, son derece optimize edilmiş ısıtma/kısıtlama sistemini kullanan kolaylaştırılmış protokol enjeksiyon prosedürünü hızlandırarak büyük hayvan gruplarının hızlı ve etkili bir şekilde dolanmasını sağlar. Laboratuvarımızda, genellikle bu protokolü kullanarak 1 saat içinde ısı tedavisinden enjeksiyon sonrası izlemeye kadar 30 farenin tüm enjeksiyon prosedürünü tamamlıyoruz.
Gelişmiş özelliklere rağmen, bu cihazın bazı belirgin dezavantajları vardır: birincisi cihazın maliyeti ve ısınma odasında rutin ampul değişimidir. Bununla birlikte, enjeksiyonların verimliliğine ve hızına ek olarak, cihaz tekrarlanan kullanım için dayanıklıdır ve en yaygın dezenfektanlarla uyumludur ve cihazın kullanımlar arasında kapsamlı bir şekilde temizlenmesine izin eder. Birlikte, bu ilk yatırımıdengeler. Second, sınırlı çalışma alanı olan durumlarda, bu protokole bir dezavantaj, enjeksiyonu gerçekleştirirken iki birimi yan yana yerleştirilecek kadar büyük bir tezgah alanı için gereklilik olabilir. Bununla birlikte, cihaz, i.v. enjeksiyonlarını içeren birkaç kemirgen protokolünde yaygın olarak kullanılabildiğinden, cihazın izofluran buharlaştırıcılar gibi diğer ortak vivarium ekipmanlarına benzer bir çekirdek cihaz olarak hizmet etmesi mümkündür. Ne olursa olsun, iki ünite kolayca taşınabilir ve kullanılmadığı halde paketlenebilir ve yerle bir edilebilir.
Bu protokolde açıklanan murine mantar sepsisinin i.v. ölümcül meydan okuma modeli, insanlarda C. albicans kan dolaşımı enfeksiyonlarını yakından taklit eder ve mantar virülansını incelemek, antifungal tedavilerin etkinliğini test etmek ve enfeksiyona konak immün yanıtları karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmıştır37,39,48. Tekrarlanabilir bir enfeksiyon elde etmek için, yani kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla aşılama, organizmaların kan dolaşımına doğru bir şekilde teslimini sağlamak için protokolün en hayati adımıdır. Aslında, hayvanlar Candida yani zorlukların değişen seviyelerine çok farklı yanıt verirler; çok düşük miktarlarda inoculum verilmesi istenmeyen spontan iyileşmelere neden olurken, çok yüksek doz alan hayvanlar erken yenik düşer. Belirli bir organizmanın tutarlı bir sepsis/mortalite seviyesine neden olmak için spesifik inoculum boyutları penceresi büyük ölçüde hem mantar suşlarına hem de fare suşlarına bağlıdır.
1 x 105 vahşi tip C. albicans inoculum'da İsviçre Webster farelerini kullanan mevcut protokol, 1 gün içinde sepsis morbiditesinin başlangıcını tekrar tekrar indükler, ardından 5-7 gün% 100 öldürücülükle sonuçlanan progresif mortalite. Buna karşılık, 1 x 105'ten yüksek inocula tipik olarak hızlandırılmış ölümlere yol açar (yani, 1 x 10'da 1-2 gün6, 5 x 105'te 3-4gün ) ve 1 x 105'ten düşük olanlar alt öldürücüdür. Literatürdeki çok sayıda rapor doğrultusunda, C. albicans yerine albicans olmayan Candida türlerinin kullanımı önemli ölçüde azalmış ölümcüllük ile sonuçlanır40,49. Ek olarak, fare suşlarının seçimi, hatta kolonilerin kökeni, diğerleri tarafından bildirildiği gibi, fare suşları arasındaki değişen duyarlılıklar nedeniyle enfeksiyon sonuçları üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir39,40,41,50,51,52,53,54,55. Bu nedenle, deneyler tasarlanırken her ikisi de dikkate alınmalıdır.
Ölümcül bir i.v. meydan okumasının ardından, mantar hücreleri kan dolaşımına hızla yayılır ve en çok etkilenen böbrekler41olan birden fazla organı istila etmeye başlar. Etkilenen diğer organlar beyin, dalak ve kemik iliği48,56. Ne olursa olsun, akut sepsis erken zaman noktalarında nihai ölüm nedenidir37. Temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, sepsis şiddeti, meydan okuyan hayvanlarda sepsis durumunun sergilenen belirtilerine dayanarak Sepsis için Fare Klinik Değerlendirme Puanı (M-CASS) ile nicel olarak değerlendirilebilir43,57. Ölümcül sepsisin çeşitli taşıyıcı belirteçleri arasında, hipotermi hem klinik hem de deneysel sepsis43,58,59'da yakın ölüm için kritik bir tahmin edici olarak önerilmiştir.
Bu modelde, bu modeldeki doğuştan gelen farelere karşı doğrudan karşılaştırmak için resmi bir çalışma yapılmamış olsa da, yetiştirilmiş İsviçre Webster fareleri kullanılarak mevcut protokolden elde edilen veriler, tahmin edilen genetik heterojenliğe rağmen, çeşitli sepsis parametrelerinde son derece tekrarlanabilir. Genel olarak, 3-5 gün içinde düşen bir mortalite modeli, sepsis morbiditesinde hızlı yükselme ve ölümcül meydan okumadan sonraki saatler içinde enflamatuar belirteçlerin seviyeleri ile kanıtlanan sağlam bir akut sepsis modelidir50,51. Daha uzun sağkalım süreleri (7-10 gün) için mortalite, muhtemelen hedef organlarda ve merkezi sinir sisteminde ölümcül doku hasarına yol açan mikrobiyal yükün sonucudur. Sepsis veya mikrobiyal yük seçimi, kullanılan inoculum tarafından belirlenen bağışıklık fonksiyonlarının veya antienflamatuar rejimlere veya antifungal tedavilere/aşılara verilen yanıtların değerlendirilmesi için gerektiği şekilde uygulanabilir.
İ.v. ölümcül meydan okuma modeline ek olarak, farelerde C. albicans ile bir i.p. meydan okuma yoluyla karın içi enfeksiyon da yaygın kandidiyazis ve sonraki sepsis yol açabilir, ancak bakteriyel patojen Staphylococcus aureus ile ortak aşılama, sinerjik olarak C. albicans mono-enfeksiyonu51,60,61ile karşılaştırıldığında mortaliteyi arttırır. I.p. ölümcül meydan okuma modelinde, polimikrobiyal peritonitlere ve organizmalarınkarın boşluğundan kan dolaşımına yayılmasına neden olmak için önemli ölçüde daha yüksek mikrobiyal inocula (fare başına1.75x 10 7C. albicans/8 x 10 7S. aureus) gereklidir. Benzer şekilde, bağışıklık sistemini baskılayıcı ve/veya mukozaya zarar veren ajanlarla tedavi edilen farelerde C. albicans ile gastrointestinal enfeksiyon mantar hücrelerinin kan dolaşımına geçişine yol açar ve mantar sepsis62,63ile sonuçlanır. Ayırt edici aşılama yollarına rağmen, mantar sepsisini verme mekanizması, organ yetmezliğine yol açan Candida'ya kontrolsüz sistemik proinflamatuar bir yanıt içeren üç hastalık modeli arasında büyük ölçüde benzerdir37,51,61. Benzer şekilde, insanlarda, sadece kandidiyemi değil, konakçı yanıtının bu sürecidir, sağlık hizmetleri ayarlarında edinilen hematojen olarak yayılan kandidiyazis ile ilişkili yüksek morbidite / mortaliteye neden olur64,65.
Mevcut mantar sepsis modelini kullanarak, burada ölümcül C. albicans enfeksiyonuna karşı korumanın, sepsis morbiditesinde önemli bir azalma ile birlikte C. dubliniensis (avirulent) veya zayıflatılmış C. albicans mutantları ile aşılanma / aşılama ile elde edilebileceğini gösteriyoruz. Koruma, kemik iliğinde eğitilmiş doğuştan gelen bağışıklık formu olarak indüklenmiş gibi görünen doğuştan gelen Gr-1+ miyeloid türevi baskılayıcı hücreler tarafından aracılık edilir66,67. C. albicans kan dolaşımı enfeksiyonlarına karşı doğuştan gelen bu bağışıklık aracılı koruma biçiminin anlaşılmasını genişletme çabaları devam etmektedir.
Sonuç olarak, yenilikçi kemirgen ısıtma / kısıtlama cihazı, büyük ölçekli çok gruplu hayvan çalışmalarının i.v. enjeksiyonlarını verimli ve etkili bir şekilde gerçekleştirme yeteneğimizi ilerletmemizde etkili olmuştur. Bu nedenle, cihaz için Mouse a Minute terimini icat ettik. Cihaz özellikleri, benzer bir cihazın satın alınması talebi üzerine ilgili yazardan temin edilebilir. Burada gösterilen teknikler, çok çeşitli araştırma alanlarında kuyruk damarı enjeksiyonları kullanan kemirgen modellerinde yararlı bir araç olarak hizmet edebilir.

Kemirgenleri içeren hayvan modellerinin kullanımı biyomedikal araştırmaların temelini oluşturuyor. Dünya çapındaki laboratuvarlarda çok sayıda inbred ve outbred suşunun yanı sıra genetiği değiştirilmiş çizgiler mevcuttur ve rutin olarak kullanılmaktadır. Kuyruk damarı enjeksiyonu, kemirgen modellerinde deneysel ajanların intravenöz (yani) yönetimini gerektiren temel yöntemlerden biridir. Genel olarak, i.v. enjeksiyonları, yerel dokuları ve sindirim sistemini atlayarak yüksek emiciliği oranları ve çok çeşitli konsantrasyonların veya fizyolojik olmayan pH1,2,3,4çözeltilerine yüksek tolerans gibi diğer uygulama yollarına göre büyük avantajlara sahiptir. Diğer canlı i.v. rotaları (örneğin, saphenous damarlar, retro-orbital venöz sinüs), kuyruk damarları kemirgenlerde en güvenli ve en kolay erişilebilir kan damarı olarak kabul edilir2,3,5,6. Bu nedenle, kuyruk damarı enjeksiyonu, enfeksiyöz hastalık modelleri 7 ,8,9,biyolojik malzemelerin nakli10,11,klinik öncesi terapötiklerin değerlendirilmesi12,13 ve toksikolojik analizler14,15dahil olmak üzere bir dizi kemirgen modelinde yaygın olarak almıştır.
Başarılı kuyruk damarı enjeksiyonlarında dosingin tutarlılığı ve doğruluğu kritik bir gerekliliktir. Şaşırtıcı bir şekilde, literatürde kuyruk damarı enjeksiyonlarının nicel ve nitel değerlendirilmesi sık sık yanlış enjeksiyonları madde16,17. Bir çalışma, eğitimli enjektörler tarafından gerçekleştirilen otuz enjeksiyondan on ikisinin, enjekte edilen dozların% 10'undan fazlasını kuyruk içinde bıraktığını bildirdi18. Ek olarak, kuyruk damarı enjeksiyonları alan hayvanın güvenliği ve konforu işlem sırasında birincil endişe kaynağı olmalıdır. Yanlış kısıtlama yaralanmalara ve numune kalitesinde önemli değişkenler getirebilecek strese bağlı bir dizi patolojiye (örneğin, kilo kaybı, bağışıklık tepkilerinde bozulma) yol açabilir19,20. Bu hatalar verilerde değişkenliğin artmasına ve tekrarlanabilirliğin zayıflığına neden olabilir, böylece çalışma sonuçlarını olumsuz yönde etkiler.
Hayvanda damar genişlemesinin indüksiyonu, farelerde 300 μm olduğu tahmin edilen damarın küçük çapı nedeniyle kuyruk damarı enjeksiyonları yapılırken genellikle gereklidir21. Vazodilasyon kuyruk damarlarının görünürlüğünü arttırır ve venöz lümen içinde optimum iğne damarı hizalamasının sağlanmasına yardımcı olur. Kuyruğu ılık suya batırmak22,ılık bir örtü, lamba veya saç kurutma makinesi23 , 24kullanarak kuyruğa ısı uygulamak veya hayvanı bu ısı kaynaklarından biriyle birlikte bir ısıtma yastığı, inkübatör veya kutu kullanarak sıcak bir ortama yerleştirmek gibi çeşitli yöntemler laboratuvarlar tarafından bildirilmiştir25. Cihazlar belirli amaçlar için kendi kendine yapılabilir veya ticari tedarikçilerden temin edilebilir. Bununla birlikte, birçoğu thermoregulatory yeteneklerinden yoksundur ve varsa, cihaz sıcaklığı zayıf bir şekilde korunur ve genellikle oda sıcaklığındaki değişikliklere maruz kalır. Benzer şekilde, anestezi kullanımı önerilmediği için kuyruk damarı enjeksiyonları için bir kısıtlama cihazının kullanılması gereklidir26,27. Laboratuvara özgü veya ticari kısıtlama cihazlarının çeşitli türleri geliştirilmiştir. Tipik olarak, hayvan tek kullanımlık 50 ml konik tüp4, oluklu pleksiglas duvarlara, bir tünele veya koni28'e yerleştirilir , bunların hepsi hayvanın hareketlerini kısıtlarken kuyruğun bol miktarda maruz kalmasına izin verir. Bununla birlikte, çoğu kısıtlayıcı, malzemelerin sertliği nedeniyle boyut sınırlamalarına sahiptir. Ayrıca, modern yüksek karmaşıklıklı cihazlar, pratik ve sofistike tasarımlara rağmen, büyük hayvan gruplarını içeren enjeksiyonlar için mümkün görünmüyor22.
Kan dolaşımı enfeksiyonu ve ilişkili sepsis fare modelleri, bu tekniğin kullanılmasını gerektiren durumların en önemli örneğidir. Şiddetli klinik sepsisin tüm mikrobiyal etiyolojisi arasında, mantar sepsis genellikle antifungal tedaviye rağmen% >40 ölüm oranları ile ölümcül bir durumdur29. Aslında, Candida albicans enfeksiyonu, hastane tarafından edinilen kan dolaşımı enfeksiyonunun dördüncü önde gelen nedeni olarak bildirilmiştir (kandidiyemi)30,31. Karın içi kandidiyaziste, gastrointestinal sistemdeki mikroorganizmalar kan dolaşımı yoluyla yayılabilir ve daha da büyük mortalite ile polimikrobiyal sepsise neden olabilir32,33,34. Nozokomi vakalarının çoğu kontamine merkezi hat kateterlerinden veya indwelling tıbbi cihazlardan ortaya çıktığı için35,36,yani kuyruk damarı enjeksiyonu ile C. albicans ile aşılama insan sepsis gelişimini yakından yansıtabilir ve hematojen olarak yayılan kandidiyazis37,38'infare modelinde temel bir yöntem olmuştur. Bu modelde, günler içinde ortaya çıkan mortalite, C. albicans yani inoculum39,40,41ayarlanarak uzatılabilir veya kısaltılabilir.
Son zamanlarda laboratuvarımız, ayarlanabilir bir kısıtlama ünitesi ile eşleştirilmiş, uygun bir sistemde, temoregüle edilmiş bir ısıtma ünitesi ile donatılmış yenilikçi bir cihaz kullanarak en uygun şekilde kolaylaştırılmış kuyruk damarı enjeksiyonu için yenilikçi bir protokol geliştirmiştir. Bu protokol, araştırmacıların kuyruk damarı enjeksiyonlarını doğru ve zamanında yapmalarına izin verirken, hayvanlar prosedür için en az sıkıntıyla güvenli bir şekilde koşullandırılabilir ve kısıtlanabilir. Burada gösterilen teknikler, gelişmiş ısıtma ve kısıtlama cihazının kullanımıyla, kemirgen modellerini kullanan çeşitli araştırma alanlarında yararlı bir araç olarak hizmet edebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Candida albicans strain DAY185</td>
			<td>Carnegie Melon University</td>
			<td>N/A</td>
			<td>provided by the laboratory of Aaron Mitchell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans strain efg1&#916;/&#916; cph1&#916;/&#916;</td>
			<td>University of Tennessee Health Sciences Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>provided by the laboratory of Glen Palmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida dubliniensis strain W&#252;284</td>
			<td>Trinity College, Dublin, Ireland</td>
			<td>N/A</td>
			<td>provided by the laboratory of Gary Moran</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>551NCICr:SW</td>
			<td>Female Swiss Webster; 6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>556NCIC57BL/6</td>
			<td>Female C57BL/6; 6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, 27G, &#189;-in</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent warming and restraining device (Mouse a Minute)</td>
			<td>LSU Health</td>
			<td>custom order</td>
			<td>Mouse a Minute is available for custom ordering from LSU Health</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud dextrose agar (SDA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211584</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 1 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast peptone dextrose (YPD) broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2469</td>
			<td>can be substituted from other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model

Kemirgen modellerinde kuyruk damarı enjeksiyonları deneysel ajanların intravenöz yönetimi için önemli yöntemlerdir. Kuyruk damarı enjeksiyonları tipik olarak vazodilasyonu teşvik etmek için hayvanın ısınmasını içerir, bu da hem kan damarlarının tanımlanmasına hem de iğnenin damar lümenine yerleştirilmesine yardımcı olur ve hayvanı güvenli bir şekilde dizginler. Kuyruk damarı enjeksiyonları birçok protokolde yaygın prosedürler olmasına ve doğru yapılması durumunda son derece teknik olarak kabul edilmesine rağmen, doğru ve tutarlı enjeksiyonlar tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek ve değişkenliği en aza indirmek için çok önemlidir. Kuyruk damarı enjeksiyonlarından önce vazodilasyonu teşvik etmek için geleneksel yöntemler genellikle ısı lambası, elektrik/şarj edilebilir ısı pedleri veya 37 °C'de önceden ısıtılmış su gibi bir ısı kaynağının kullanılmasına bağlıdır. Standart bir laboratuvar ortamında kolayca erişilebilen bu araçlar açıkça zayıf/sınırlı termo-düzenleyici kapasiteden muzdariptir. Benzer şekilde, çeşitli kısıtlama cihazları ticari olarak mevcut olmasına rağmen, hayvanlara travmayı önlemek için dikkatlice kullanılmalıdır. Mevcut yöntemlerin bu sınırlamaları deneylerde gereksiz değişkenler yaratır veya deneyler ve/veya laboratuvarlar arasında değişen sonuçlarla sonuçlanır.
Bu yazıda, bağımsız, termal olarak düzenlenmiş, ısıtma cihazını ayarlanabilir bir sınırlama ünitesiyle verimli bir şekilde kolaylaştırılmış kuyruk damarı enjeksiyonu için tek bir sistemde birleştiren yenilikçi bir cihaz kullanarak geliştirilmiş bir protokol gösteriyoruz. Kullandığımız örnek, sepsis ile sonuçlanan mantar kan dolaşımı enfeksiyonunun intravenöz bir modelidir. Isınma aparatı, iç sıcaklığı önceden ayarlanmış bir eşikte tutmak için ayarlanabilir otomatik termostat ile monte edilmiş ısı yansıtıcı akrilik bir kutudan oluşur. Aynı şekilde, koni sınırlama cihazının genişliği ve yüksekliği, çeşitli kemirgen boyutlarını güvenli bir şekilde barındıracak şekilde ayarlanabilir. Cihazın gelişmiş ve çok yönlü özellikleri ile burada gösterilen teknik, kuyruk damarı enjeksiyonları kullanan kemirgen modellerini içeren bir dizi araştırma alanında yararlı bir araç haline gelebilir.

Isınma odasının içindeki sıcaklık, iç sensör tarafından sürekli olarak algılanır ve termostat tarafından otomatik olarak düzenlenir. İlk olarak, termostatın kontrol kadranı ayarlanan sıcaklıkları seçmek için 78, 85, 90 veya 95 °F (26, 29, 32 veya 95 °C) olarak konumlandırılmıştır. Isıtıcı etkinleştirildikten sonra(Şekil 7, sarı noktalar), ampul tarafından ısı emisyonu, ayarlanan sıcaklığa bağlı olarak ilk 5-15 dakika boyunca iç sıcaklığı hızla yükseltti. Isıtıcı, tespit edilen iç sıcaklığın ayarlanan sıcaklığı (gri noktalar) aşması durumunda ampulü devre dışı bırakmıştır. İlk pik sıcaklıklar, hayvan transferi sırasında sıcaklık kaybını dengelemek için tüm gruplarda belirlenen sıcaklıkların 5-7 ° C üzerine çıkmalıdır. Daha sonra, cihaz ısı döngüsünü otomatik olarak tekrarlamaya devam eder ve ısınma odasını ayarlanan sıcaklıkta tutar.
Mevcut protokol kullanılarak başarılı kuyruk damarı enjeksiyonları ile elde edilen deneysel verilere bir örnek Şekil 8'de gösterilmiştir. Sepsis ile sonuçlanan bir kan dolaşımı kan dolaşımı kandidiyazis fare modelinde, İsviçre Webster farelerinde Candida albicans (fare başına 1 x10 5 hücre) ile yapılan bir i.v. meydan okuması, sepsisin hızlı bir şekilde başlamasına ve organizmaların yayılmasına neden oldu ve 3-4 gün içinde yüksek mortaliteye yol açtı (açık noktalar) (Şekil 8A). Buna karşılık, hayvanlar önceki i.v. ön bağışıklama / aşı ile avirulent maya suşu, Candida dubliniensis, virülan C. albicans (katı noktalar) ile ölümcül i.v. meydan okumasından sonra% >95 hayatta kalma elde ederek sepsisten korunabilir. Progresif mortalite ve aşı aracılı koruma ile ilgili bu sonuçlar dört bağımsız deneyde tekrarlanabilir olarak elde edilmiştir(Ek Şekil 1). Benzer koruma, zayıflatılmış C. albicans mutantları (Δefg1/Δcph1) (veriler gösterilmez) gibi diğer avirulent maya suşları kullanılarak elde edilebilir. Sepsis de izlenebilir ve mortalite ile ilişkili olabilir; ölümcül enfeksiyona sahip aşılanmamış hayvanlar sepsis kaynaklı morbiditede önemli bir artış gösterirken, aşılanan grup ölümcül meydan okumanın ardından minimum semptomlar gösterdi (Şekil 8B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig01.jpg"> Şekil 1: Kemirgen ısıtma ve kısıtlama cihazının açıklaması. (A) aşağıdakilerden oluşan ısıtma cihazının dış görünümünü gösterir:
<ol><li>Termostat kapağı – termostatı açığa çıkarmak için tutamak tarafından yukarı doğru kaldırın</li>
	<li>Elektrik muhafazası – koruma için kalıcı olarak kapatılmış</li>
	<li>Oda kapağı – hayvan transferi sırasında yukarı doğru kaldırın/buradan</li>
	<li>Isınma odası – çıkarılabilir, kullanmadan önce zemini yataklarla kaplayın</li>
	<li>Kısıtlama aparatı – kullanılmazken ısıtma cihazıyla birlikte yerleştirilebilir</li>
	<li>Güç anahtarı – ana açma/kapama işlevleri için satır içi rocker anahtarı</li>
	<li>Güç kablosu – gerilim/akım: 120V/10A</li>
</ol>(B) ısıtma cihazının içini gösterir:
<ol><li>Akkor ampul – 100 Watt'ta ışık çıkışı</li>
	<li>Ampul koruyucu kalkan – ampul değişimi için çıkarılabilir</li>
	<li>Sıcaklık sensörü probu – odanın içinde bulunur</li>
	<li>İç sıcaklık termometresi - sıcaklığı izlemek için haznenin içine yerleştirin</li>
</ol>(C) ısıtma cihazı termostatının bileşenlerini gösterir:
<ol><li>İç sıcaklık termometresi</li>
	<li>Termostat – ısıtıcıyı otomatik olarak düzenler</li>
	<li>Setpoint kontrol kolu – minimum/maksimum: 78 °F/108 °F (25 °C/42 °C)</li>
	<li>Termostat güç göstergesi – yeşil ışık normal çalışma gösterir</li>
	<li>Termostat ısıtıcı göstergesi – ısıtma döngüsü sırasında kırmızı yanar</li>
</ol>(D) sınırlama cihazının bileşenlerini gösterir:
<ol><li>Koni – kemirgen kısıtlaması için tasarlanmış esnek alüminyum levha</li>
	<li>Kuyruk kanalı – kuyruğun düzgün konumlandırılmasına izin vermek için şekillendirildi</li>
	<li>Koni kaldırma platformu - koni tabanının sağlam bir şekilde kaldırılmasını sağlar</li>
	<li>Yükseklik ayarlama düğmesi – manuel yükseklik ayarı için tasarlanmıştır</li>
	<li>Makas jakı – yükseklik aralığı 45–140 mm (1,77-5,52")</li>
	<li>Destek plakası – stabilite sağlamak için kauçuk ayaklarla monte edilmiş <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig02.jpg"> Şekil 2: Kemirgen ısıtma ve kısıtlama cihazı. (A) Kullanmadan önce, cihazın iki parçası temiz bir tezgah üstüne yan yana yerleştirilir. (B) Isınma cihazı açıldıktan sonra, termostat ısıtıcıyı etkinleştirir. Ampul yanmaya devam eder ve ısınma odası ayarlanan sıcaklığa ulaşana kadar ısı yayar. Isınma cihazı, iç sıcaklığı korumak için ısı döngüsünü otomatik olarak tekrarlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig03.jpg"> Şekil 3: Isınma ve kısıtlama cihazına yerleştirilen fareler (C57BL/6). (A) Vazodilasyon için ısıl işlem gören fareler. Hayvanlar (tedavi başına 4-6 fare) barınma kafeslerinden cihazın ısınma odasına aktarılır ve en az 5-10 dakika ısıl işlemden geçirilir. Fare, ısınma odasından, kuyruğu açık yarıktan geçen sınırlama cihazının koni açıkına aktarılır. Fare, kuyruğun tabanı koninin ucuna ulaşana kadar koninin uzak kenarına hafifçe geri çekilir. Hayvan hafif bir yanal dönüşle koninin tabanına doğru çekilirken, bir arka bacak yukarı doğru konumlandırılmıştır, böylece açık yarıktan çıkıntı yaparak yanal kuyruk damarının saat 12'de konumlandırılmasını sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig04.jpg"> Şekil 4: Farelerde lateral kuyruk damarlarının tanımlanması. (A) Tedavi edilmemiş bir İsviçre Webster faresinin kuyruğu. Fare, vazodilasyon için önceden ısıl işlem yapılmadan kısıtlama cihazına yerleştirilir. Yanal kuyruk damarı, cildin altından geçen ince koyu bir damar olarak tanımlanabilir. (B) 10 dakika boyunca ısıtma cihazı ile tedavi edilen İsviçreli bir Webster faresinin kuyruğu. Isıl işlem görmüş fare kuyruk damarı enjeksiyonu için kısıtlanmıştır. Lateral kuyruk damarı, vazodilasyonun neden olduğu genişlemiş damar çapı nedeniyle ciltten kolayca görülebilir. (C) Bir C57BL / 6 farenin kuyruğu 10 dakika boyunca ısıtma cihazı ile tedavi edilir ve kuyruk damarı enjeksiyonu için kısıtlanır. Vazodilasyon, damara karşı zayıf bir renk kontrastı nedeniyle damar açık renkli İsviçre Webster farelerindeki kadar kolay görünmese de, derin pigmentli ciltten kuyruk damarının görünürlüğünü arttırır. Kırmızı oklar yanal kuyruk damarının yerini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig05.jpg"> Şekil 5: Isıl işlem görmüş farelerde (Swiss Webster) yapılan kuyruk damarı enjeksiyonu. (A–B) Enjeksiyon yerindeki lateral kuyruk damarına iğne yerleştirilmesi. İğne (27 G, 1/2-in) kuyruk damarına paralel olarak eğim yukarı doğru konumlandırılmış ve kan akışına doğru yönlendirilmiş ve yerleştirilmiştir. (C–D) Kuyruk damarında iğne yerleşimi ve enjeksiyon. İğnenin ucu damarın lümenine 2-4 mm daha ilerlemiş. Başparmak şırınnanın pistonu üzerine yerleştirilmiştir ve istenen hacim yavaş ve sabit basınçla dağıtılmıştır. Oval daireler enjeksiyon bölgelerini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig06.jpg"> Şekil 6: Enjeksiyon sonrası prosedür. (A) Enjeksiyon bölgesinde kanama bölgesi. Enjekte edilen çözeltinin kanaması ve geri akışı iğne çıkarıldıktan hemen sonra meydana gelir. Bu, başparmakla enjeksiyon bölgesine sıkı sıkıştırma uygulanarak en aza indirilebilir. (B) Enjeksiyon yerinde kan pıhtısı oluşumu. Temiz bir gazlı bez/silme ile nazik sıkıştırma, enjeksiyon yarası üzerinde kanın pıhtılaşmasını kolaylaştırır. Oklar ekleme alanlarını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig07.jpg"> Şekil 7: Kullanım sırasında ısınma odasının iç sıcaklığı. Isınma cihazı belirlenen sıcaklıklarda ısınmak için etkinleştirildi. Cihazın ısınma odası iç hava sıcaklığı için izlendi ve ısı döngüleri (ampul açık / sarı noktalar, kapalı / gri noktalar) 45 dakika boyunca kaydedildi. Turuncu alan, kemirgenlerde vazodilasyonun indüksiyonu için en uygun sıcaklık aralığını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61961/61961fig08.jpg"> Şekil 8: Sepsis mortalitesi, Candida albicansile ölümcül bir meydan okumanın ardından aşı aracılı korumaya karşı . Fareler (8 haftalık İsviçre Webster dişileri) 14 gün sonra avirulent live Candida dubliniensis Wü284(Cd)ile intravenöz olarak aşılandı ve ardından vahşi tip C. albicans DAY 185 (fare başına 1 x 105 hücre) ile ölümcül bir intravenöz meydan okuma yapıldı. (A)Mortalite, ölümcül meydan okumadan sonraki 10 gün boyunca değerlendirildi. (B) Hayvanlar sepsis morbiditesi açısından izlendi ve Sepsis için değiştirilmiş Fare Klinik Değerlendirme Puanına göre puanlandı (M-CASS)43. Veriler, grup başına 10 fare ile yapılan 4 bağımsız deneyden kümülatiftir ve Mantel-Cox log-rank testi kullanılarak analiz edilir. s < 0.0001. SEM, ortalamanın standart hatası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61961/61961fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Kan dolaşımı Candida albicans mücadelesinden sepsis mortalitesinin tekrarlanabilirliği ve aşı aracılı sağkalım. Her panel, Şekil 8A'dagösterilen kümülatif bir sonuca dahil edilen dört bağımsız denemeden elde edilen verileri temsil eder. Her deney grup başına 10 fare kullanılarak yapıldı ve Mantel-Cox log-rank testi kullanılarak analiz edildi. Ca, Candida albicans. Cd, Candida Dubliniensis. s < 0.0001. s < 0.01. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61961/supfig01.jpg" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model at JoVE.com

A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model

Burada, benzersiz bir şekilde tasarlanmış bir ısıtma / kısıtlama cihazı kullanarak kemirgen kuyruk damarı enjeksiyonları için etkili ve verimli bir yöntem sunuyoruz. Vazodilasyon ve kısıtlama süreçlerinin başlatılmasını kolaylaştırarak, bu protokol, en az sıkıntıya sahip büyük hayvan gruplarının doğru ve zamanında intravenöz enjeksiyonlarına izin verir.

Murine Mantar Sepsis Modelinde Verimli Kuyruk Damarı Enjeksiyonları için Çağdaş Isınma/Kısıtlama Cihazı

In rodent models, tail vein injections are important methods for intravenous administration of experimental agents. Tail vein injections typically involve ...

a-contemporary-warmingrestraining-device-for-efficient-tail-vein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K Görüntüleme.  Louisiana State University Health-School of Dentistry. Burada, benzersiz bir şekilde tasarlanmış bir ısıtma / kısıtlama cihazı kullanarak kemirgen kuyruk damarı enjeksiyonları için etkili ve verimli bir yöntem sunuyoruz. Vazodilasyon ve kısıtlama süreçlerinin başlatılmasını kolaylaştırarak, bu protokol, en az sıkıntıya sahip büyük hayvan gruplarının doğru ve zamanında intravenöz enjeksiyonlarına izin verir.

Video: A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model

Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for establishing new therapeutic approaches in this field. Therefore, animal models are required that are able to closely mimic the human disease and also sufficiently deal with scientific questions. The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. In this model, a small stent is surgically inserted into the ascending colon of mice or rats leading to a continuous leakage of intestinal bacteria into the peritoneal cavity. The procedure results in peritonitis, systemic bacteraemia, organ infection by gut bacteria, and systemic but also local release of several pro- and anti-inflammatory cytokines. The lethality of CASP can be controlled by the diameter of the inserted stent. A variant of this model, the so-called CASP with intervention (CASPI), raises opportunity to remove the septic focus by a second operation according to common procedures in clinical practice. CASP is an easily learnable and highly reproducible model that closely mimics the clinical course of abdominal sepsis. It leads way to study on questions in several scientific fields e.g. immunology, infectiology, or surgery.

Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. This article describes the surgical procedure of CASP. The CASP model and its variants allow the systematic investigation of various problems concerning the subject of sepsis.

Kolon Peritonit Stent Ascendens (CASP) - polimikrobik Abdominal Sepsis için bir Standart Model

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

Çekal ligasyon ve Farelerde Autophagy incelemek için bir model olarak Sepsis Patamaya kaynaklı

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

B Grubu bir murin modelinde<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vajinal Kolonizasyon

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

Inferior Vena kava stenozu: Derin Ven Trombozu fare modeli

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death through pulmonary embolism or results in the post-thrombotic syndrome, characterized by chronic leg pain, swelling, and ulceration, or in chronic pulmonary hypertension resulting in significant chronic respiratory compromise. This is the most common cardiovascular disease after myocardial infarction and ischemic stroke and is a clinical challenge for all medical disciplines, as it can complicate the course of other disorders such as cancer, systemic disease, surgery, and major trauma.
Experimental models are necessary to study these mechanisms. The stasis model induces consistent thrombus size and a quantifiable amount of thrombus. However, it is necessary to systematically ligate side branches of the inferior vena cava to avoid variability in thrombus sizes and any erroneous data interpretation. We have developed a non-invasive technique to measure thrombus size using ultrasonography. Using this technique, we can assess thrombus development and resolution over time in the same animal. This approach limits the number of mice required for quantification of venous thrombosis consistent with the principle of replacement, reduction, and refinement of animals in research. We have demonstrated that thrombus weight and histological analysis of thrombus size correlate with measurement obtained with ultrasonography. Therefore, the current study describes how to induce deep vein thrombosis in mice using the inferior vena cava stasis model and how to monitor it using high frequency ultrasound.

The present protocol describes the steps to obtain venous thrombosis using a stasis model. In addition, we are using a non-invasive method to measure thrombus formation and resolution over time.

Derin Ven Trombozu Staz farelerde yüksek frekans Ultrasonografi tarafından izlenen tarafından indüklenen

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various pathologies such as cancer, atherosclerosis and diabetes. We have previously shown that dysfunction of the Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2)/ Kelch-like erythroid cell-derived protein 1 (Keap1) signaling pathway leads to extreme ROS imbalance during cutaneous wound healing in diabetes. Since ROS levels are an important indicator of progression of wound healing, specific and accurate quantification techniques are valuable. Several in vitro assays to measure ROS in cells and tissues have been described; however, they only provide a single cumulative measurement per sample. More recently, the development of protein-based indicators and imaging modalities have allowed for unique spatiotemporal analyses. L-012 (C13H8ClN4NaO2) is a luminol derivative that can be used for both in vivo and in vitro chemiluminescent detection of ROS generated by NAPDH oxidase. L-012 emits a stronger signal than other fluorescent probes and has been shown to be both sensitive and reliable for detecting ROS. The time lapse applicability of L-012-facilitated imaging provides valuable information about inflammatory processes while reducing the need for sacrifice and overall reducing the number of study animals. Here, we describe a protocol utilizing L-012-facilitated in vivo imaging to quantify oxidative stress in a model of excisional wound healing using diabetic mice with locally dysfunctional Nrf2/Keap1.

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

We describe a non-invasive in vivo imaging protocol that is streamlined and cost-effective, utilizing L-012, a chemiluminescent luminol-analog, to visualize and quantify reactive oxygen species (ROS) generated in a mouse excisional wound model.

Vivo Reaktif oksijen türleri içinde bir fare görüntüleme modeli yara

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

Yenidoğan Polymicrobial Sepsis için kontrollü fare modeli

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a protocol for studying the pathogenesis of E. coli O1:K1:H7, a serotype responsible for high mortality rates in neonates. Our method utilizes intravital imaging of neonatal pups at different time points during the progression of infection. This imaging, paralleled by measurement of bacteria in the blood, inflammatory profiling, and tissue histopathology, signifies a rigorous approach to understanding infection dynamics during sepsis. In the current report, we model two infectious inoculums for comparison of bacterial burdens and severity of disease. We find that subscapular infection leads to disseminated infection by 10 h post-infection. By 24 h, infection of luminescent E. coli was abundant in the blood, lungs, and other peripheral tissues. Expression of inflammatory cytokines in the lungs is significant at 24 h, and this is followed by cellular infiltration and evidence of tissue damage that increases with infectious dose. Intravital imaging does have some limitations. This includes a luminescent signal threshold and some complications that can arise with neonates during anesthesia. Despite some limitations, we find that our infection model offers an insight for understanding longitudinal infection dynamics during neonatal murine sepsis, that has not been thoroughly examined to date. We expect this model can also be adapted to study other critical bacterial infections during early life.

Infection of neonatal mice with bioluminescent E. coli O1:K1:H7 results in a septic infection with significant pulmonary inflammation and lung pathology. Here, we describe procedures to model and further study neonatal sepsis using longitudinal intravital imaging in parallel with enumeration of systemic bacterial burdens, inflammatory profiling, and lung histopathology.

Gram-Negatif Bakteriyel Sepsisin Yenidoğan Görüntüleme Modeli

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...